重組漆酶降解黃曲霉毒素B1分子對接分析及產物結構解析

劉英麗，毛慧佳，楊梓妍，萬 真，王 靜*，孫寶國

（北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，中國-加拿大食品營養與健康聯合實驗室（北京），北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是二氫呋喃香豆素的衍生物，是一類主要由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（A. parasiticus）和集峰曲霉（A. nominus）等產生的高毒性的次級代謝產物，具有很強的致癌、致畸和致突變性。目前發現20多種AFs，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2為天然毒素，其他毒素主要由這4 種衍生得到，已經鑒定得到10多種常見的AFs結構。其中，AFB1是自然界發生的最常見的、毒性最強的化學致癌物，被國際腫瘤研究機構劃定為I級致癌物質[1]，并且未規定發全劑量。目前，對AFs的脫除方法有物理脫除（物理吸附、擠壓膨化、輻射處理、微波、等離子體降解等）、化學脫除（臭氧、氨氣熏蒸、生物堿、乳酸等）及生物脫除（生物吸附、生物降解等）等方法，前2 種方法存在效果不穩定、營養成分損失較大以及難以規模化生產等缺點，而生物脫除法由于過程溫和、無營養物質大量流失及本身和降解生成物不會對人畜造成危害等優點受到學者的廣泛關注并展開了諸多研究[2]。

漆酶（EC1.10.3.2）是一種含銅的氧化還原酶，屬藍多銅氧化酶家族，廣泛分布于自然界的昆蟲、高等植物、真菌（擔子菌、子囊菌和半知菌中較多）和細菌中。漆酶具有廣泛的作用底物，能催化酚類、芳胺類、羧酸類、甾體類及其他一些雜環類化合物發生氧化生成水而不產生有害的過氧化氫和活性氧等中間產物。基于此綠色催化特性，漆酶在工業廢水處理[3]、紡織染料漂白[4]、紙漿木質素去除[5]、土壤和水的生物修復[6]等環境生態領域有非常廣泛的應用，在生物燃料電池[7]、生物傳感器[8]、制藥[9]等方面的經濟價值也得到飛速擴展和提升。關于漆酶對AFB1降解的研究卻甚少，且主要集中在降解率的測算上，可達到55%～87.34%[10-11]，然而對生成的代謝物結構的認識并不明確。

隨著漆酶分子生物學研究的不斷深入，近年來一些真菌漆酶的晶體結構相繼被解析，為進一步揭示真菌漆酶的催化機制提供結構基礎。然而晶體的獲得較為復雜，在某些已知漆酶晶體結構的基礎上同源模建可以最大程度上獲得理想的目的蛋白三維結構，而分子對接技術可以將獲得的三維結構分子逐一放在靶標分子的活性位點處，通過模擬小分子配體與生物大分子受體相互作用，預測其結合模式和親和力。分子對接是探索真菌漆酶酶促降解AFB1規律和機制的重要手段，對于預測漆酶降解AFB1效果有重要的意義，而通過實驗制備理論預測效果好的改性漆酶將進一步明晰其催化和降解機制。本研究通過分子對接模擬漆酶與AFB1的結合模式并用實際降解實驗驗證，利用超高效液相色譜-飛行時間串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-f l ight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）分析降解產物結構，進一步豐富AFs解毒機理等相關理論，為漆酶降解AFB1的可行性提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用產重組漆酶LAC3的釀酒酵母菌株由Dr.Thierry Tron’s實驗室贈送。

三氯甲烷（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純） 美國Merda Technology Inc公司；AFB1百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CR22N高速冷凍離心機 日本Himac有限公司；ZWY-200D智誠恒溫振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；HPLC-Triple Q-LC-MS 美國Agilent公司；UPLC-Triple-TOF-MS 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 栓菌漆酶的同源模建

