重組漆酶降解黃曲霉毒素B1分子對(duì)接分析及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析

劉英麗，毛慧佳，楊梓妍，萬 真，王 靜*，孫寶國(guó)

（北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國(guó)-加拿大食品營(yíng)養(yǎng)與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（北京），北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是二氫呋喃香豆素的衍生物，是一類主要由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（A. parasiticus）和集峰曲霉（A. nominus）等產(chǎn)生的高毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的致癌、致畸和致突變性。目前發(fā)現(xiàn)20多種AFs，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2為天然毒素，其他毒素主要由這4 種衍生得到，已經(jīng)鑒定得到10多種常見的AFs結(jié)構(gòu)。其中，AFB1是自然界發(fā)生的最常見的、毒性最強(qiáng)的化學(xué)致癌物，被國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)劃定為I級(jí)致癌物質(zhì)[1]，并且未規(guī)定發(fā)全劑量。目前，對(duì)AFs的脫除方法有物理脫除（物理吸附、擠壓膨化、輻射處理、微波、等離子體降解等）、化學(xué)脫除（臭氧、氨氣熏蒸、生物堿、乳酸等）及生物脫除（生物吸附、生物降解等）等方法，前2 種方法存在效果不穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)成分損失較大以及難以規(guī)模化生產(chǎn)等缺點(diǎn)，而生物脫除法由于過程溫和、無營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量流失及本身和降解生成物不會(huì)對(duì)人畜造成危害等優(yōu)點(diǎn)受到學(xué)者的廣泛關(guān)注并展開了諸多研究[2]。

漆酶（EC1.10.3.2）是一種含銅的氧化還原酶，屬藍(lán)多銅氧化酶家族，廣泛分布于自然界的昆蟲、高等植物、真菌（擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌中較多）和細(xì)菌中。漆酶具有廣泛的作用底物，能催化酚類、芳胺類、羧酸類、甾體類及其他一些雜環(huán)類化合物發(fā)生氧化生成水而不產(chǎn)生有害的過氧化氫和活性氧等中間產(chǎn)物。基于此綠色催化特性，漆酶在工業(yè)廢水處理[3]、紡織染料漂白[4]、紙漿木質(zhì)素去除[5]、土壤和水的生物修復(fù)[6]等環(huán)境生態(tài)領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用，在生物燃料電池[7]、生物傳感器[8]、制藥[9]等方面的經(jīng)濟(jì)價(jià)值也得到飛速擴(kuò)展和提升。關(guān)于漆酶對(duì)AFB1降解的研究卻甚少，且主要集中在降解率的測(cè)算上，可達(dá)到55%～87.34%[10-11]，然而對(duì)生成的代謝物結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)并不明確。

隨著漆酶分子生物學(xué)研究的不斷深入，近年來一些真菌漆酶的晶體結(jié)構(gòu)相繼被解析，為進(jìn)一步揭示真菌漆酶的催化機(jī)制提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。然而晶體的獲得較為復(fù)雜，在某些已知漆酶晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上同源模建可以最大程度上獲得理想的目的蛋白三維結(jié)構(gòu)，而分子對(duì)接技術(shù)可以將獲得的三維結(jié)構(gòu)分子逐一放在靶標(biāo)分子的活性位點(diǎn)處，通過模擬小分子配體與生物大分子受體相互作用，預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親和力。分子對(duì)接是探索真菌漆酶酶促降解AFB1規(guī)律和機(jī)制的重要手段，對(duì)于預(yù)測(cè)漆酶降解AFB1效果有重要的意義，而通過實(shí)驗(yàn)制備理論預(yù)測(cè)效果好的改性漆酶將進(jìn)一步明晰其催化和降解機(jī)制。本研究通過分子對(duì)接模擬漆酶與AFB1的結(jié)合模式并用實(shí)際降解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，利用超高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-f l ight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）分析降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步豐富AFs解毒機(jī)理等相關(guān)理論，為漆酶降解AFB1的可行性提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用產(chǎn)重組漆酶LAC3的釀酒酵母菌株由Dr.Thierry Tron’s實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

