魔芋葡甘聚糖對冷凍小麥面團面筋蛋白結構和功能特性的影響

郭金英，賀億杰，韓四海，任國艷，吳 影，羅登林，劉建學,2

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 471023；3.食品加工與發全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽 471023）

冷凍面團技術主要指在面制食品生產過程中，運用冷凍冷藏原理和方法處理半成品或成品，待需用時經解凍處理，繼而加工成為成品[1]。對于普通的面制食品，小麥面筋蛋白通過賦予面團吸水能力、內聚力和黏彈性，在面團強度、延展性和氣體滯留性方面起著決定性作用，其質量也直接決定了面團的最終食用品質[2]。而在冷凍過程中，冰重結晶和二硫鍵（S—S）斷裂誘發面筋蛋白高分子質量亞基解聚，破壞面筋蛋白骨架結構，對面筋蛋白造成機械性能損失。可使用親水膠體、乳化劑和其他面團改良劑減輕冷凍對面筋蛋白的影響。親水膠體良好的親水持水特性減少了游離態水，提高了冷凍食品體系的凍融穩定性，膠體能夠控制面團中冰結晶的生長速率和冰結晶的大小，抑制面筋網絡結構的破壞[3]。親水膠體中因其某些基團能夠與面團中淀粉及蛋白質作用，改變面團中淀粉和蛋白質特性，范鵬輝[4]在冷凍面團配方中添加黃原膠增加面團的筋力、吸水率和持氣性，從而改善冷凍對面筋蛋白的機械損傷。膠體能夠與面筋蛋白相互作用，形成膠體-面筋蛋白復合物，增大面筋蛋白鏈的長度，強化面筋網絡，提高面筋結構穩定性，如黃原膠[5]和卡拉膠[6-7]；也有膠體自身形成網絡，加固面團的面筋蛋白網絡結構，如魔芋膠能夠形成糖網絡[8]。

魔芋屬于天南星科魔芋屬植物，含有豐富的魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM），KGM是由葡萄糖和甘露糖以β-(1,4)糖苷鍵連接的高分子雜多糖，是眾所周知的可溶性水膠體[9]。同時，它也是一種優良的膳食纖維，具有清潔腸道、提高糖耐量、預防肥胖和改善膽固醇代謝等功能[10]，具有高保水性、膨脹性、增稠性、膠凝性、乳化性、懸浮性和黏結性，其性能優于普通食品凝膠，如瓊脂、角叉菜膠和明膠等，因而越來越多地被用作食品添加劑[11-13]。當KGM添加到面團中時，可以顯著增加面團的吸水性和發酵時間，同時通過增強面筋網絡影響面團的硬度和彈性，在低蛋白小麥面粉中產生更緊湊和連續的微觀結構[14]。在冷凍食品中，KGM已被用于冷凍餃子中以防止霜凍開裂并延長冷凍餃子的保質期[8]。同時，KGM還用于改善冷凍面團的流變性、微觀結構和冷凍穩定性[15]。

當前，對KGM研究主要集中在新鮮面團中作為復合添加劑方面，而關于KGM單獨作為添加劑應用于冷凍面團的研究較少，對冷凍面團面筋蛋白的結構和功能特性影響研究則更少。因此本實驗從小麥面粉中分離得到面筋蛋白質，研究添加KGM對面筋蛋白結構和功能性質以及微觀物理結構的影響，為KGM在冷凍面團中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋精粉（純度95.10%） 成都路特食品有限公司；面粉（蛋白質質量分數11.63%，含水率13.70%） 河南省駐馬店市一加一天然面粉有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris (hydroxymethyl) methyl aminomethane，Tris）美國Sigma公司；甘氨酸 上海藍季科技發展有限公司；溴酚藍、考馬斯亮藍R-250 天津市旭泰化學試劑有限公司；四甲基乙二胺 國藥集團化學試劑有限公司；蛋白質標準品 寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