漆酶的目的基因序列通過Uniprot數據庫進一步核實，對應的ID為Q6TH77。通過BLAST選擇了蛋白數據庫PDB中ID為3KW7的漆酶作為模板（氨基酸序列相似性均大于65%），采用MOE v2014.0901軟件進行同源模建。在pH 7和溫度300 K條件下利用LigX優化蛋白質的質子化狀態和氫原子的取方。首先，將目標序列與模板序列比對，并構建10 個獨立的中間模型。這些不同的同源模型是不同環候選物和側鏈旋轉異構體的排列選擇的結果。根據GB/VI的打分函數得分最高的被選為最終的模型，使用AMBER12/EHT高壓力場進一步能量最小化。

1.3.2 AFs三維結構繪制

用ChemBioDraw 2014軟件繪制AFB1二維結構圖，并通過軟件MOE v2014.0901中的Energy Minimize模塊進行能量優化，轉換成三維結構。

1.3.3 漆酶與AFB1分子對接

應用軟件MOE v2014.0901中的Dock模塊，預測AFs和同源模建蛋白漆酶的結合能力。在正式對接之前，選擇AMBER12:EHT力場以及R-field隱式溶劑模型。對接流程采用柔性的induced fit模式，受體結合口袋氨基酸的側鏈可根據配體構象進行優化調整，約束側鏈轉動的權重設置為10。AFs的結合模式首先通過London dG打分函數進行排序，前30 個構象通過進一步力場優化和GBVI/WSA dG方法進行再次評價。采用最佳結合構象模型將配體對接到漆酶的活性位點，根據對接分數、氫鍵作用和關鍵氨基酸位點分析對接結果。

1.3.4 AFs標準溶液的制備

分別準確稱量1 mg的AFB1標準品，溶解于1 mL色譜級甲醇中，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，并進行梯度稀釋，配制成不同質量濃度的標準工作液用于降解實驗和標準曲線的繪制，-20 ℃避光保存，待用。

1.3.5 菌株活化及發酵液制備

菌株活化培養基（S-Gal平板）：酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7 g/L，酪蛋白氨基酸5 g/L，琥珀酸緩沖液50 mmol/L（pH 5.3），半乳糖6.7 g/L，色氨酸40 mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80 mg/L，硫酸銅100 μmol/L，愈創木酚0.02%，瓊脂15 g/L。

漆酶發酵培養基（S-Gal）：酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7 g/L，酪蛋白氨基酸5 g/L，琥珀酸緩沖液50 mmol/L（pH 5.3），半乳糖6.7 g/L，色氨酸40 mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80 mg/L，硫酸銅100 μmol/L。

將菌株轉接到S-Gal平板上，28 ℃恒溫培養2～3 d，進行活化。將產漆酶的釀酒酵母菌株接種到裝有S-Gal培養基的錐形瓶中，置于30 ℃、160 r/min搖床培養4 d，進行液體發酵培養。在8 000 r/min條件下離心30 min沉淀菌體，上清液即為漆酶粗酶液，并根據Liu Yingli等[12]的方法進行漆酶純化。

1.3.6 漆酶活力檢測

根據呂春鶴等[13]提供的方法并進行改進測定漆酶活力。在30 ℃、420 nm波長下連續監測2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）的氧化速率，在石英比色皿中分別加入pH 4.0的0.04 mol/L Britton-Robison緩沖液和0.5 mmol/L的ABTS溶液，漆酶1 min氧化1 μmol底物定義為1 個活力單位。

1.3.7 漆酶與AFs作用的降解條件

孵育時間對AFs降解率的影響：將酶活力為3 U的漆酶與10 μL 0.1 mg/mL的AFB1標準溶液渦旋振蕩混勻，置于30 ℃、200 r/min分別孵育12、24、36、48 h和60 h。對照組為加入同等體積的pH 5.7的0.1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），其他條件相同。

孵育溫度對AFs降解率的影響：將酶活力為3 U的漆酶與10 μL 0.1 mg/mL的AFB1標準溶液渦旋振蕩混勻，分別置于25、30、35、40 ℃和45 ℃溫度下，200 r/min孵育12 h。對照組為加入同等體積的pH 5.7的0.1 mol/L的PBS，其他條件相同。