三氯甲烷（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Merda Technology Inc公司；AFB1百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本Himac有限公司；ZWY-200D智誠(chéng)恒溫振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；HPLC-Triple Q-LC-MS 美國(guó)Agilent公司；UPLC-Triple-TOF-MS 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 栓菌漆酶的同源模建

漆酶的目的基因序列通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步核實(shí)，對(duì)應(yīng)的ID為Q6TH77。通過BLAST選擇了蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)PDB中ID為3KW7的漆酶作為模板（氨基酸序列相似性均大于65%），采用MOE v2014.0901軟件進(jìn)行同源模建。在pH 7和溫度300 K條件下利用LigX優(yōu)化蛋白質(zhì)的質(zhì)子化狀態(tài)和氫原子的取方。首先，將目標(biāo)序列與模板序列比對(duì)，并構(gòu)建10 個(gè)獨(dú)立的中間模型。這些不同的同源模型是不同環(huán)候選物和側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的排列選擇的結(jié)果。根據(jù)GB/VI的打分函數(shù)得分最高的被選為最終的模型，使用AMBER12/EHT高壓力場(chǎng)進(jìn)一步能量最小化。

1.3.2 AFs三維結(jié)構(gòu)繪制

用ChemBioDraw 2014軟件繪制AFB1二維結(jié)構(gòu)圖，并通過軟件MOE v2014.0901中的Energy Minimize模塊進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)。

1.3.3 漆酶與AFB1分子對(duì)接

應(yīng)用軟件MOE v2014.0901中的Dock模塊，預(yù)測(cè)AFs和同源模建蛋白漆酶的結(jié)合能力。在正式對(duì)接之前，選擇AMBER12:EHT力場(chǎng)以及R-field隱式溶劑模型。對(duì)接流程采用柔性的induced fit模式，受體結(jié)合口袋氨基酸的側(cè)鏈可根據(jù)配體構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，約束側(cè)鏈轉(zhuǎn)動(dòng)的權(quán)重設(shè)置為10。AFs的結(jié)合模式首先通過London dG打分函數(shù)進(jìn)行排序，前30 個(gè)構(gòu)象通過進(jìn)一步力場(chǎng)優(yōu)化和GBVI/WSA dG方法進(jìn)行再次評(píng)價(jià)。采用最佳結(jié)合構(gòu)象模型將配體對(duì)接到漆酶的活性位點(diǎn)，根據(jù)對(duì)接分?jǐn)?shù)、氫鍵作用和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析對(duì)接結(jié)果。

1.3.4 AFs標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱量1 mg的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于1 mL色譜級(jí)甲醇中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并進(jìn)行梯度稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液用于降解實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，-20 ℃避光保存，待用。

1.3.5 菌株活化及發(fā)酵液制備

菌株活化培養(yǎng)基（S-Gal平板）：酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7 g/L，酪蛋白氨基酸5 g/L，琥珀酸緩沖液50 mmol/L（pH 5.3），半乳糖6.7 g/L，色氨酸40 mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80 mg/L，硫酸銅100 μmol/L，愈創(chuàng)木酚0.02%，瓊脂15 g/L。

漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基（S-Gal）：酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7 g/L，酪蛋白氨基酸5 g/L，琥珀酸緩沖液50 mmol/L（pH 5.3），半乳糖6.7 g/L，色氨酸40 mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80 mg/L，硫酸銅100 μmol/L。

將菌株轉(zhuǎn)接到S-Gal平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，進(jìn)行活化。將產(chǎn)漆酶的釀酒酵母菌株接種到裝有S-Gal培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)4 d，進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。在8 000 r/min條件下離心30 min沉淀菌體，上清液即為漆酶粗酶液，并根據(jù)Liu Yingli等[12]的方法進(jìn)行漆酶純化。

1.3.6 漆酶活力檢測(cè)

