大米球蛋白銅離子結合肽的鑒定及其螯合活性分析

邢常瑞，初晨露，張曉云，汪金燕，鞠興榮，袁 建*

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與發全協同創新中心，江蘇高校糧油質量發全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

稻谷是世界上最重要的糧食作物，2012年全球稻谷年產量超過7億 t[1]。在稻谷加工成精米的過程中，根據工藝不同，產生的米糠約占稻谷質量5%～8%。新鮮的米糠氣味清淡，味道微苦微甜，我國大部分米糠都是作為優質的動物飼料直接使用。在日本、印度等國家，去脂米糠添加到莫米粉或者大米粉中用于制作一些傳統淀粉基食品，盡管米糠的添加對食品外觀和顏色有些影響，但是對食品質構影響不大；米糠中油脂、蛋白含量高的特點也用于生產米糠油、替代魚粉等。米糠成分復雜，對不同成分的深入研究和利用可以極大提高米糠的商業價值[2]。

米糠營養價值高，可以提供豐富的維生素、礦物質、不飽和脂肪酸和大量的蛋白質[3]。同時，營養學家對大米蛋白、玉米蛋白、蠶絲蛋白、方日葵蛋白等在內的許多自然資源進行研究，發現很多蛋白、水解物和多肽具有酪氨酸酶抑制、抗癌、抗氧化活性和金屬離子螯合活性[4-7]。

銅作為一種人體必需的微量元素，是多種氧化酶的組成成分[8]。Megas等[9]用胃蛋白酶和胰液素對方日葵蛋白進行酶解，發現具有Cu2+螯合活性的肽，氨基酸分析發現其富含組氨酸和精氨酸，抗氧化活性與β-胡蘿卜素相當。Perkins等[10]發現甘氨酸-L-組氨酸-L-賴氨酸三肽與銅結合后形成穩定的絡合物，可以增加肝癌細胞對銅的吸回，并且銅絡合物具有誘導血管生成的能力。多肽-金屬螯合物比單純的氨基酸-金屬元素螯合物具有更高的配合率、穩定性及生理活性[11-12]。Kubglomsong等[13]通過分離米糠白蛋白水解物，發現多個肽序列具有酪氨酸酶抑制和銅螯合活性，一些多肽具有高效的酪氨酸酶抑制作用和螯合銅的能力。目前對于大米蛋白源金屬螯合肽的研究和發現比較少，加強對大米蛋白酶解多肽與金屬元素的結合能力和特異性研究，有助于多種金屬元素肽的發現和提高大米蛋白的高值產品的開發價值。

本實驗從大米球蛋白胃蛋白酶水解物中篩選、鑒定并人工合成兩條多肽（QGWSSSSE和YYGGEGSSSEQGY），研究其與金屬離子的螯合活性，并比較這兩條多肽與乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、檸檬酸和金屬硫蛋白螯合金屬離子的能力大小，為后續進一步研究生理活性和酪氨酸酶抑制能力提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷為2018年采集自淮發市淮發區粳稻品種“淮稻5號”。

醋酸鈉緩沖溶液（p H 6.0）、兒茶酚紫、CuSO4?5H2O、EDTA、檸檬酸、金屬硫蛋白（相對分子質量約為6 500）；合成肽1（QGWSSSSE）和合成肽2（YYGGEGSSSEQGY）由江蘇申基生物科技有限公司合成，純度大于95%。

1.2 儀器與設備

SpectraMax?M5多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；7700x電感耦合等離子質譜儀 美國Agilent公司；TRIPLETOF 5600液相色譜-質譜聯用系統美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 大米中蛋白的提取和測定

稻谷用礱谷機將稻谷外殼去掉，保留糙米，然后用萬能粉碎機將糙米磨成粉末，過60 目篩得到糙米粉，進行4 種蛋白的連續提取。

根據4 種蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白）溶解度的差異，分別以蒸餾水、5% NaCl溶液、70%乙醇溶液、0.05 mol/L NaOH溶液作為主要溶劑，采用Osborne法分步提取4 種蛋白[14]。每次室溫攪拌提取時間2 h、固液比4∶1，10 000 r/min離心10 min分離沉淀蛋白，每步重復提取3 次，合并提取液通過0.45 μm濾膜過濾。通過滴加2 mol/L HCl溶液調節等電點沉淀提取液中的蛋白質，進行冷凍干燥，-20 ℃保存。對冷凍干燥的蛋白質進行ICP-MS測定，測定25 種元素含量[15]。