酶活力對AFs降解率的影響：將酶活力分別為1、2、3、4 U和5 U的漆酶分別與10 μL 0.1 mg/mL的AFB1標準溶液渦旋振蕩混勻，30 ℃、200 r/min孵育12 h。對照組為加入同等體積的pH 5.7的0.1 mol/L的PBS，其他條件相同。所有實驗重復3 次，降解率按式（1）計算：

式中：A為AFs的初始質量/μg；B為AFs的殘留質量/μg。

1.3.8 AFs的提取

將經過1.3.7節處理的樣品12 000 r/min離心30 s，使管壁上的發酵液離心至管底部，并轉移至10 mL的具塞玻璃管中，方玻璃管中加入等體積的三氯甲烷（在通風處進行），渦旋振蕩10 min使其充分混勻，然后倒入離心管中，靜置30 min分層，取上層液體于玻璃管中，加入等體積三氯甲烷，吸取下層有機相清液于離心管中，相同操作重復3 次。合并3 次有機相于氮吹管中，于45 ℃氮氣吹干。再用甲醇溶液溶解出AFs，并用0.22 μm濾膜過濾。

1.3.9 HPLC-MS/MS檢測AFs及標準曲線的繪制

配制的毒素標準溶液和提取的毒素溶液均用0.22 μm濾膜過濾至液相小瓶中。

HPLC條件：液相模塊為發捷倫1260 Infinity；Inertsil ODS-3 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流速0.2 mL/min；進樣量5 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇-水（3∶7，V/V）；分析時間30 min；檢測溫度30 ℃。

MS/MS條件：電噴霧離子源；監測模式：多反應監測；離子源溫度300 ℃；錐孔電壓15 psi；碰撞電壓135 V；碰撞能量30 eV；毛細管電壓4 kV；質量掃描范圍m/z313.0～285.0。

1.3.10 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，以孵育時間、孵育溫度和酶活力作為考察因素，以AFB1降解率為響應值，響應面試驗設計因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used for response surface analysis

1.3.11 AFB1降解產物的測定及結構解析

H P L C條件：Z O R B A X-S B C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）。流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脫程序：40% B，6 min；60% B，維持16 min；100% B，8 min；總共運行30 min。進樣量5 μL，流速0.4 mL/min，柱溫箱30 ℃。

MS條件：霧化氣GS1壓力50 psi；霧化氣GS2壓力50 psi；氣簾氣壓力35 psi；離子源溫度550 ℃；離子源電壓5 500 V；一級掃描去簇電壓100 V；聚焦電壓10 V；質量掃描范圍m/z100～1 500；二級掃描采用TOF MSProduct Ion-IDA模式采集質譜數據，誘導碰撞解離能量分別為20、40 V和60 V，進樣前，用蠕動泵做質量軸校正，使質量軸誤差小于0.002‰。

2 結果與分析

2.1 漆酶的同源模建結果

在本實驗所用漆酶晶體結構未被解析的情況下，利用某些已知漆酶晶體結構的基礎上同源模建可以最大程度上獲得理想的目的蛋白三維結構。利用ChemBioDraw 2014軟件以及MOE v2014.0901軟件繪制并轉換成三維結構，如圖1所示。研究AFs與該酶的結合模式首先需要構建同源模型，結果如表2和圖2所示。圖3分析顯示，99%的漆酶殘基位于蛋白構像的合理區域，這表明本實驗構建的漆酶同源模型符合立體化學規則，具有合理性。

圖1 底物的2D（A）和3D（B）結構圖Fig. 1 2D (A) and 3D (B) structures of ligands

表2 LAC3的同源模建（Trametes sp. C30）Table 2 Homology modeling of LAC3 (Trametes sp. C30)

圖2 漆酶蛋白序列的同源模型（Trametes sp. C30）Fig. 2 Homology models of laccase protein sequences (Trametes sp. C30)

