松仁清蛋白抗氧化肽的分離純化及結構鑒定

盧紅妍，楊 行，方 麗，劉詩夢，閔偉紅,*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

氧化應激是指機體內產生過多活性氧簇自由基，超出機體清除能力，導致體內氧化系統與抗氧化系統失衡[1]。而體內氧化還原狀態失衡與慢性代謝性疾病，如心腦血管疾病、糖尿病、類風濕性關節炎和癌癥發生、發展等有關[2-4]。國內外研究發現生物活性肽可調節血脂、清理血栓、預防高血壓和神經退行性疾病[5-7]等，同時研究證明，從芝麻粉、蛋清、比目魚肌肉和大麻籽等[8-10]蛋白中提取的小分子質量活性肽均具有較強的抗氧化活性，并且富含疏水性氨基酸和巰基、羥基基團的肽具有較好的抗氧化活性[11-12]。

長白山松仁（Pinus konaiensis Sieb. et Zucc.）為松科植物紅松的種子仁，蛋白質量分數達16.7%[13]，富含人體所需的8 種必需氨基酸，是優質的植物蛋白來源。其中松仁清蛋白占總蛋白含量的38.71%，且清蛋白的暴露巰基和總巰基含量最高[14]。因此，松仁清蛋白可作為抗氧化肽制備來源。

本研究以松仁清蛋白為原料，采用堿性蛋白酶制備高抗氧化活性肽，通過現代色譜分離技術進行純化，利用電噴霧串聯質譜（electrospray tandem mass spectrometer，ESIMS/MS）儀進行結構鑒定，在此基礎上，合成結構明確的松仁清蛋白活性肽，并對其進行活性驗證。為松仁資源的開發利用及抗氧化肽的深度研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山松仁清蛋白為實驗室自制，通過堿溶酸沉法和Osborne法制備[15]。

堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司；熒光素鈉、2,2’-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、菲洛嗪、SephadexG-25、SephadexG-15美國Sigma公司；偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis[2-methylpropionamidine] dihydrochloride，AAPH） 美國SECOMA公司；其他均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；ZY-1000切方流超濾系統 上海紫裕生物科技有限公司；SPECTRA-MAX190型酶標儀 美國Molecular Devices公司；DBS全自動部分回集器 上海嘉鵬科技有限公司；HD-21-88紫外檢測器 上海琪特分析儀器有限公司；2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；Q Exactive四極桿-軌道阱高分辨質譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 松仁清蛋白肽的制備

以松仁清蛋白為原料，選用堿性蛋白酶進行水解，最佳酶解工藝條件：酶解溫度57 ℃，pH 9.5，加酶量8 600 U/g，質量分數2%，反應時間150 min。酶解產物凍干備用。

1.3.2 抗氧化活性測定

氧自由基吸回能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）測定參照Ou等[16]的方法；ABTS陽離子自由基清除能力測定參照Kong Baohua等[17]的方法；DPPH自由基清除能力測定參照Xie Zhengjun等[18]的方法；羥自由基清除能力測定參照Amarowicz等[19]的方法；以上實驗均以谷胱甘肽為陽性對照。鐵離子螯合能力測定參照Lee等[20]的方法，以乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）為陽性對照。

1.3.3 肽酶解液的超濾

對松仁清蛋白酶解產物的超濾分離選用切方流超濾系統及Biomax改良聚醚砜復合膜包，膜包截流分子質量分別為10 kDa和3 kDa，控制恒流泵進口壓力為1.5 bar，回流壓力為0.4 bar，將獲得的3 個組分冷凍干燥，測定其抗氧化活性。

1.3.4 SephadexG-25、SephadexG-15凝膠層析

基于超濾的抗氧化活性結果，選擇最優組分進行SephadexG-25層析分離，樣品質量濃度100 mg/mL，上樣量15 mL，洗脫流速1.5 mL/min，檢測波長280 nm，分別回集各峰組分，凍干后測定抗氧化活性。選取活性最好組分進一步經SephadexG-15純化，樣品質量濃度80 mg/mL，上樣量1.5 mL，洗脫流速0.8 mL/min，280 nm波長下進行檢測，分別回集各組分，凍干后測定各組分抗氧化活性。

