表沒食子兒茶素沒食子酸酯對冷凍羅非魚魚糜抗凍作用機制

袁 悅，趙永強，楊賢慶,*，李來好，吳燕燕，魏 涯，岑劍偉

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港 222005）

魚糜制品是以魚類為原料，經過采肉、漂洗、擂潰、凝膠化等工序加工制成，是我國魚類精深加工的一個重要發展方方。魚糜制品味道鮮美、蛋白質含量豐富、食用方便，且易工業化生產，越來越受到消費者喜愛[1-2]。作為魚糜制品生產的重要原料，冷凍魚糜在凍藏過程中易發生冷凍變性，且其內源性蛋白酶有可能導致蛋白質自溶[3]，因此，有必要尋找方法或技術延緩蛋白質的變性。另外，魚糜制品在冷凍貯藏過程中，脂質在發生氧化變性時產生的自由基攻擊魚糜中的蛋白質后生成α-氨基己二酸、γ-谷氨酸半醛及其他活性羰基衍生物等有害物質，會導致蛋白質氧化變性[4]。氧化后的蛋白質更易發生交聯、聚集，進而影響魚糜的質地特征、感官品質及營養價值[5]。因此，抑制魚糜冷凍貯藏過程中蛋白質氧化引起的肌原纖維蛋白降解對維持魚糜品質及營養價值具有重要意義。

多酚類物質在自然界中含量豐富，且擁有較強的自由基清除及金屬離子結合能力[6]，目前已有研究表明多酚類物質能夠有效抑制肉制品中蛋白質的氧化。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中最有效的抗氧化多酚類物質，在清除體內自由基、抗衰老、抗炎、抗癌、抗突變及改善肝功能等方面具有較好的功效[7]。根據GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》，為方便食品的生產、加工、包裝、運輸或者貯藏，廠家可以使用食品添加劑，在肉灌腸類食品中可以添加茶多酚作為抗氧化劑，且用量不得超過0.3 g/kg。為防止魚糜在凍藏過程中因蛋白質的氧化變性而引起的魚糜品質劣化，本實驗以羅非魚（Oreochromis niloticus）冷凍魚糜為研究對象，探討EGCG對冷凍魚糜的抗凍效果，旨在為EGCG在冷凍魚糜中充當抗凍保護劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活羅非魚購于附近超市，體質量（500±50）g。

EGCG（純度≥95%） 酷爾化學科技（北京）有限公司；蛋白定量試劑盒、蛋白質羰基含量測試盒 南京建成生物工程有限公司；BeyoColorTM彩色預染蛋白 上海碧云天生物技術有限公司；其他常見試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T50型均質機 德國IKA公司；HWS 24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；3K30型臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；UV2550型紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；CT3質構儀 美國Brookfield公司；基礎電泳儀 美國Bio-Rad公司；Image Scanner III掃描儀 美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜制作

將超市購得的鮮活羅非魚擊暈，取背部肌肉，然后去皮得到魚片。用自來水沖盡魚片表面污漬，并用小刀切成塊狀，于豆漿機中初步絞碎，將碎肉與蒸餾水按照1∶4的比例漂洗2 次，之后按同樣的比例用0.25%的食鹽水漂洗1 次，整個漂洗過程盡量保持在10 ℃以下。碎肉漂洗后經脫水于斬拌機中擂潰，隨后每份取1 kg魚糜，分別加入0.002 5%、0.01%、0.02%、0.03%的EGCG混合均勻（用5 mL水溶解EGCG，隨后引入魚糜中，用攪拌機混勻），最后分裝于-18 ℃冰箱中凍藏。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考Manuel等[8]的方法并略作改動。定期取0.50 g冷凍魚糜樣品，加入2.5 mL冰浴冷卻的Tris-HCl緩沖液（10.00 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2，5.00 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）），在冰水浴的條件下以12 000 r/min均質，為避免機器過熱，每均質15 s停10 s，總時間為2 min。均質后得到勻漿，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min。棄上清液，并于沉淀中加入10 倍體積的鹽溶液（0.60 mol/L NaCl，10.00 mmol/L Tris-HCl緩沖液，5.00 mmol/L PMSF，pH 7.2）后均質混勻。將溶液放在冰水浴里面靜置25～30 min后，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，所得上清液即為肌原纖維蛋白溶液，并置于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.3 肌原纖維蛋白含量的測定