圖3 Ramachandran分析Fig. 3 Ramachandran plot

2.2 漆酶與AFB1的相互作用分析

采用分子對接手段研究AFB1與栓菌漆酶表面的相互作用，旨在分析AFB1與漆酶相互作用模式。為明確漆酶和毒素的結合模式，采用誘導契合的策略，根據配體的構象側鏈受體口袋允許移動適應，將毒素分別對接到漆酶的活性部位，得到漆酶活力位點與配體的結合模式，如圖4所示，對接打分為-6.453 2 kcal/mol。

圖4 AFB1與漆酶LAC3模型的相互作用Fig. 4 Models for the interaction of AFB1 with the laccase LAC3

根據所構建的對接模型，如圖4所示，AFB1上甲氧基的氧原子可作為氫鍵的受體，與漆酶上一個高度保守同時也靠近銅離子（T1 Cu II）位置[14]的His481上氨基酸側鏈形成氫鍵，另外，AFB1呋喃環上的氧原子也可以作為氫鍵的受體，與漆酶Asn288的側鏈形成氫鍵，因此，His481和Asn288是漆酶和AFB1結合時的關鍵氨基酸位點，通過氫鍵相互作用。

酶-配體的結合親和力與其相互作用的效率有關，受到配體的結構特征和扭曲程度以及配體和酶表面之間形狀互補的影響[15-16]。有研究表明氫鍵是酶與配體相互作用的關鍵作用力，參與氫鍵形成的氨基酸殘基被認為是漆酶與小分子配體相互作用的關鍵殘基。其中氧原子與氨基酸殘基形成的氫鍵作用強于碳原子與氨基酸殘基形成的氫鍵，且氫鍵鍵長越短，作用越強。對接模擬研究表明，存在于T1銅配位層中的保守的殘基His481最可能與AFs發生相互作用，形成氫鍵，推測其可以介導氧化過程中的電子轉移[17]，提高電子傳遞效率，從而提高漆酶催化能力。綜合多方面原因造成酶對毒素的作用能力存在差異，表現為對接分數不同。

2.3 各因素對AFB1降解率的影響

圖5 孵育時間（A）、孵育溫度（B）和酶活力（C）對AFB1降解率的影響Fig. 5 Effects of incubation time (A), temperature (B) and enzyme activity (C) on the degradation of AFB1 by the laccase LAC3

由圖5A可以看出，漆酶與AFB1孵育時，當孵育時間在12～24 h內，降解率逐漸升高，時間大于24 h，降解率趨于穩定為90.33%；由圖5B可以看出，在25～30 ℃范圍內，AFB1降解率基本保持不變，在35 ℃達到為大值77.45%，當溫度在35～40 ℃范圍內，降解率降低，當溫度大于40 ℃時，略微升高，與大多數真菌漆酶一樣，LAC3是一種相當耐溫的酶，但是耐熱性是關于曝光時間的函數，當溫度高于40 ℃，該酶在此條件暴露12 h后可能導致失活較快，活性降低；由圖5C可以看出，在實驗條件范圍內，毒素的降解率隨漆酶酶活力的增加而逐漸升高，當酶活力達到3 U時，AFB1的降解率達到峰值74.87%，繼續加大酶量，降解率基本不在增長。

2.4 響應面法優化漆酶降解AFB1條件

在單因素試驗基礎上，選擇孵育時間（A）、孵育溫度（B）、酶活力（C），以AFB1的降解率（Y）為響應值，其中-1、0、1分別代表低、中、高3 個水平，試驗設計與結果見表3。將數據結果進行多元回歸分析，得到回歸方程：