根據(jù)呂春鶴等[13]提供的方法并進(jìn)行改進(jìn)測(cè)定漆酶活力。在30 ℃、420 nm波長(zhǎng)下連續(xù)監(jiān)測(cè)2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）的氧化速率，在石英比色皿中分別加入pH 4.0的0.04 mol/L Britton-Robison緩沖液和0.5 mmol/L的ABTS溶液，漆酶1 min氧化1 μmol底物定義為1 個(gè)活力單位。

1.3.7 漆酶與AFs作用的降解條件

孵育時(shí)間對(duì)AFs降解率的影響：將酶活力為3 U的漆酶與10 μL 0.1 mg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩混勻，置于30 ℃、200 r/min分別孵育12、24、36、48 h和60 h。對(duì)照組為加入同等體積的pH 5.7的0.1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），其他條件相同。

孵育溫度對(duì)AFs降解率的影響：將酶活力為3 U的漆酶與10 μL 0.1 mg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩混勻，分別置于25、30、35、40 ℃和45 ℃溫度下，200 r/min孵育12 h。對(duì)照組為加入同等體積的pH 5.7的0.1 mol/L的PBS，其他條件相同。

酶活力對(duì)AFs降解率的影響：將酶活力分別為1、2、3、4 U和5 U的漆酶分別與10 μL 0.1 mg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩混勻，30 ℃、200 r/min孵育12 h。對(duì)照組為加入同等體積的pH 5.7的0.1 mol/L的PBS，其他條件相同。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，降解率按式（1）計(jì)算：

式中：A為AFs的初始質(zhì)量/μg；B為AFs的殘留質(zhì)量/μg。

1.3.8 AFs的提取

將經(jīng)過1.3.7節(jié)處理的樣品12 000 r/min離心30 s，使管壁上的發(fā)酵液離心至管底部，并轉(zhuǎn)移至10 mL的具塞玻璃管中，方玻璃管中加入等體積的三氯甲烷（在通風(fēng)處進(jìn)行），渦旋振蕩10 min使其充分混勻，然后倒入離心管中，靜置30 min分層，取上層液體于玻璃管中，加入等體積三氯甲烷，吸取下層有機(jī)相清液于離心管中，相同操作重復(fù)3 次。合并3 次有機(jī)相于氮吹管中，于45 ℃氮?dú)獯蹈?。再用甲醇溶液溶解出AFs，并用0.22 μm濾膜過濾。

1.3.9 HPLC-MS/MS檢測(cè)AFs及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制的毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取的毒素溶液均用0.22 μm濾膜過濾至液相小瓶中。

HPLC條件：液相模塊為發(fā)捷倫1260 Infinity；Inertsil ODS-3 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇-水（3∶7，V/V）；分析時(shí)間30 min；檢測(cè)溫度30 ℃。

MS/MS條件：電噴霧離子源；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源溫度300 ℃；錐孔電壓15 psi；碰撞電壓135 V；碰撞能量30 eV；毛細(xì)管電壓4 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z313.0～285.0。

1.3.10 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以孵育時(shí)間、孵育溫度和酶活力作為考察因素，以AFB1降解率為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used for response surface analysis

1.3.11 AFB1降解產(chǎn)物的測(cè)定及結(jié)構(gòu)解析

H P L C條件：Z O R B A X-S B C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脫程序：40% B，6 min；60% B，維持16 min；100% B，8 min；總共運(yùn)行30 min。進(jìn)樣量5 μL，流速0.4 mL/min，柱溫箱30 ℃。