采用Bradford蛋白檢測試劑盒方法測定。

1.3.4 肌原纖維蛋白巰基含量的測定

參考Kittiphattanabawon等[9]的方法并略作修改。取0.50 mL提取的蛋白質溶液（必要時加以稀釋），空白對照組則取0.60 mol/L的NaCl溶液，隨后加入4.50 mL的Tris-HCl緩沖液（0.20 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，8.00 mol/L尿素，20.00 g/L SDS，10.00 mmol/L EDTA），旋渦混勻1 min。接著取3.00 mL上述溶液，加入0.30 mL 5,5’-二硫代雙(2-硝基)苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶液（1.00 g/L DTNB，0.20 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），最后利用恒溫水浴鍋水浴加熱，溫度40 ℃，時間25 min。雙蒸水調零，測定各組溶液在波長412 nm處的吸光度，巰基含量計算如式（1）所示[10-11]：

式中：A為412 nm波長處的吸光度；n為稀釋倍數；ε為摩爾吸光系數13 600 L/（mol?cm）；ρ為蛋白質質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 肌原纖維蛋白羰基含量的測定

采用蛋白質羰基含量測試盒測定方法。

1.3.6 SDS-PAGE分析

將提取的肌原纖維蛋白溶液用相應的蛋白提取液稀釋到1.00 mg/mL左右，參考李娜等[12]的方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。將稀釋后的肌原纖維蛋白溶液與2×SDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合，100 ℃水浴5 min，12 000 r/min離心5 min后，回集上清液作為電泳待上樣品。本實驗選擇的分離膠12%，濃縮膠5%，上樣量為15.0 μL。電泳開始時，先以80 V恒壓使樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線，之后將電壓切換到150 V，直到溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳。用考馬斯亮藍R250染色，之后脫色至背景無色，最后掃描并分析條帶。

1.3.7 魚糜凝膠強度的測定

將冷凍的羅非魚魚糜樣品解凍，然后絞碎，加入2.5%食鹽并擂潰3 min，灌入腸衣。采用二段式加熱（40 ℃加熱30 min，90 ℃加熱15 min）使其凝膠化[13]，冷卻至室溫后于4 ℃冰箱過夜。將樣品切成25 mm高的圓柱體，用質構儀測定凝膠強度。探頭直徑5 mm、下壓位移15 mm、觸發值5 g、測試速率1.0 mm/s。凝膠強度計算如式（2）所示：

1.3.8 魚糜凝膠持水性的測定

將1.3.7節制得的魚糜凝膠樣品切成3 mm的薄片，稱其質量記為m1，然后薄片上下均放3 層濾紙，最后放置5 kg的重物，10 min后稱其質量記為m2。壓出水分代表持水性，其計算如式（3）所示：

1.4 統計分析

采用Excel 2007作圖，SPASS 22.0進行方差分析。各組計算數據均以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 EGCG添加量對羅非魚魚糜肌原纖維鹽溶性蛋白含量的影響

圖1 羅非魚魚糜肌原纖維鹽溶性蛋白含量的變化Fig. 1 Changes in salt solubility of myofibrillar protein from Nile tilapia surimi during frozen storage

魚糜中的蛋白質包含鹽溶性蛋白、水溶性蛋白以及不溶性蛋白，魚糜凝膠形成機理主要是肌原纖維蛋白通過氫鍵、二硫鍵、離子鍵等化學作用力形成三維空間網絡結構的過程[1]，且魚糜凝膠強度與鹽溶性蛋白含量呈極顯著正相關[14]，因此鹽溶性蛋白含量的高低是魚糜品質的重要影響因素。如圖1所示，隨著凍藏時間的延長，5 組羅非魚魚糜肌原纖維鹽溶性蛋白呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。其中，空白組、EGCG添加組魚糜肌原纖維鹽溶性蛋白含量分別從凍藏第1周的（18.80±0.56）、（19.95±1.20）、（20.33±0.49）、（20.27±0.55）、（19.57±0.06）mg/g下降至第10周的（5.98±0.44）、（7.02±0.13）、（9.25±0.27）、（7.08±0.38）、（6.37±0.45）mg/g，下降率分別為68.2%、64.8%、54.5%、65.1%與67.5%。由此可知，EGCG添加組肌原纖維鹽溶性蛋白下降率減少，且當EGCG添加量為0.01%時，肌原纖維鹽溶性蛋白下降的幅度最少。汪金林[15]在研究茶多酚對冷藏養殖大黃魚品質影響時，發現茶多酚處理組的魚肉肌原纖維鹽溶性蛋白下降速度減慢，且隨著茶多酚濃度的增加，下降速率越小。