Y=-504.546 00+8.958 88A+22.910 40B+3.402 89C-0.107 58AB-0.005 50AC-0.037 775BC-0.161 33A2-0.267 62B2-0.012 395C2

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

表4 回歸模型的顯著性檢驗Table 4 Analysis of variance for the regression model

由表4可知，模型P值小于0.000 1，表明該模型極顯著，失擬項P值大于0.05，表明失擬項驗證不顯著，說明回歸方程可靠可以用于AFB1最高降解率條件的預測。A和B2對AFB1的降解影響極顯著，A2和C2對AFB1的降解影響顯著，表明孵育時間、孵育溫度和酶活力對AFB1的降解有顯著的影響，影響程度從大到小為孵育時間＞孵育溫度＞酶活力。

2.5 AFB1降解條件的響應面分析

圖6 兩兩交互作用對AFB1降解率影響的等高線和響應面圖Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors on the degradation rate of AFB1

從圖6a可以看出，孵育溫度對應的響應值的曲線陡峭，表明對AFB1降解率影響較大，而孵育時間對應的響應值的曲線相對平緩，表明孵育時間對AFB1降解率的影響不大，孵育時間和孵育溫度的等高線扁平，表明孵育溫度和孵育時間的交互作用對AFB1降解率的影響較大；從圖6b可以看出，酶活力對應的響應值的曲線陡峭，說明對AFB1的降解率影響較大，而孵育時間對應的響應值曲線相對平緩，表明孵育時間對AFB1降解率的影響不大，酶活力和孵育時間的等高線近似圓形，表明酶活力和孵育時間的交互作用對AFB1降解率的影響較小；從圖6c可以看出，酶活力對應的響應值曲線相對較陡，而孵育溫度對應的響應值曲線較平緩，表明酶活力對AFB1降解率影響較大，酶活力和孵育溫度的等高線扁平，表明酶活力和孵育溫度的交互作用對AFB1降解率的影響較大。

2.6 AFB1最優降解條件的確定

由表4可知，二次回歸方程的模型極顯著，且方程的回歸系數R2為0.899 2，因此方程的擬合度高，能夠正確反映AFB1降解率與孵育時間、孵育溫度和酶活力之間的關系，通過Design Expert v8.0.6軟件分析AFB1最大降解率對應的反應條件為孵育時間15.030 h、孵育溫度33.985 ℃、酶活力2.107 U，預測值為91.866%，考慮實際操作，對應的孵育時間15 h、孵育溫度34 ℃、酶活力2 U，得到的AFB1降解率為91.08%，表明AFB1降解率與預測值基本吻合，說明該模型可以預測AFB1最大降解率。

2.7 AFB1降解產物的總離子流色譜

圖7 降解產物總離子流色譜圖Fig. 7 Total ion chromatograms of degradation products

如圖7所示，AFB1經漆酶降解后檢測到4 個新的色譜峰，由峰形和分離度可看出，各產物分離效果較好，且由保留時間不同推測降解產物不同。根據AFB1和降解產物的保留時間判斷5 種物質的極性大小為A＞B＞C＞AFB1＞D。

2.8 AFB1降解產物的分子式及結構分析

為進一步確定4 種降解產物的結構式，利用Q-TOFMS進行分析。在整個反應體系中，AFB1只含C、H、O 3 種元素，酶的本質為蛋白質，利用酶降解則可能引入N元素。利用采集到的各降解產物的質譜數據，分析預測各產物可能的元素組成和分子式，如表5所示。

表5 UPLC-Q-TOF-MS測定AFB1及其降解產物信息Table 5 Parameters for AFB1 and degradation products using UPLC-Q-TOF-MS