MS條件：霧化氣GS1壓力50 psi；霧化氣GS2壓力50 psi；氣簾氣壓力35 psi；離子源溫度550 ℃；離子源電壓5 500 V；一級(jí)掃描去簇電壓100 V；聚焦電壓10 V；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；二級(jí)掃描采用TOF MSProduct Ion-IDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，誘導(dǎo)碰撞解離能量分別為20、40 V和60 V，進(jìn)樣前，用蠕動(dòng)泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于0.002‰。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶的同源模建結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)所用漆酶晶體結(jié)構(gòu)未被解析的情況下，利用某些已知漆酶晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上同源模建可以最大程度上獲得理想的目的蛋白三維結(jié)構(gòu)。利用ChemBioDraw 2014軟件以及MOE v2014.0901軟件繪制并轉(zhuǎn)換成三維結(jié)構(gòu)，如圖1所示。研究AFs與該酶的結(jié)合模式首先需要構(gòu)建同源模型，結(jié)果如表2和圖2所示。圖3分析顯示，99%的漆酶殘基位于蛋白構(gòu)像的合理區(qū)域，這表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的漆酶同源模型符合立體化學(xué)規(guī)則，具有合理性。

圖1 底物的2D（A）和3D（B）結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 2D (A) and 3D (B) structures of ligands

表2 LAC3的同源模建（Trametes sp. C30）Table 2 Homology modeling of LAC3 (Trametes sp. C30)

圖2 漆酶蛋白序列的同源模型（Trametes sp. C30）Fig. 2 Homology models of laccase protein sequences (Trametes sp. C30)

圖3 Ramachandran分析Fig. 3 Ramachandran plot

2.2 漆酶與AFB1的相互作用分析

采用分子對(duì)接手段研究AFB1與栓菌漆酶表面的相互作用，旨在分析AFB1與漆酶相互作用模式。為明確漆酶和毒素的結(jié)合模式，采用誘導(dǎo)契合的策略，根據(jù)配體的構(gòu)象側(cè)鏈?zhǔn)荏w口袋允許移動(dòng)適應(yīng)，將毒素分別對(duì)接到漆酶的活性部位，得到漆酶活力位點(diǎn)與配體的結(jié)合模式，如圖4所示，對(duì)接打分為-6.453 2 kcal/mol。

圖4 AFB1與漆酶LAC3模型的相互作用Fig. 4 Models for the interaction of AFB1 with the laccase LAC3

根據(jù)所構(gòu)建的對(duì)接模型，如圖4所示，AFB1上甲氧基的氧原子可作為氫鍵的受體，與漆酶上一個(gè)高度保守同時(shí)也靠近銅離子（T1 Cu II）位置[14]的His481上氨基酸側(cè)鏈形成氫鍵，另外，AFB1呋喃環(huán)上的氧原子也可以作為氫鍵的受體，與漆酶Asn288的側(cè)鏈形成氫鍵，因此，His481和Asn288是漆酶和AFB1結(jié)合時(shí)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，通過氫鍵相互作用。

酶-配體的結(jié)合親和力與其相互作用的效率有關(guān)，受到配體的結(jié)構(gòu)特征和扭曲程度以及配體和酶表面之間形狀互補(bǔ)的影響[15-16]。有研究表明氫鍵是酶與配體相互作用的關(guān)鍵作用力，參與氫鍵形成的氨基酸殘基被認(rèn)為是漆酶與小分子配體相互作用的關(guān)鍵殘基。其中氧原子與氨基酸殘基形成的氫鍵作用強(qiáng)于碳原子與氨基酸殘基形成的氫鍵，且氫鍵鍵長(zhǎng)越短，作用越強(qiáng)。對(duì)接模擬研究表明，存在于T1銅配位層中的保守的殘基His481最可能與AFs發(fā)生相互作用，形成氫鍵，推測(cè)其可以介導(dǎo)氧化過程中的電子轉(zhuǎn)移[17]，提高電子傳遞效率，從而提高漆酶催化能力。綜合多方面原因造成酶對(duì)毒素的作用能力存在差異，表現(xiàn)為對(duì)接分?jǐn)?shù)不同。

2.3 各因素對(duì)AFB1降解率的影響

圖5 孵育時(shí)間（A）、孵育溫度（B）和酶活力（C）對(duì)AFB1降解率的影響Fig. 5 Effects of incubation time (A), temperature (B) and enzyme activity (C) on the degradation of AFB1 by the laccase LAC3