1.3.2 胃蛋白酶水解球蛋白

由于谷蛋白和醇溶蛋白的水溶解差，只有在堿性條件下才能溶解，故選擇球蛋白進行酶解。將分離得到的1 g的大米球蛋白溶解于蒸餾水中，使其質量分數為5%，調節反應的溫度（37 ℃）和pH值（胃蛋白酶pH 2），攪拌溶解1 h后，加入胃蛋白酶質量分數為4%。酶解4 h，監測反應pH值，通過1 mol/L的HCl溶液保持反應pH值不變。

1.3.3 球蛋白酶解肽鑒定和人工合成

回集酶解液，使用超濾管進行分離，超濾管截留分子質量為3 kDa。通過超濾膜后的下層濾液，用50%乙腈溶液，稀釋10 倍，過0.22 μm的有機系微孔濾膜，通過SCIEX Triple-TOF-MS液相色譜-質譜聯用系統進行分析，選擇Agilent 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）作為分離柱，流速0.4 mL/min，柱溫37 ℃，上樣體積10 μL。質譜離子源選擇正離子模式，干燥氣溫度200 ℃，干燥氣流速15 L/min，鞘氣溫度370 ℃，鞘氣流速12 L/min，碰撞電壓380 V，質譜掃描范圍m/z100～2 000，梯度洗脫條件見表1。

表1 測定球蛋白水解多肽梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions for separation of rice globulin peptides

獲得的測試數據通過PEAKS軟件鑒定球蛋白酶解多肽的種類，對比數據庫中的球蛋白氨基酸序列，并分析其可能的金屬元素螯合能力，并進行人工合成。

1.3.4 大米多肽和不同參照物Cu2+金屬離子螯合活性的測定

對比文獻[13]和分析氨基酸組成，選擇2 條可能具有螯合元素活性的大米多肽（記為合成肽1和合成肽2），根據Carrasco-Castilla等[16]的方法測定其與Cu2+金屬離子螯合活性。同時測定參照物EDTA、檸檬酸、金屬硫蛋白和Cu2+金屬離子螯合活性，并比較螯合能力的大小。

1.3.4.1 大米多肽與Cu2+金屬離子螯合活性的測定

用pH 6.0醋酸鈉緩沖溶液配制多肽溶液，合成肽1的溶液濃度梯度為0～68.48 mmol/L，合成肽2的濃度梯度為0～38.76 mmol/L。取20 μL大米多肽溶液與270 μL的50 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液和6 μL的4 mmol/L兒茶酚紫溶液以及10 μL的4 mmol/L CuSO4?5H2O溶液混合，混勻靜置反應15 min。用酶標儀測量溶液在632 nm波長處的吸光度，按照下式計算銅螯合率：

1.3.4.2 EDTA、檸檬酸及金屬硫蛋白與Cu2+金屬離子螯合活性的測定

取用pH 6.0醋酸鈉緩沖溶液配制的EDTA或檸檬酸溶液，EDTA和檸檬酸溶液濃度梯度為0～10.0 mmol/L，金屬硫蛋白溶液濃度梯度為0～2.08 mmol/L。取10 μL溶液與280 μL的50 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液（pH 6.0）和6 μL 4 mmol/L兒茶酚紫溶液以及10 μL的4 mmol/L CuSO4?5H2O溶液混合，混勻靜置反應15 min。用酶標儀測量溶液在632 nm波長處的吸光度，計算銅螯合率。