AFB1主要由4 個不同的降解作用位點：1）香豆素內酯環不穩定，在外界條件下會脫羰基，丟失—CO[18]。2）能與核酸、蛋白質等結合的呋喃環雙鍵和H2O、H等發生加成反應。3）環戊烯酮環通過加成反應、取代反應影響AFB1的毒性。4）苯環上的—OCH3可以與—OH、H、—CHO發生取代反應。同時，AFB1的部分降解產物之間可以相互轉化。如圖8A所示，降解產物A在碰撞中產生[M+H]+為m/z279.093 2的前體離子，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C16H22O4，同時產生[M+H]+為m/z201.046 5、149.023 6、121.031 1的特征碎片離子。根據二級質譜特征離子m/z149，并利用Scifinder和Reaxy數據庫檢索。由降解產物A的特征碎片離子[M+H]+為m/z149.023 6推測的結構與Samuel等[19]解析出的Pseudomonas putida降解AFB1得到的AFD3產物結構一致，并且經實驗驗證該物質對Hela細胞的毒性遠小于AFB1。如圖8B所示，降解產物B在碰撞中產生[M+H]+為m/z245.128 2的前體離子，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C14H16N2O2，同時產生[M+H]+為m/z217.133 2、120.081 1、154.073 5、70.068 0的特征碎片離子。根據二級質譜特征離子m/z271，推測該化合物結構中存在一個羰基，并利用Scifinder和Reaxy數據庫檢索。如圖8C所示，降解產物A在碰撞中產生[M+H]+為m/z197.114 5的前體離子，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C7H12N6O，同時產生[M+H]+為m/z70.067 8的特征碎片離子。根據二級質譜特征離子，推測該化合物中有吡咯烷結構，并利用Scifinder和Reaxy數據庫檢索。如圖8D所示，降解產物C在碰撞中產生[M+H]+為m/z415.242 7的前體離子，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C24H30O6，同時產生[M+H]+為m/z397.145 5、109.086 3的特征碎片離子。根據二級質譜特征離子m/z397和m/z109，推測該化合物結構中存在一個羥基和苯甲醇結構單元，并利用Scifinder和Reaxy數據庫檢索。AFB1經漆酶降解后的各產物結構見圖9。

圖8 AFB1降解產物主要離子碎片生成示意圖Fig. 8 Pathways of main fragment ions from degradation products of AFB1

圖9 漆酶降解AFB1產物結構Fig. 9 Structures of AFB1 degradation products

有研究表明連續損失—CO是AFB1的主要的碎裂途徑，苯環上的甲氧基也會發生甲苯和甲醇丟失[20]。根據降解方式的不同，AFB1可發生羥基化、環氧化、還原和脫氫等反應。AFB1的微生物降解主要涉及毒素呋喃環或香豆素內酯環結構的修飾，這2 種結構是AFB1具有高致癌性和高毒性的主要原因。Wang Jianqiao等[21]首次報道錳過氧化物酶可以通過將AFB1轉化為AFB1-8,9-二氫二醇而有效去除AFB1的誘變活性。Li Jianlong等[22]利用耐鹽Candida versatilis CGMCC 3790降解AFB1得到4 種降解產物，推測AFB1有2 種降解途徑，一種是內酯環和苯環被水解，另一種是通過加氫破壞內酯環的酯鍵和醚鍵。Samuel等[19]發現AFB1的呋喃環、內酯羰基和環戊烯酮環被Pseudomonas putida修飾、破壞而轉化成不同結構的化合物。Afsharmanesh等[23]發現F420H2還原酶可以催化α-和β-不飽和酯部分的雙鍵還原，BacC氧化還原酶可以催化香豆素內酯環雙鍵水解產生羧酸，隨后發生脫羧基反應生成產物。

酶降解體系復雜，漆酶在整個體系中發揮催化作用，裂解成包含—NH2、R—NH2等官能團的小分子多肽、氨基酸等化合物，可以與AFB1的活性位點發生加成、取代等一系列反應，因此AFB1的降解路徑較為復雜。本實驗得到的4 種降解產物均不含呋喃環雙鍵、香豆素內酯環和環戊酮烯環，且所含雙鍵數量均小于AFB1，可能在AFB1分子的上述毒性部位通過加成、取代或氧化反應產生了新的支鏈。降解產物A（C16H22O4）比AFB1少一個—CO2，多10 個H，推測可能為AFB1丟失—CO后發生脫羰基反應，結構中的雙鍵與H原子發生加成。降解產物B（C7H12N6O）和C（C14H16N2O2）均含有N元素，可能是體系中的含N小分子化合物參與反應，且發現相近的裂解碎片，推測可能為AFB1發生連續的—CO丟失后，與H2O和—NH2發生加成和取代反應，生成產物C和D。推測降解產物D（C24H30O6）的生成途徑為呋喃環雙鍵發生加成反應而斷裂，連續丟失—CO，雙鍵與H2O和H發生加成反應。