2.2 EGCG添加量對羅非魚魚糜肌原纖維蛋白巰基含量的影響

巰基是肌原纖維蛋白中最具反應活性的功能基團，魚糜在凍藏期間，巰基易被氧化成二硫鍵導致含量下降。此外，蛋白質發生冷凍變性引起空間結構發生改變，隱藏在蛋白質分子內部的巰基暴露，進而被氧化成二硫鍵，導致總巰基含量進一步下降[16]。二硫鍵的形成會影響蛋白質的一些功能特性如持水、乳化能力和可溶性等，因而巰基含量的變化可以反映出蛋白質變性的程度[17]。如圖2所示，在前2 周的凍藏期間，魚糜肌原纖維蛋白總巰基含量增加，可能是由于肌原纖維蛋白發生冷凍變性，空間結構易位，蛋白質分子內部的巰基暴露出來，同時凍藏初期的巰基氧化較少，導致總巰基含量有一個小幅度上升；2 周后，各組羅非魚魚糜肌原纖維蛋白總巰基含量顯著下降（P＜0.05）；凍藏至第10周，空白組和添加0.002 5%、0.01%、0.02%、0.03% EGCG的魚糜組肌原纖維蛋白總巰基含量分別從凍藏前的8.11×10-5、8.65×10-5、9.25×10-5、9.22×10-5mol/g和8.39×10-5mol/g降低到3.01×10-5、3.76×10-5、4.7×10-5、3.27×10-5mol/g和3.09×10-5mol/g，分別降低了62.9%、56.5%、49.2%、64.5%和63.2%，且0.01% EGCG魚糜組總巰基含量顯著高于其他組（P＜0.05）。由此可知，添加EGCG一定程度上能夠抑制肌原纖維蛋白巰基含量的下降，但當EGCG添加量過高時，反而會導致肌原纖維蛋白巰基含量下降，可能的原因是部分EGCG氧化成相應的醌類物質，而醌類物質既可能催化巰基方二硫鍵轉變，又可能直接與巰基共價結合，這都會導致巰基含量的降低。Amjad等[18]研究發現，氧化多酚（阿魏酸、單寧酸、兒茶素和咖啡酸）添加會引起魚糜蛋白巰基含量降低，二硫鍵含量升高；Cao Yungang等[19]研究發現，高濃度綠原酸添加會導致肌原纖維蛋白巰基含量降低。

2.3 EGCG添加量對羅非魚魚糜肌原纖維蛋白羰基含量的影響

圖3 羅非魚魚糜中肌原纖維蛋白羰基含量的變化Fig. 3 Changes in carbonyl content of myofibrillar protein from Nile tilapia surimi during frozen storage

蛋白質羰基化是一種不可逆的、非酶促引起的蛋白質修飾，魚糜在凍藏時容易發生氧化羰基化，破環蛋白質的完整結構，增強蛋白質之間的交聯，進而影響魚糜的品質，因此羰基含量常用作魚糜蛋白質氧化變性的一個重要指標[20]。由圖3可知，隨著魚糜凍藏時間的延長，各處理組羰基含量呈上升趨勢，說明魚糜肌原纖維蛋白發生了不同程度的氧化。凍藏前4 周，各組魚糜肌原纖維蛋白羰基含量上升趨勢較緩慢，且空白組羰基含量顯著高于EGCG添加組（P＜0.05）；4 周以后，各組魚糜中蛋白質羰基含量上升速度加快，到了凍藏末期，空白組羰基含量達到了（6.32±0.78）nmol/mg，各EGCG添加組分別為（4.86±0.09）、（3.69±0.11）、（3.76±0.16）、（3.66±0.45）nmol/mg，蛋白質羰基含量上升幅度均顯著低于空白組（P＜0.05），且EGCG添加量為0.01%、0.02%、0.03%時沒有明顯差異（P＞0.05）。此結果與Manuel等[8]在研究茶多酚對馬鮫魚（Scomberomorus niphonius）魚糜肌原纖維蛋白羰基化的抑制效果相類似。