HM740型和面機 青島漢尚電器有限公司；RE-52A旋轉蒸發儀 鞏義市瑞德儀器設備有限公司；DSC-1型差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；NMI20-015V-1核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；UV-4800型紫外-可見分光光度計 尤尼科科學儀器有限公司；VERTEX70型紅外光譜儀 德國布魯克光譜儀器公司；LGJ-10D冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；TM3000日立臺式電鏡 日立高新技術公司；DHR2流變儀 美國TA儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參考Graberger等[16]面粉脫脂的方法，略有改進。面粉和三氯甲烷室溫下按照1∶2（g/mL）的比例混合，攪拌5 min進行脫脂、抽濾，再重復2 次，時間分別為1 h和1.5 h。脫脂面粉于室溫通風櫥中晾干，直至聞不到氯仿氣味后過200 目篩。取400 g脫脂面粉，加入250 mL 0.4 mol/L的NaCl溶液，在攪面機里混合5 min，靜置20 min促使面筋形成，用NaCl溶液反復手洗面團直至將淀粉完全除去，得到濕面筋。將上述濕面筋樣品用蒸餾水洗滌除去殘留的NaCl溶液，冷凍干燥后粉碎，過200 目篩，即得面筋蛋白粉[17]。

將2 g凍干面筋蛋白粉末分散在含有質量分數為1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的100 mL磷酸鹽緩沖液中。稱取面粉質量取代度為0%、0.5%、1.5%、2.5%、3.5%和4.5%的KGM溶于水并定容至100 mL。分別取10 mL KGM溶液和10 mL蛋白溶液配制成相應濃度的KGM-面筋蛋白，置于-70 ℃超低溫冰箱中待中心溫度降至-18 ℃，放置-18 ℃的冰箱中貯藏24 h，然后在4 ℃環境下解凍，解凍后的樣品放在磁力攪拌器中，35 ℃攪拌2 h，以模擬其在面團制備中的反應。分為兩部分：一部分用于液體樣品實驗測定；另一部分冷凍干燥并粉碎用于固體樣品實驗測定。

1.3.2 面筋蛋白持水性測定

在離心管中加入50 mg面筋蛋白，加入4 mL蒸餾水，旋渦混勻2 min，靜置60 min，4 500 r/min離心10 min，除去上清液，稱量面筋蛋白與離心管的總質量。同一樣品重復測定3 次，計算加入不同水平的KGM后面筋蛋白持水性，如式（1）所示：

式中：M1為離心管質量；M2為面筋蛋白粉質量；M3為面筋蛋白與離心管的總質量。

1.3.3 面筋蛋白分子質量測定

根據Sotelo等[18]的方法稍作改進，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。使用5%濃縮凝膠和10%分離凝膠分析。將40 μL蛋白質溶液置于1.5 mL離心管中，加入40 μL上樣緩沖液（含有20 mg/mL SDS，體積分數10%甘油的Tris-HCl，0.125 mol/L，pH 6.8）和質量分數0.01%的溴酚藍）。樣品沸水浴5 min，上樣量為15 μL，在恒定電流100 A下直至藍色染料遷移至凝膠末端附近，除去凝膠，進行染色、脫色直至凝膠背景清晰用于拍照。

1.3.4 面筋蛋白流變性測定

將解凍后不同水平的KGM-面筋蛋白樣品分別放置在流變儀底板上，上板選用40 mm平板，平板之間間距設置為1 000 μm，在4 ℃進行動態頻率掃描，應變設置為3%，掃描頻率為1～10 Hz。

1.3.5 面筋蛋白熱性質測定

根據Alberto等[19]DSC方法進行測定。準確稱取2～3 mg冷凍干燥的面筋蛋白并密封在DSC的小鋁鍋中，然后在25～90 ℃范圍，以5 ℃/min的恒定速率進行溫度掃描，空鍋用作參考。通過TA系統Muse軟件計算變性峰值溫度（Tp）和焓（ΔH）。

1.3.6 面筋蛋白游離巰基測定

將150 mg蛋白質樣品懸浮于5.0 mL Tris-甘氨酸緩沖液（10.40 g Tris，480.00 g尿素，10.40 g甘氨酸，用質量分數1% SDS溶液稀釋至1 000 mL）中，加入0.1 mL 5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶液（用質量分數為1% SDS溶液將40 mg DTNB調節至10 mL），10 000 r/min離心20 min。取上清液在412 nm波長處測定吸光度[20]。游離巰基含量計算如式（2）所示：

式中：A412nm為 412 nm波長處的吸光度；C為樣品質量濃度/（mg/mL）；5.02為稀釋因子。

1.3.7 面筋蛋白二級結構測定

通過傅里葉變換紅外光譜研究面筋蛋白二級結構。以4 cm-1的分辨率記錄紅外光譜，對于400～4 000 cm-1之間的每個樣品掃描32 次。采用Omnic 8.2軟件和Perkfit 4.0軟件對酰胺I帶進行去卷積處理，并求其二級導數得到特征峰，進行曲線擬合計算峰面積并確定面筋蛋白二級結構所占比例[21]。