由圖5A可以看出，漆酶與AFB1孵育時(shí)，當(dāng)孵育時(shí)間在12～24 h內(nèi)，降解率逐漸升高，時(shí)間大于24 h，降解率趨于穩(wěn)定為90.33%；由圖5B可以看出，在25～30 ℃范圍內(nèi)，AFB1降解率基本保持不變，在35 ℃達(dá)到為大值77.45%，當(dāng)溫度在35～40 ℃范圍內(nèi)，降解率降低，當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí)，略微升高，與大多數(shù)真菌漆酶一樣，LAC3是一種相當(dāng)耐溫的酶，但是耐熱性是關(guān)于曝光時(shí)間的函數(shù)，當(dāng)溫度高于40 ℃，該酶在此條件暴露12 h后可能導(dǎo)致失活較快，活性降低；由圖5C可以看出，在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，毒素的降解率隨漆酶酶活力的增加而逐漸升高，當(dāng)酶活力達(dá)到3 U時(shí)，AFB1的降解率達(dá)到峰值74.87%，繼續(xù)加大酶量，降解率基本不在增長(zhǎng)。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化漆酶降解AFB1條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇孵育時(shí)間（A）、孵育溫度（B）、酶活力（C），以AFB1的降解率（Y）為響應(yīng)值，其中-1、0、1分別代表低、中、高3 個(gè)水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。將數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到回歸方程：

Y=-504.546 00+8.958 88A+22.910 40B+3.402 89C-0.107 58AB-0.005 50AC-0.037 775BC-0.161 33A2-0.267 62B2-0.012 395C2

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

表4 回歸模型的顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance for the regression model

由表4可知，模型P值小于0.000 1，表明該模型極顯著，失擬項(xiàng)P值大于0.05，表明失擬項(xiàng)驗(yàn)證不顯著，說明回歸方程可靠可以用于AFB1最高降解率條件的預(yù)測(cè)。A和B2對(duì)AFB1的降解影響極顯著，A2和C2對(duì)AFB1的降解影響顯著，表明孵育時(shí)間、孵育溫度和酶活力對(duì)AFB1的降解有顯著的影響，影響程度從大到小為孵育時(shí)間＞孵育溫度＞酶活力。

2.5 AFB1降解條件的響應(yīng)面分析

圖6 兩兩交互作用對(duì)AFB1降解率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors on the degradation rate of AFB1

從圖6a可以看出，孵育溫度對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值的曲線陡峭，表明對(duì)AFB1降解率影響較大，而孵育時(shí)間對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值的曲線相對(duì)平緩，表明孵育時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響不大，孵育時(shí)間和孵育溫度的等高線扁平，表明孵育溫度和孵育時(shí)間的交互作用對(duì)AFB1降解率的影響較大；從圖6b可以看出，酶活力對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值的曲線陡峭，說明對(duì)AFB1的降解率影響較大，而孵育時(shí)間對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值曲線相對(duì)平緩，表明孵育時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響不大，酶活力和孵育時(shí)間的等高線近似圓形，表明酶活力和孵育時(shí)間的交互作用對(duì)AFB1降解率的影響較?。粡膱D6c可以看出，酶活力對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值曲線相對(duì)較陡，而孵育溫度對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值曲線較平緩，表明酶活力對(duì)AFB1降解率影響較大，酶活力和孵育溫度的等高線扁平，表明酶活力和孵育溫度的交互作用對(duì)AFB1降解率的影響較大。

2.6 AFB1最優(yōu)降解條件的確定

由表4可知，二次回歸方程的模型極顯著，且方程的回歸系數(shù)R2為0.899 2，因此方程的擬合度高，能夠正確反映AFB1降解率與孵育時(shí)間、孵育溫度和酶活力之間的關(guān)系，通過Design Expert v8.0.6軟件分析AFB1最大降解率對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件為孵育時(shí)間15.030 h、孵育溫度33.985 ℃、酶活力2.107 U，預(yù)測(cè)值為91.866%，考慮實(shí)際操作，對(duì)應(yīng)的孵育時(shí)間15 h、孵育溫度34 ℃、酶活力2 U，得到的AFB1降解率為91.08%，表明AFB1降解率與預(yù)測(cè)值基本吻合，說明該模型可以預(yù)測(cè)AFB1最大降解率。