1.3.5 反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分離

將SephadexG-15分離獲得的高抗氧化活性肽經Waters HPLC儀進一步純化，選用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。流動相A：水（含0.1%三氟乙酸）；B：乙腈（含0.1%三氟乙酸）。樣品質量濃度40 mg/mL，上樣量50 μL，檢測波長220 nm。洗脫條件：0～30 min，95%～70% A；30～40 min，70% A；40～60 min，70%～95% A。每次洗脫結束平衡色譜柱15 min，按圖譜回集各組分，多次上樣，回集凍干。

1.3.6 質譜鑒定

采用HPLC-ESI-MS/MS進行結構鑒定，將樣品復溶于水后經由配備在線納噴離子源的LC-MS/MS分析。整套系統為串聯EASY-nano-LC 1200的Q Exactive Plus質譜儀，共上樣8 μL樣品（捕集柱：Acclaim PepMap C18（100 μm×2 cm）；分析柱：Acclaim PepMap C18（75 μm×15 cm））。以線性梯度分離：60 min內3%～28% B（含0.1%甲酸的ACN溶液）。柱流量控制在300 nL/min，柱溫40 ℃，電噴霧電壓2 kV。

Q Exactive Plus質譜儀在數據依賴采集模式下運行，自動在MS和MS/MS采集間切換。質譜參數設置如下：MS：掃描范圍m/z 350～1 650；分辨率70 000；AGC目標3e6，最大噴射時間50 ms，包括電荷狀態2～7，動態排除時間auto；HCD-MS/MS：分辨率35 000，隔離窗口1.6，AGC目標1e5，最大噴射時間110 ms，碰撞能量27。

1.3.7 抗氧化肽的合成

采用Fmoc固相合成法，由北京中科亞光生物科技有限公司合成。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 酶解液指標測定結果

最佳酶解工藝條件下酶解，酶解液肽質量濃度為0.634 mg/mL，水解度為28.98%。酶解產物質量濃度為4 mg/mL時，DPPH自由基清除率為73.12%，羥自由基清除率為70.05%，具有較高的抗氧化活性，可用于進一步分離純化。

2.2 超濾組分抗氧化活性

松仁清蛋白酶解產物經超濾獲得3 個組分，分別為＜3 kDa、3～10 kDa和＞10 kDa，對各組分進行抗氧化活性驗證。ORAC法是一種總抗氧化能力測定方法，其產生的自由基與生命體系中自由基具有高度一致性[21]，因此選取ORAC為主要驗證指標，并以不同反應機制的ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基清除能力和鐵離子鰲合能力4 個指標輔助篩選。

圖1 超濾組分抗氧化活性Fig. 1 Antioxidant activities of the ultrafiltration fractions

如圖1所示，在ORAC實驗中，＜3 kDa組分抗氧化活性優于谷胱甘肽，表現出極顯著差異（P＜0.01），而3～10 kDa和＞10 kDa組分活性顯著低于谷胱甘肽（P＜0.01）；在ABTS陽離子自由基清除實驗中，＜3 kDa組分的自由基清除能力低于谷胱甘肽，而優于其他2 個組分；DPPH自由基和羥自由基清除實驗中，3～10 kDa組分的抗氧化活性最好，優于其他2 個組分；鐵離子鰲合能力實驗中，以EDTA為陽性對照，＜3 kDa和3～10 kDa組分在8 mg/mL時，金屬離子鰲合能力與EDTA相當。以上各實驗中不同組分間抗氧化活性存在差異，這可能是因為堿性蛋白酶作用于不同酶解位點，酶解產物中暴露出不同氨基酸殘基，活性肽的供氫或供電子能力存在差異，使各組分具有不同的抗氧化能力。綜合考慮選擇＜3 kDa組分進一步純化。