1.3.5 大米多肽和不同參照物與Cd2+、Fe2+、Ca2+等金屬離子螯合活性的測定

先用醋酸鈉緩沖溶液配制20 mmol/L CdCl2、FeCl2和CaCl2等溶液，按照上述實驗過程，分別取上述不同濃度的大米多肽溶液（20 μL）、EDTA（10 μL）、檸檬酸（10 μL）和金屬硫蛋白溶液（10 μL），與10 μL 20 mmol/L CdCl2溶液混合均勻，室溫靜置反應1 h。余下的實驗步驟相同，測定大米多肽和參照物與Cd2+金屬離子螯合活性（以吸光度表示）。按照同樣的方法測定大米多肽和參照物與Fe2+和Ca2+金屬離子螯合活性。

2 結果與分析

2.1 大米蛋白的提取和多元素含量分析

表2 糙米粉和大米蛋白中不同元素含量Table 2 Metal element contents in brown rice fl our and rice proteins mg/kg

糙米粉經過石油醚攪拌脫脂后，根據蛋白溶解度的差異，采用分步提取4 種蛋白，冷凍干燥后進行ICP-MS檢測，檢測與蛋白質結合的多種優勢元素。由表2可知，在4 種蛋白質中都含有銅，范圍為3.238～26.125 mg/kg。因此，分析這大米4 種蛋白中的銅結合肽可行。Kubglomsong等[13]報道從大米清蛋白中發現多個肽序列具有銅螯合活性，特別是SSEYYGGEGSSSEQGYYGEG肽序列，肽螯合銅的活性比EDTA螯合銅的能力要強，考慮到在實驗中觀察到谷蛋白和醇溶蛋白的水溶解性差，在胃蛋白酶酶解過程中易產生沉淀，酶解不完全，本實驗選取球蛋白進行后續實驗。

2.2 大米球蛋白胃蛋白酶水解多肽鑒定、分析和人工合成

對超濾后的多肽進行質譜分析，通過SCIEX Triple-TOF-MS分析m/z在100～2 000之間的目標物，通過軟件分析肽的序列，匹配覆蓋率最高的蛋白是由Os05g0499100基因編碼的19 kDa globulin，品種來源是Oryza sativasubsp.japonica，整個蛋白的序列是MASKV VFFAAALMAAMVAISGAQLSESEMRFRDRQCQREVQ DSPLDACRQVLDRQLTGRERFQPMFRRPGALGLRMQC CQQLQDVSRECRCAAIRRMVRSYEESMPMPLEQGWS SSSSEYYGGEGSSSEQGYYGEGSSEEGYYGEQQQQPG MTRVRLTRARQYAAQLPSMCRVEPQQCSIFAAGQY。氨基酸序列出峰時間在2～7 min之間，23 條肽的氨基酸序列、分子質量、m/z和保留時間見表3。

表3 胃蛋白酶水解球蛋白多肽序列鑒定Table 3 Identification of globulin peptides derived from enzymatic hydrolysis with pepsin

能夠和元素結合的多肽已經有許多報道。早在1973年發現GHK-Cu具有與Cu2+結合能力，多項研究表明GHK-Cu對健康非常有益，特別是在防止氧化應激和退行性老化方面具有顯著的功能[17]。Wang Li等[18]報道發現Phe-Val-Asp-Val-Thr具有與Ca2+結合的能力。Kubglomsong等[13]發現多條具有與Cu2+結合活性的多肽，比如多肽序列QGWSSSSSEYYGGEGSSSEQGYYGEG，SSEYYGGEGSSSEQGYYGEG和金屬銅有較強的螯合活性。研究發現多個相鄰的絲氨酸（serine，S）在分離組分1多肽中占比較高，表明SS、SSS和SSSS可能與銅的結合活性和酶抑制能力相關[4,13,19]。Mandal等[20]報道了絲氨酸殘基可以通過羧基和氨基基團上的氧原子和氮原子結合Cu2+，而含有多個絲氨酸的多肽正是通過結合酪氨酸酶中的Cu2+從而抑制其活性。盡管Kubglomsong等[13]已經報道了大米蛋白經木瓜蛋白酶酶解后形成較長的多肽，并具有銅結合能力。實驗發現這些多肽序列在經過胃蛋白酶消化后，更傾方于形成較短的多肽，見表3。