2.7 AFB1降解產(chǎn)物的總離子流色譜

圖7 降解產(chǎn)物總離子流色譜圖Fig. 7 Total ion chromatograms of degradation products

如圖7所示，AFB1經(jīng)漆酶降解后檢測(cè)到4 個(gè)新的色譜峰，由峰形和分離度可看出，各產(chǎn)物分離效果較好，且由保留時(shí)間不同推測(cè)降解產(chǎn)物不同。根據(jù)AFB1和降解產(chǎn)物的保留時(shí)間判斷5 種物質(zhì)的極性大小為A＞B＞C＞AFB1＞D。

2.8 AFB1降解產(chǎn)物的分子式及結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步確定4 種降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式，利用Q-TOFMS進(jìn)行分析。在整個(gè)反應(yīng)體系中，AFB1只含C、H、O 3 種元素，酶的本質(zhì)為蛋白質(zhì)，利用酶降解則可能引入N元素。利用采集到的各降解產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分析預(yù)測(cè)各產(chǎn)物可能的元素組成和分子式，如表5所示。

表5 UPLC-Q-TOF-MS測(cè)定AFB1及其降解產(chǎn)物信息Table 5 Parameters for AFB1 and degradation products using UPLC-Q-TOF-MS

AFB1主要由4 個(gè)不同的降解作用位點(diǎn)：1）香豆素內(nèi)酯環(huán)不穩(wěn)定，在外界條件下會(huì)脫羰基，丟失—CO[18]。2）能與核酸、蛋白質(zhì)等結(jié)合的呋喃環(huán)雙鍵和H2O、H等發(fā)生加成反應(yīng)。3）環(huán)戊烯酮環(huán)通過加成反應(yīng)、取代反應(yīng)影響AFB1的毒性。4）苯環(huán)上的—OCH3可以與—OH、H、—CHO發(fā)生取代反應(yīng)。同時(shí)，AFB1的部分降解產(chǎn)物之間可以相互轉(zhuǎn)化。如圖8A所示，降解產(chǎn)物A在碰撞中產(chǎn)生[M+H]+為m/z279.093 2的前體離子，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C16H22O4，同時(shí)產(chǎn)生[M+H]+為m/z201.046 5、149.023 6、121.031 1的特征碎片離子。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜特征離子m/z149，并利用Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。由降解產(chǎn)物A的特征碎片離子[M+H]+為m/z149.023 6推測(cè)的結(jié)構(gòu)與Samuel等[19]解析出的Pseudomonas putida降解AFB1得到的AFD3產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致，并且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該物質(zhì)對(duì)Hela細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)小于AFB1。如圖8B所示，降解產(chǎn)物B在碰撞中產(chǎn)生[M+H]+為m/z245.128 2的前體離子，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C14H16N2O2，同時(shí)產(chǎn)生[M+H]+為m/z217.133 2、120.081 1、154.073 5、70.068 0的特征碎片離子。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜特征離子m/z271，推測(cè)該化合物結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)羰基，并利用Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。如圖8C所示，降解產(chǎn)物A在碰撞中產(chǎn)生[M+H]+為m/z197.114 5的前體離子，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C7H12N6O，同時(shí)產(chǎn)生[M+H]+為m/z70.067 8的特征碎片離子。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜特征離子，推測(cè)該化合物中有吡咯烷結(jié)構(gòu)，并利用Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。如圖8D所示，降解產(chǎn)物C在碰撞中產(chǎn)生[M+H]+為m/z415.242 7的前體離子，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C24H30O6，同時(shí)產(chǎn)生[M+H]+為m/z397.145 5、109.086 3的特征碎片離子。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜特征離子m/z397和m/z109，推測(cè)該化合物結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)羥基和苯甲醇結(jié)構(gòu)單元，并利用Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。AFB1經(jīng)漆酶降解后的各產(chǎn)物結(jié)構(gòu)見圖9。