2.3 SephadexG-25、SephadexG-15分離純化及抗氧化活性

圖2 SephadexG-25凝膠層析圖譜（a）及ORAC（b）Fig. 2 SephadexG-25 chromatogram (a) and ORAC values (b) of eluates

如圖2a所示，將＜3 kDa組分進行SephadexG-25凝膠層析色譜分離，獲得4 個組分，標記為B1、B2、B3、B4，回集各組分凍干，進行抗氧化活性驗證。由圖2b可知，ORAC實驗中，各組分均表現出一定抗氧化能力，且分子質量越小ORAC越強，與谷胱甘肽相比B4組分表現出極顯著性差異（P＜0.01），B3組分與谷胱甘肽的ORAC相當，而B1與B2組分均低于谷胱甘肽。

表1 SephadexG-25及SephadexG-15組分抗氧化活性Table 1 Antioxidant activities of on eluates from SephadexG-25 and SephadexG-15 columns%

在超濾純化組分的測定中，各組分的抗氧化活性均表現出一定的劑量-效應關系，因此在后續實驗中，選取質量濃度為4 mg/mL進行抗氧化活性測定。如表1所示，ABTS陽離子自由基清除實驗中，B3和B4組分均有較高的自由基清除能力，與谷胱甘肽相比沒有顯著性差異（P＞0.01）；在DPPH自由基清除實驗中，各組分間均存在顯著性差異（P＜0.01），清除能力依次為：B4＞B3＞B2＞B1；B3組分羥自由基清除能力高于其他3 個組分；鐵離子鰲合實驗中，B4組分抗氧化活性最好，而B3組分活性較低。研究表明，肽的抗氧化活性與其分子質量之間存在相關性，其活性可能隨著肽分子質量的降低而增加，而抗氧化肽的自由基清除作用可能與氨基酸的組成和序列有關[22]。因B4組分純化獲得數量極少，綜合考慮，選擇B3組分進一步純化。

圖3 SephadexG-15凝膠層析圖譜（a）及ORAC（b）Fig. 3 SephadexG-15 chromatogram (a) and ORAC values (b) of eluates

如圖3a所示，B3組分經SephadexG-15凝膠層析色譜分離，獲得C1、C2兩個組分，回集各組分凍干，進行抗氧化活性驗證。由圖3b可知，ORAC實驗中，C1和C2組分與谷胱甘肽相比沒有顯著性差異，C2組分ORAC與谷胱甘肽相當，而C1組分活性較低。

如表1所示，在ABTS陽離子自由基清除實驗中，C1組分清除率為96.50%，C2組分清除率為99.12%；DPPH自由基和羥自由基清除實驗中，C1組分自由基清除能力高于C2組分；而在鐵離子鰲合實驗中，C2組分金屬離子鰲合能力達到97.82%，與C1組分相比具有顯著性差異（P＜0.01）。有文獻報道稱，反應體系中pH值條件對抗氧化實驗的有較大影響[23]，因此推測針對不同實驗，各組分的清除能力存在差異，可能是因為各組分中抗氧化肽具有不同酸性或非中性氨基酸殘基。綜合考慮，選擇C2組分進行液相分離。

2.4 RP-HPLC分離

圖4 C2組分RP-HPLC圖Fig. 4 RP-HPLC analysis of fraction C2

如圖4所示，0～10 min內出現的是溶劑峰，而樣品峰主要集中在15～45 min內，樣品峰中存在較多雜峰，說明經G15純化后樣品純度較低，根據各峰的分離效果和響應值大小，回集5 個主要的洗脫峰D1、D2、D3、D4、D5，各洗脫峰的保留時間分別為15.2、17.7、15.5、36.9 min和43.7 min，洗脫峰與總峰面積比分別為7.85%、3.70%、5.98%、9.23%和4.62%。研究表明，經RP-HPLC分離，具有較弱極性和非極性物質在反相柱上保留時間長、出峰時間晚、疏水性高的特點[24]。D4、D5組分的洗脫峰峰形左右對稱，純化效果好含量高，且響應值較高，可能為主要的效應物質，因此選擇回集D4和D5組分。