1.3.8 掃描電子顯微鏡觀察

將冷凍干燥后的不同濃度KGM-面筋蛋白，粉碎過200 目篩后，取樣，用導電膠貼于置物臺，置于掃描電子顯微鏡下，抽真空在真空環境下進行觀察。

1.4 數據統計分析

Microsoft Excel、SPSS 17.0和Origin 8.5用于數據處理。通過單因素方差分析（ANOVA）和Duncan的多范圍檢驗確定統計差異，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 KGM對面筋蛋白持水性的影響

圖1 KGM取代度對面筋蛋白持水性的影響Fig. 1 Water-binding capacity of gluten with different contents of KGM

由圖1可以看出，隨著KGM取代度的增加，面筋蛋白持水量也不斷增加，空白對照組的面筋蛋白持水性為2.01%，而KGM取代度0.5%的面筋蛋白持水性為3.95%，表明，KGM的添加顯著增強了面筋蛋白的持水性。這主要由于KGM本身具有極強的吸水性，可以吸回自身質量80～100 倍的水分，所以KGM的添加必然會增加面筋蛋白的持水性[22]。面筋蛋白持水性的大小，間接反映了面筋蛋白內部網絡結構均一性和穩定性[5]。隨著KGM取代度的持續增加，面筋蛋白的持水性又分別增加了0.33%、0.73%、0.88%、1.54%。這可能因為KGM屬于非離子型水溶性高分子膠體，其含有的豐富羥基與面筋蛋白相互作用，形成KGM-水-面筋蛋白復合網絡結構，可以束縛更多的水分子，從而使復合體系持水性增強[23]，使面筋蛋白結構更加穩定。持水性是蛋白質的重要功能性質，決定著蛋白質與食品體系中水分的相互作用[24]。

2.2 KGM對面筋蛋白分子質量的影響

面筋蛋白是自然界最為復雜的蛋白之一，分子質量可高達107Da。目前小麥面筋蛋白的分類主要沿用Osborne分離法，即根據面筋蛋白在乙醇水溶液中溶解度的差異，分為單體醇溶蛋白和聚合體谷蛋白，二者質量比接近1∶1[25]。面筋蛋白的SDS-PAGE圖譜如圖2所示，谷蛋白分為高分子質量谷蛋白（high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS，約65～113 kDa）和低分子質量谷蛋白（low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS，約30～60 kDa）。醇溶蛋白根據其在酸性pH值下的電泳遷移率分為4 組，分別為α-、β-、γ-和ω-醇溶蛋白。其中，α-和β-醇溶蛋白氨基酸和DNA非常相似，被稱為“α型”醇溶蛋白。α和γ型為富硫亞基，分子質量在30～45 kDa之間。ω型為貧硫亞基，分子質量在46～74 kDa[26]。

圖2 冷凍后面筋蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of frozen gluten

圖2 反映了不同KGM添加處理組的冷凍小麥面團面筋蛋白各亞基條帶的變化，可看出，空白對照組的HMW-GS和LMW-GS條帶清晰（泳道1），而所有樣品處理組的條帶顏色相對變淺（泳道2～6），這可能是由于KGM和面筋蛋白相互作用的結果。隨著KGM取代度的增加，面筋蛋白條帶隨之加粗，顏色加深，更進一步證明KGM能夠與面筋蛋白相互作用，且隨著KGM取代度的增加，相互作用加強。空白對照組醇溶蛋白的ω型（泳道1）和所有樣品處理組的面筋蛋白條帶（泳道2～6）相比，并沒有發現有任何條帶發生移動現象。而空白對照組醇溶蛋白的α和γ型條帶粗、顏色深（泳道1），所有樣品處理組的面筋蛋白的條帶較淺，顏色較淡（泳道2～6），但隨著KGM取代度的增加，并未明顯變化。在KGM存在下的低分子區域蛋白分子質量明顯大于空白對照組，這可能是由于空白對照組原先聚集在濃縮膠的高分子質量蛋白發生解聚，小分子質量蛋白得以釋放，從而使低分子質量蛋白濃度提高[27]。