圖8 AFB1降解產(chǎn)物主要離子碎片生成示意圖Fig. 8 Pathways of main fragment ions from degradation products of AFB1

圖9 漆酶降解AFB1產(chǎn)物結(jié)構(gòu)Fig. 9 Structures of AFB1 degradation products

有研究表明連續(xù)損失—CO是AFB1的主要的碎裂途徑，苯環(huán)上的甲氧基也會(huì)發(fā)生甲苯和甲醇丟失[20]。根據(jù)降解方式的不同，AFB1可發(fā)生羥基化、環(huán)氧化、還原和脫氫等反應(yīng)。AFB1的微生物降解主要涉及毒素呋喃環(huán)或香豆素內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的修飾，這2 種結(jié)構(gòu)是AFB1具有高致癌性和高毒性的主要原因。Wang Jianqiao等[21]首次報(bào)道錳過氧化物酶可以通過將AFB1轉(zhuǎn)化為AFB1-8,9-二氫二醇而有效去除AFB1的誘變活性。Li Jianlong等[22]利用耐鹽Candida versatilis CGMCC 3790降解AFB1得到4 種降解產(chǎn)物，推測(cè)AFB1有2 種降解途徑，一種是內(nèi)酯環(huán)和苯環(huán)被水解，另一種是通過加氫破壞內(nèi)酯環(huán)的酯鍵和醚鍵。Samuel等[19]發(fā)現(xiàn)AFB1的呋喃環(huán)、內(nèi)酯羰基和環(huán)戊烯酮環(huán)被Pseudomonas putida修飾、破壞而轉(zhuǎn)化成不同結(jié)構(gòu)的化合物。Afsharmanesh等[23]發(fā)現(xiàn)F420H2還原酶可以催化α-和β-不飽和酯部分的雙鍵還原，BacC氧化還原酶可以催化香豆素內(nèi)酯環(huán)雙鍵水解產(chǎn)生羧酸，隨后發(fā)生脫羧基反應(yīng)生成產(chǎn)物。

酶降解體系復(fù)雜，漆酶在整個(gè)體系中發(fā)揮催化作用，裂解成包含—NH2、R—NH2等官能團(tuán)的小分子多肽、氨基酸等化合物，可以與AFB1的活性位點(diǎn)發(fā)生加成、取代等一系列反應(yīng)，因此AFB1的降解路徑較為復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)得到的4 種降解產(chǎn)物均不含呋喃環(huán)雙鍵、香豆素內(nèi)酯環(huán)和環(huán)戊酮烯環(huán)，且所含雙鍵數(shù)量均小于AFB1，可能在AFB1分子的上述毒性部位通過加成、取代或氧化反應(yīng)產(chǎn)生了新的支鏈。降解產(chǎn)物A（C16H22O4）比AFB1少一個(gè)—CO2，多10 個(gè)H，推測(cè)可能為AFB1丟失—CO后發(fā)生脫羰基反應(yīng)，結(jié)構(gòu)中的雙鍵與H原子發(fā)生加成。降解產(chǎn)物B（C7H12N6O）和C（C14H16N2O2）均含有N元素，可能是體系中的含N小分子化合物參與反應(yīng)，且發(fā)現(xiàn)相近的裂解碎片，推測(cè)可能為AFB1發(fā)生連續(xù)的—CO丟失后，與H2O和—NH2發(fā)生加成和取代反應(yīng)，生成產(chǎn)物C和D。推測(cè)降解產(chǎn)物D（C24H30O6）的生成途徑為呋喃環(huán)雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)而斷裂，連續(xù)丟失—CO，雙鍵與H2O和H發(fā)生加成反應(yīng)。