2.5 質譜鑒定結果

圖5 FFPY和YLPF二級質譜圖Fig. 5 Tandem mass spectra of FFPY and YLPF

將D4和D5組分進行ESI-MS/MS鑒定，通過從頭測序和PEAKS Studio version 8.5分析，獲得序列明確的高抗氧化活性肽。大量研究表明，與親水性氨基酸相比，疏水性氨基酸在高抗氧化活性肽中占更高比例，并且被認為是影響肽自由基清除能力的關鍵因素[25]。另外有報道稱，芳香族氨基酸（色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe））可以顯著提高肽的抗氧化能力[26]。因此，綜合數據庫查閱結果和質譜可信度分析，從鑒定結果中選擇氨基酸序列為苯丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸Phe-Phe-Pro-Tyr（FFPY）和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸Tyr-Leu-Pro-Phe（YLPF）的活性肽進行抗氧化性分析，質譜圖如圖5所示。

2.6 抗氧化肽的合成及驗證

抗氧化肽FFPY和YLPF進行化學合成，分子質量分別為572.67 Da和538.65 Da，純度為99.16%和99.91%。對合成肽FFPY和YLPF進行抗氧化活性驗證，ORAC值分別為7 329.63 μmol/g和2 835.47 μmol/g，此結果與先前報道一致，活性肽中疏水性氨基酸和芳香族氨基酸含量高，具有更好的抗氧化活性[27]。

3 討論與結論

本研究利用ORAC、ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基清除能力和鐵離子鰲合能力5 個實驗對松仁清蛋白抗氧化肽進行分離純化，其中ORAC法是基于氫原子轉移的反應，目前氫原子轉移反應被認為是自由基氧化反應的主要機制[28]。分析表明，在ORAC和ABTS實驗中，各級組分的分子質量越小，抗氧化活性越好，這說明肽的抗氧化活性與其分子質量大小密切相關。基于單電子轉移的DPPH自由基清除實驗中，松仁清蛋白抗氧化肽可以提供氫供體，與DPPH自由基中心的氮相互作用，從而減少高氧化性自由基，終止自由基鏈式反應；張德舉[29]研究表明，常見氨基酸中只檢測到半胱氨酸具有DPPH自由基清除活性，因此純化過程中，因各組分中半胱氨酸含量及所處位點不同，具有不同的DPPH自由基清除能力。Esteve等[30]研究表明，從橄欖油中提取的小分子質量生物活性肽比高分子質量活性肽具有更好抗氧化能力，這與此研究結果一致。這可能是因為抗氧化肽的氫基團作為氫供體與自由基發生反應，而只有這些肽在一定分子質量大小內，氫供體才能最大程度地暴露并與自由基反應[31]。

基于RP-HPLC分離結果，選擇最優組分進行ESI-MS/MS分析，獲得序列明確的抗氧化活性肽FFPY和YLPF，分子質量分別為572.67 Da和538.65 Da。這與所報道的典型抗氧化肽一般包含2～9 個氨基酸，分子質量范圍大多在400～950 Da相一致[32]。Zou Tangbin等[33]研究發現，氨基酸組成對抗氧化活性影響較大，在42 種抗氧化肽中存在人體所含20 種氨基酸，其中甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸占氨基酸總數的33.7%，丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸占18.7%；另有研究表明，C-末端和N-末端的氨基酸殘基是影響肽抗氧化活性的關鍵因素，且C-末端區域的氨基酸性質比N-末端區域的氨基酸性質更重要[34]。本研究中，抗氧化肽FFPY和YLPF中所含氨基酸均為疏水性氨基酸，且75%的氨基酸為組成抗氧化活性肽的主要氨基酸；同時，兩個肽的C-末端和N-末端氨基酸均為芳香族氨基酸，C-末端為酪氨酸的合成肽FFPY比YLPF具有更高的ORAC。高抗氧化活性肽FFPY和YLPF來源于松仁清蛋白，這為松仁清蛋白的開發利用提供了參考和依據。