2.3 KGM對面筋蛋白流變性的影響

從圖3可看出，KGM-面筋蛋白黏彈特性參數隨KGM取代度的不同而發生變化。與對照相比，隨著KGM取代度的增加，面筋蛋白的儲能模量（G’）和損耗模量（G〞）均呈增加趨勢，而tanδ則呈下降趨勢。G’是指經過一個振動周期的正弦形變后所恢復的能量，代表物質的彈性本質；G〞是指每個周期的正弦形變所消耗的能量，代表物質的黏性本質。面筋蛋白不僅具有黏性流體的一些特性，而且也具有彈性固體的一些特征，對面團的流變性起主要作用[28]。在相同的頻率掃描下，當KGM取代度低于1.5%時，面筋蛋白的G’和G〞的增加均不明顯；當KGM取代度高于1.5%時，面筋蛋白的G’和G〞均明顯增加，表明KGM的添加使得KGM-面筋蛋白的彈性和黏性均得到提高。損耗角正切值tanδ的大小反映了體系中黏彈性的比例。從圖3可知，在不同的頻率掃描下，空白對照的tanδ呈逐步上升趨勢；而在KGM存在下，面筋蛋白的tanδ值呈現先增加后降低的趨勢，在KGM取代度為2.5%時，tanδ值達到最大。這表明2.5%的KGM的取代度對面筋蛋白彈性的貢獻大于黏性，此時有利于谷蛋白分子之間形成交聯結構，能夠更好地賦予面團彈性，而當KGM含量增加，則更有利于面團黏性的增加。這主要是由于KGM是非離子型膠體，能夠通過氫鍵和疏水鍵與面筋蛋白作用，并且位于支鏈上的官能團凝膠形成糖網絡，強化面筋蛋白的網絡結構，起到了保護面筋蛋白網絡結構的作用，提高了冷凍面筋蛋白的凍藏穩定性[29]。

圖3 KGM對面筋蛋白流變性的影響Fig. 3 Effect of KGM content on rheological properties of gluten

2.4 KGM對面筋蛋白熱特性的影響

表1 KGM對面筋蛋白熱特性的影響Table 1 Effect of KGM on thermal properties of gluten

由表1可知，與對照相比，所有樣品處理組面筋蛋白變性溫度（Tp）和變性焓（ΔH）均增高。隨著KGM取代度的增加，相應濃度的KGM-面筋蛋白Tp分別增加3.49、3.18、2.8、2.64、2.59 ℃，在KGM取代度為0.5%時，KGM-面筋蛋白Tp增加的最多，表明KGM的添加使面筋蛋白的低熱穩定性提高。ΔH表示面筋蛋白有序結構高低[30]，由表1可知，當KGM取代度為2.5%時，KGM-面筋蛋白的ΔH增加量最高，為2.1 J/g。Wang Pei等[31]實驗證明凍藏后面筋蛋白ΔH降低，面筋蛋白的有序結構減少，而添加KGM后面筋蛋白的ΔH增加，反映出KGM的添加使面筋蛋白結構變得更加有序，特別是在取代度為2.5%時，有序性相對較高。這主要由于KGM能夠通過非共價相互作用和物理纏結改變面筋蛋白的構象，同時也能通過增強疏水相互作用促進蛋白質聚集，從而影響多肽鏈空間結構的重排[32]。

2.5 KGM對面筋蛋白游離巰基的影響

圖4 KGM對面筋蛋白游離巰基含量的影響Fig. 4 Effect of KGM content on free SH content of gluten

作為面筋蛋白的功能組，游離巰基通常可通過形成二硫鍵參與蛋白質聚集行為。當面筋蛋白分子之間的二硫鍵斷裂時，形成游離巰基，導致面筋蛋白的聚合物解聚[33]。從圖4可以看出，與空白對照相比，在冷凍過程中加入不同水平的KGM后，面筋蛋白的游離巰基含量呈現出先降低后增加的趨勢。當KGM取代度為0.5%時，面筋蛋白游離巰基含量從4.78 μmol/g降至4.55 μmol/g，這可能是由于KGM的自由基和親核機制在鏈間二硫鍵誘導的面筋蛋白聚集中起重要作用[34]。當取代度從1.5%增加到4.5%時，面筋蛋白游離巰基含量分別增加0.13、0.58、0.51、0.61 μmol/g，這可能歸因于活性羥基對KGM的D-葡萄糖和D-甘露糖的自由基清除作用，干擾了面筋蛋白二硫鍵的交換反應[32]，從而對面筋蛋白中游離巰基含量產生影響。