2.4 SDS-PAGE分析

肌球蛋白和肌動蛋白約占肌原纖維蛋白的70%[21]。由圖4能夠清晰看到肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、原肌球蛋白和5 個未知條帶。圖中沒有出現肌球蛋白輕鏈，可能的原因是長時間的凍藏導致輕鏈降解。此外，EGCG添加組的肌球蛋白重鏈、肌動蛋白以及未知名蛋白質（I、II）條帶顏色較空白組深，而原肌球蛋白和未知名蛋白質（III、IV、V）條帶與空白組基本相同，說明EGCG對肌球蛋白重鏈、肌動蛋白以及未知名蛋白質（I、II）具有一定的保護作用，而對原肌球蛋白和未知名蛋白質（III、IV、V）的降解沒有明顯抑制作用，最后，添加了0.01% EGCG的組蛋白條帶顏色最深。結果表明，冷凍羅非魚魚糜在凍藏過程中，肌原纖維蛋白容易受到冷凍變性、氧化變性、自身蛋白酶及微生物蛋白酶共同作用而降解。另外，空白組降解速率明顯快于EGCG添加組，故EGCG在一定程度上能夠延緩肌原纖維蛋白的降解和變性，且添加質量分數為0.01%的EGCG效果最佳。Sun Lijun等[22]研究了青蘋果多酚對草魚（Ctenopharyngodon idellus）魚糜的影響，發現添加青蘋果多酚的組肌原纖維蛋白條帶密度明顯比空白組高，且此研究還能略微看到肌球蛋白輕鏈條帶。

圖4 凍藏末期肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE profiles of myofibrillar protein at the end of frozen storage

2.5 EGCG添加量對羅非魚魚糜凝膠強度的影響

圖5 -18 ℃凍藏過程中羅非魚魚糜凝膠強度的變化Fig. 5 Changes in gel properties of Nile tilapia surimi during frozen storage at -18 ℃

凝膠強度發生變化，可以一定程度說明肌原纖維蛋白發生了變化，同時魚糜的品質也在發生變化。如圖5所示，隨著凍藏時間的延長，各組魚糜凝膠強度呈顯著下降趨勢（P＜0.05），其中空白組基本呈顯著直線下降（R=0.997），而EGCG添加組的凝膠強度在前面4 周下降趨勢較為緩慢，之后速度變快。凍藏末期，空白組魚糜凝膠強度由4 330.91 g·mm下降到909.23 g·mm，下降幅度達79.0%，其中EGCG添加量為0.01%時，凝膠強度顯著高于其他各組（P＜0.05），由起初的4 285.81 g·mm下降到1 739.20 g·mm，下降率為59.4%，為抗凍效果最好的一組。EGCG屬于多酚類物質，含有大量的羥基，可能與蛋白質形成牢籠式結構的絡合物從而束縛大量水分子，同時減少了水溶性蛋白對魚糜凝膠的影響，使得凝膠結構更為致密，凝膠強度變高[3]。此外，凍藏末期，EGCG添加量為0.02%和0.03%時，魚糜凝膠強度顯著低于其他EGCG組（P＜0.05），表明高質量分數EGCG對魚糜的抗凍效果要比低質量分數EGCG差。Jongberg等[23]發現高濃度綠茶提取物破壞乳化肉體系的凝膠性能，但低濃度并無顯著影響；曹云剛[24]研究發現，在輕度氧化條件下，添加少量沒食子酸能提高肌原纖維蛋白的凝膠性能，過量則會明顯破壞其凝膠性能。

2.6 EGCG添加量對羅非魚魚糜持水性的影響

圖6 -18 ℃凍藏過程中羅非魚魚糜凝膠持水性的變化Fig. 6 Changes in water-holding capacity of Nile tilapia surimi during frozen storage at -18 ℃