基于之前多項研究結論，分析獲得的23 個多肽序列，合成肽1：QGWSSSSSE，M=993（包含表3中的肽序號2序列）和合成肽2：YYGGEGSSSEQGY，M=1 599.7（與表3中肽序號22序列相同）進行后續的實驗。原因是這兩個肽含有SSS和SSSSS連續的絲氨酸序列，同時這兩個序列是Kubglomsong等[13]報道的具有銅螯合活性序列（QGWSSSSSEYYGGEGSSSEQGYYGEG）的前半部分和后半部分。其中合成肽2是SSEYYGGEGSSSEQGYYGEG中間部分，具有銅螯合活性和酶抑制能力的可能性很大。

在確定選取這兩條多肽后，進行人工合成，并通過質譜進行檢測分析，結果見圖1。

圖1 人工合成的合成肽1（A）和合成肽2（B）檢測結果Fig. 1 Mass spectra of artificially synthesized QGWSSSSSE (A) and YYGGEGSSSEQGY (B)

2.3 大米多肽和不同參照物與Cu2+金屬離子螯合活性的測定

EDTA是能與Cu2+、Cd2+、Fe2+、Pb2+等二價金屬離子結合的一種螯合劑，在很多核酸、酶和蛋白質中作為輔基而發揮作用，因此EDTA可作為核酸酶、蛋白酶的抑制劑。在之前的研究中通過EDTA螯合金屬離子形成人工抗原制備重金屬的單克隆抗體，表明EDTA具有很強的Pb2+、Cd2+、Hg2+、Cr3+和Cu2+螯合活性，能夠在免疫系統中穩定存在并作為抗原位點刺激免疫系統[21-25]。檸檬酸對很多金屬離子也具有螯合作用，對于不同的金屬離子其螯合的能力也不一樣，已經報道可以利用檸檬酸除去大米中的重金屬Cd2+而對Pb2+不是很理想[26]。Lerch[27]發現金屬硫蛋白在動植物元素轉運和去毒方面具有重要作用，并且發現銅金屬硫蛋白與鎘金屬硫蛋白、鋅金屬硫蛋白具有類似的肽序列，表明蛋白中特定的肽序列具有元素結合的能力。因此，在測定大米多肽與Cu2+螯合活性過程中，選取了EDTA、檸檬酸和金屬硫蛋白作為能夠與銅螯合的小分子、有機酸和蛋白質的代表。

圖2 大米多肽和不同參照物與Cu2＋金屬離子螯合率Fig. 2 Copper-chelating activity of rice peptides and other chelating agents

從圖2可知，所測定物質螯合銅能力大小排序為：金屬硫蛋白＞EDTA＞檸檬酸＞合成肽2＞合成肽1。

IC20、IC50和IC80是某一藥物或者小分子抗原的濃度抑制某些生物化學反應過程，抑制效果可以達到相對于空白20%、50%和80%的濃度。包括生物化學反應酶催化、抗原抗體反應等[28]。IC20值越低，對底物或者生化反應的抑制作用效果越好。通過計算IC20可知：EDTA的IC20為1.10 mmol/L，檸檬酸IC20為2.91 mmol/L，金屬硫蛋白IC20為0.28 mmol/L，人工合成肽1的IC20為10.78 mmol/L，人工合成肽2的IC20為5.40 mmol/L，人工合成肽2的螯合銅的效果好于人工合成肽1，原因可能是人工合成肽2的氨基酸數量更多，種類更豐富，與Cu2+結合形成的絡合物結構更穩定[29]。人工合成肽2螯合Cu2+的效果在低濃度范圍內更接近檸檬酸。

2.4 大米多肽和不同參照物與Cd2+、Fe2+、Ca2+金屬離子螯合活性的測定

為比較大米多肽和不同參照物與Cd2+、Fe2+、Ca2+的結合能力，用不同濃度的大米多肽溶液、EDTA、檸檬酸和金屬硫蛋白溶液跟含有20 mmol/L的Cd2+、Fe2+和Ca2+溶液混合均勻，室溫靜置反應1 h，檢測結果見表4。