2.6 KGM對面筋蛋白二級結構的影響

表2 冷凍期間添加KGM谷蛋白的二級結構占比變化Table 2 Change in secondary structure content of frozen gluten with added KGM%

蛋白質的二級結構主要通過非共價力維持，當環境發生變化時，蛋白質分子將重新排列，以達到最低能量，維持相對穩定的狀態[31]。從表2可以看出，添加KGM會對面筋蛋白的二級結構產生影響。與對照組相比，KGM取代度為0.5%時，處理組的α-螺旋結構從28.08%下降到25.24%，降低了2.84%；當KGM取代度從1.5%增加到4.5%時，處理組的α-螺旋結構分別又增加了2.58%、4.21%、5.09%、7.45%，這可能是由于KGM的低取代度與面筋蛋白競爭性吸水而又無法充分相容造成面筋蛋白內部結構不穩定；β-折疊結構分別增加0.17%、3.25%、4.44%、5.06%、5.44%；β-轉角結構分別下降了2.14%、3.98%、4.01%、5.28%、6.05%；無規卷曲結構也分別下降了5.17%、5.92%、7.71%、8.62%、8.59%。表明處理組改變了面筋蛋白二級結構的分布和形態，Linlaud等[24]研究也證實了KGM的添加使α-螺旋和β-折疊結構顯著增多，有助于形成更緊湊的面筋蛋白結構。相較于β-轉角和無規卷曲結構構象不穩定的特點而言，α-螺旋結構是一種穩定、強壯和有彈性的結構，有利于提高面團的彈性和硬度[35]，β-折疊結構也是一種穩定的結構，所以KGM有利于改善冷凍面團的穩定性。這可能歸因于KGM不僅可以作為親水膠體修飾冰晶，使冰晶更小，分布更均勻，而且KGM可誘導多糖和面筋蛋白的—OH基團之間形成強烈的分子間氫鍵，產生更穩定的面筋網絡結構[36]。

2.7 面筋蛋白微觀結構分析

圖5 面筋蛋白微觀結構的掃描電子顯微鏡圖（×500）Fig. 5 SEM images showing the microstructure of gluten added with different amounts of KGM (×500)

空白對照組（圖5a）的網絡結構密集，表面平坦，而所有樣品處理組的面筋蛋白結構具有明顯的海綿狀結構和更大的孔隙，同時所有樣品處理組的面筋蛋白微觀結構顯示出微米級的原纖維規律交聯，第1層的原纖維形成連續的片狀結構并形成了大量陷入網絡中的空腔（圖5b～f），與Zhou Yun等[37]的報道一致。隨著KGM取代度的增加，面筋蛋白的結構更加蓬松、孔徑更大。當KGM取代度為1.5%時面筋蛋白的孔徑最大（圖5c），這可能由于KGM摻入原纖維中，使其變平、伸長，有助于蛋白質鏈在其有序聚集發生之前展開[38]，同時KGM不同于其他親水膠體的結構，其能夠自身形成糖網絡，可以加固面筋蛋白網絡結構，使其在冷凍環境下更加穩定。隨著取代度的持續增加孔徑開始回縮，這可能由于KGM具有很強的水合能力，使得過多的KGM能夠與面筋蛋白競爭性吸水致使其結構開始回縮。

3 結 論

不同取代度的KGM對冷凍小麥面團面筋蛋白結構和功能特性存在一定的影響。KGM含有豐富的羥基，可束縛更多的水分子，提高了面筋蛋白的持水性。在KGM存在的情況下，面筋蛋白LMW-GS和醇溶蛋白α和γ型低分子質量區域的分子質量增大，并干擾面筋蛋白二硫鍵的交換反應，影響面筋蛋白的游離巰基含量。此外，KGM有利于提高面筋蛋白的黏彈特性和熱特性，促使面筋蛋白中穩定性差的β-轉角和無規卷曲結構轉化為結構穩定的α-螺旋和β-折疊結構。面筋蛋白微觀結構的變化也進一步證明了KGM對改善冷凍小麥面團面筋蛋白結構以及持水性、流變性、熱特性功能特性的有效性。