AFs的毒性和致癌機制已經被廣泛研究，主要與二氫呋喃環和香豆素結構有關，通過對本研究降解產物結構的分析，發現呋喃環雙鍵和香豆素內酯環均被破壞，因此推測漆酶降解AFB1得到的產物毒性顯著低于親本毒素。也有研究表明AFB1經漆酶處理后，呋喃環雙鍵或內酯環裂解，產物的熒光性和誘變性減弱，且未檢測到與AFB1相近的結構類似物[24-25]。但是由于漆酶的來源、降解條件存在差異性，也可能造成降價產物的毒性存在差異，需要進行體外細胞毒性、遺傳毒性實驗以及體內動物實驗進一步驗證，評估降解產物的發全性。

3 討 論

本研究選擇與栓菌漆酶lac3基因同源性最高的3KW7作為模板進行同源模建，將AFB1對接到漆酶的活性部位，結果顯示漆酶與AFB1可以相互作用，氫鍵是關鍵作用力，表明漆酶可用于AFs的降解。通過實際的降解實驗驗證，響應面優化獲得AFB1降解率最優的條件為應時間15 h，孵育溫度34 ℃，酶活力2 U，降解率可達91.08%。在此條件下利用UPLC-Q-TOF-MS分析AFB1降解產物結構，發現4 個主要降解產物，根據其二級質譜信息和精確分子質量，推測出降解產物的分子式分別為C16H22O4、C14H16N2O2、C7H12N6O和C24H30O6。

本實驗只針對最優降解條件下產物的生成途徑及結構進行解析，對于不同降解條件下產物的差異性未進行探討，蛋白酶的來源及作用時間、溫度和酶活力等外界因素可能會影響降解途徑及產物結構，需進一步進行分析研究。國外對黃曲霉生物脫除的研究較多集中在乳酸菌、放線菌和一些真菌中如樹狀指孢霉（Dactylium dendroide）[26]、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）[27]、糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）[28]、莖點霉（Phoma sp.）[29]、白腐菌變色栓菌（Trametes versicolor）[30]等。對乳酸菌的研究多數認為乳酸菌降解AFB1是通過生物吸附作用，Eshelli等[31]研究了放線菌對AFB1降解推斷其降解途徑可能和脂肪酸及糖酵解中間產物的累積有關，而對真菌的研究表明其對AFB1的降解多數為生物降解，主要通過微生物分泌蛋白酶的酶促反應；如左振宇[32]、丁煒[33]、Guan Shu[34]、楊文華[35]等分別從真菌假蜜環菌（Armillariella tabescens）、黏細菌（Myxococcus fulvus）、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）F4中得到了能降解AFs的蛋白酶，前兩者還嘗試了其在大腸桿菌和畢赤酵母中進行表達，并進行一些酶學基本性質的分析。總的來說，目前已經發現能使AFs含量降低包括細菌、真菌和酵母菌在內的大約有上千種微生物，但是多數的研究主要側重在AFs降解菌株的篩選和粗提液降解能力的分析上，對于不同微生物來源的蛋白酶的性質、結構和底物作用模式、降解機理、產物結構及降解產物毒性的認識仍缺乏深入的研究與探討。這可能與微生物產酶量低，分離純化困難，酶性質不穩定及作用條件苛刻等原因有關。但隨著生物化學、分子生物學、基因工程及酶工程等技術的發展成熟，人們對酶的認識越來越清晰，重組載體構建、異源表達、電子自旋共振、同源模建、分子模擬、晶體結構解析等手段的建立使上述研究過程中的瓶頸可能得以突破，有更多的手段和方法解析問題背后的本質。