表4 EDTA與不同金屬離子的螯合活性Table 4 Chelating activity of EDTA toward Cd2+, Fe2+ and Ca2+

以EDTA為例，如果EDTA與Cd2+、Fe2+、Ca2+可以形成螯合物，結合穩定性比與Cu2+螯合物的穩定性相當或者更高，則不會與Cu2+形成螯合物，從而不會影響兒茶紫酚與銅的復合物的數量，顯色保持不變。如果形成螯合物的結合穩定性比與Cu2+螯合物的穩定性差，那么在有Cu2+存在時會傾方于與Cu2+形成螯合物，隨著EDTA濃度增加，兒茶紫酚與銅的復合物數量降低，顯色水平降低。從表4可知，EDTA與Cd2+、Fe2+的結合能力與Cu2+相當或者更強；而與Fe2+的結合能力比Cu2+差。結果與EDTA的螯合穩定性常數一致（lgK（Cu-EDTA）=18.8，lgK（Fe-EDTA）=25.1，lgK（Cd-EDTA）=16.4，lgK（Ca-EDTA）=11.0）[30-31]。

表5 檸檬酸與不同金屬離子的螯合活性Table 5 Chelating activity of citric acid toward Cd2+, Fe2+ and Ca2+

表6 金屬硫蛋白與不同金屬離子的螯合活性Table 6 Chelating activity of metallothionein toward Cd2+, Fe2+ and Ca2+

從表5可知，Cd2+和Ca2+反應液的吸光度隨檸檬酸濃度增加大幅度降低；而Fe2+的吸光度相比較之下幾乎不變。結果表明，在檸檬酸和Cd2+和Ca2+螯合后，再加入Cu2+，Cu2+會取代螯合位點的Cd2+和Ca2+，Cu2+與兒茶紫酚的復合物減少，吸光度降低。結果符合金屬離子與檸檬酸的螯合穩定性順序：Cu2+＞Cd2+＞Ca2+，檸檬酸與Cu2+螯合后的穩定性最好[32]。對于Fe2+，檸檬酸與之螯合后會形成黃色的沉淀，不容易再被Cu2+占據螯合位點，因此會使得溶液的吸光度幾乎不變。按照同樣的方法得知（表6），金屬硫蛋白的螯合金屬離子穩定性的順序為：Fe2+＞Cu2+＞Cd2+、Ca2+。

表7 合成肽1與不同金屬離子的螯合活性Table 7 Chelating activity of synthetic peptide 1 toward Cd2+, Fe2+, Ca2+ and Pb2+

表8 合成肽2與不同金屬離子的螯合活性Table 8 Chelating activity of synthetic peptide 2 toward Cd2+, Fe2+, Ca2+ and Pb2+

合成肽1和合成肽2與其他元素的結合效果見表7、8。合成肽1和合成肽2與Cd2+、Ca2+、Pb2+的螯合吸光度變化趨勢和大米多肽與Cu2+的螯合活性變化幾乎呈現相同的趨勢，表明Cd2+、Ca2+、Pb2+與合成肽的螯合物穩定性沒有Cu2+強；而Fe2+混合液的吸光度幾乎不變，說明Fe2+螯合大米多肽的穩定性比Cu2+要好。因此，合成肽1和合成肽2形成穩定的復合物的順序是Fe2+＞Cu2+＞Cd2+、Ca2+、Pb2+。

3 結 論

大米蛋白可以與多種元素結合，是稻谷富集元素的重要組成部分。本實驗通過胃蛋白酶酶解大米球蛋白，篩選到兩種大米蛋白源金屬結合肽。其中，合成肽2在低濃度范圍的螯合能力與檸檬酸相當，比合成肽1效果好。這兩種金屬結合肽與Cu2+螯合能力比EDTA和金屬硫蛋白弱很多。在螯合選擇性方面，合成肽1和合成肽2都具有較強的Cu2+和Fe2+螯合活性，而與Cd2+、Ca2+和Pb2+金屬離子幾乎不結合。