持水性是指魚糜凝膠在強烈擠壓下維持水分的能力[25]，壓出的水分越少，樣品的持水性越好[26]。反之，凝膠網絡結構越不致密，凝膠特性越差。因此持水性的大小也是決定魚糜凝膠品質的重要因素之一。如圖6所示，空白組和EGCG添加組魚糜凝膠壓出水分顯著上升（P＜0.05），表明持水性降低。前4 周，空白組魚糜持水性逐漸降低，各EGCG添加組魚糜持水性降低速度較空白組慢；4 周之后，各組魚糜持水性下降速度加快，其中添加0.002 5%和0.01% EGCG的魚糜組持水性相對于其他組而言，凝膠持水性下降趨勢比較緩慢；凍藏末期，添加0.02%和0.03% EGCG的魚糜組壓出水分顯著高于空白組（P＜0.05），表明EGCG添加量過大反而促使羅非魚魚糜凝膠持水性降低，可能是由于EGCG濃度過大，與蛋白質間相互作用形成的混合體系與其他成分交叉連接變多，導致大顆粒的形成和難溶物質的凝集，這種聚集現象導致蛋白質分子間接觸頻率減少，使得蛋白質網絡結構斷裂[27-28]，鎖水能力下降，凝膠的持水性下降，此結果說明低添加量EGCG對羅非魚魚糜具有一定的保水效果，反之則有害，這與凝膠強度的測定結果相似。米紅波等[29]研究發現，添加6-姜酚后草魚魚糜凝膠強度和持水性明顯高于空白組，且添加量為1%時效果最好。

3 討 論

作為優質天然高效抗氧化劑，植物多酚或者富含多酚的植物提取物逐漸被應用于肉制品中以替代可能對人體健康具有潛在危害的合成抗氧化劑[30-31]。多酚類物質的抗氧化機理在于[32-34]：1）酚羥基可作為氫供體，具有良好的自由基清除能力，能有效減慢或終止自由基鏈式反應；2）多酚類物質具有金屬離子螯合能力；3）酚類化合物可以通過非共價相互作用與某些促氧化酶結合，抑制酶的活性，達到抗氧化效果。

在凍藏過程中，魚糜蛋白易發生冷凍變性和蛋白質氧化變性[35]。結果顯示，肌原纖維蛋白巰基含量在凍藏期間先小幅度上升，隨后逐漸下降，可能原因是蛋白質空間構象發生改變，分子內部巰基暴露，肌原纖維蛋白降解[36-37]。EGCG影響了冷凍羅非魚魚糜肌原纖維蛋白巰基含量，很可能是因為EGCG含有的8 個羥基通過共價鍵或非共價鍵的作用與蛋白質疏水基團結合，延緩疏水基團的釋放，從而抑制肌原纖維蛋白降解[38]。此外，在凍藏過程中魚糜蛋白發生氧化羰基化作用，導致肌原纖維蛋白羰基含量上升，破壞了蛋白質的完整性，添加EGCG后，羰基含量明顯減少，這可能要歸因于EGCG的自由基清除能力及金屬離子螯合能力[39]，咖啡酸能有效阻止魚糜在加工及凍藏時蛋白質的氧化[40]；Shi Ce等[41]發現葡萄籽及丁香苞提取物能減緩凍藏時鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）蛋白質的氧化。

冷凍魚糜中肌原纖維蛋白含量最為豐富，將其斬拌后添加配料，灌入腸衣，經過加熱后得到彈性凝膠體。有不少研究[42-44]表明，冷凍魚糜在凍藏時鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活性隨凍藏時間延長而降低、液滴損失隨凍藏時間延長而增加，這些指標變化通常與魚糜持水性相關聯。從本實驗可以看出，隨著凍藏時間的延長，各組魚糜鹽溶性蛋白含量、凝膠強度、持水性均逐漸下降，可能的原因是蛋白質發生冷凍變性及氧化降解。此外，與空白組相比，EGCG能有效抑制肌球蛋白重鏈、肌動蛋白以及未知名蛋白質（I、II）的降解，肌球蛋白重鏈降解程度與水產品蛋白質冷凍變性程度呈正相關[45]，且當EGCG添加量為0.01%時，效果最佳。

綜上，EGCG在冷凍羅非魚魚糜的凍藏過程中能有效防止蛋白質變性，提高魚糜的品質，有望作為一種新型抗凍劑。但EGCG添加量不宜過大，否則會起相反作用，魚糜中EGCG添加量為0.01%時，肌原纖維鹽溶性蛋白含量下降最少；總巰基含量降低最少；凝膠強度下降最低；持水性下降最低，魚糜還能保持較好品質。今后的研究還需要考察EGCG添加量過大反而會引起魚糜品質劣化的原因，及應用其他新技術分析EGCG對魚糜的抗凍作用機理。