AFs的毒性和致癌機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究，主要與二氫呋喃環(huán)和香豆素結(jié)構(gòu)有關(guān)，通過對(duì)本研究降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)呋喃環(huán)雙鍵和香豆素內(nèi)酯環(huán)均被破壞，因此推測(cè)漆酶降解AFB1得到的產(chǎn)物毒性顯著低于親本毒素。也有研究表明AFB1經(jīng)漆酶處理后，呋喃環(huán)雙鍵或內(nèi)酯環(huán)裂解，產(chǎn)物的熒光性和誘變性減弱，且未檢測(cè)到與AFB1相近的結(jié)構(gòu)類似物[24-25]。但是由于漆酶的來源、降解條件存在差異性，也可能造成降價(jià)產(chǎn)物的毒性存在差異，需要進(jìn)行體外細(xì)胞毒性、遺傳毒性實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，評(píng)估降解產(chǎn)物的發(fā)全性。

3 討 論

本研究選擇與栓菌漆酶lac3基因同源性最高的3KW7作為模板進(jìn)行同源模建，將AFB1對(duì)接到漆酶的活性部位，結(jié)果顯示漆酶與AFB1可以相互作用，氫鍵是關(guān)鍵作用力，表明漆酶可用于AFs的降解。通過實(shí)際的降解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，響應(yīng)面優(yōu)化獲得AFB1降解率最優(yōu)的條件為應(yīng)時(shí)間15 h，孵育溫度34 ℃，酶活力2 U，降解率可達(dá)91.08%。在此條件下利用UPLC-Q-TOF-MS分析AFB1降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)主要降解產(chǎn)物，根據(jù)其二級(jí)質(zhì)譜信息和精確分子質(zhì)量，推測(cè)出降解產(chǎn)物的分子式分別為C16H22O4、C14H16N2O2、C7H12N6O和C24H30O6。

本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)最優(yōu)降解條件下產(chǎn)物的生成途徑及結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，對(duì)于不同降解條件下產(chǎn)物的差異性未進(jìn)行探討，蛋白酶的來源及作用時(shí)間、溫度和酶活力等外界因素可能會(huì)影響降解途徑及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，需進(jìn)一步進(jìn)行分析研究。國(guó)外對(duì)黃曲霉生物脫除的研究較多集中在乳酸菌、放線菌和一些真菌中如樹狀指孢霉（Dactylium dendroide）[26]、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）[27]、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）[28]、莖點(diǎn)霉（Phoma sp.）[29]、白腐菌變色栓菌（Trametes versicolor）[30]等。對(duì)乳酸菌的研究多數(shù)認(rèn)為乳酸菌降解AFB1是通過生物吸附作用，Eshelli等[31]研究了放線菌對(duì)AFB1降解推斷其降解途徑可能和脂肪酸及糖酵解中間產(chǎn)物的累積有關(guān)，而對(duì)真菌的研究表明其對(duì)AFB1的降解多數(shù)為生物降解，主要通過微生物分泌蛋白酶的酶促反應(yīng)；如左振宇[32]、丁煒[33]、Guan Shu[34]、楊文華[35]等分別從真菌假蜜環(huán)菌（Armillariella tabescens）、黏細(xì)菌（Myxococcus fulvus）、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）F4中得到了能降解AFs的蛋白酶，前兩者還嘗試了其在大腸桿菌和畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，并進(jìn)行一些酶學(xué)基本性質(zhì)的分析。總的來說，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能使AFs含量降低包括細(xì)菌、真菌和酵母菌在內(nèi)的大約有上千種微生物，但是多數(shù)的研究主要側(cè)重在AFs降解菌株的篩選和粗提液降解能力的分析上，對(duì)于不同微生物來源的蛋白酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和底物作用模式、降解機(jī)理、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及降解產(chǎn)物毒性的認(rèn)識(shí)仍缺乏深入的研究與探討。這可能與微生物產(chǎn)酶量低，分離純化困難，酶性質(zhì)不穩(wěn)定及作用條件苛刻等原因有關(guān)。但隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程及酶工程等技術(shù)的發(fā)展成熟，人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)越來越清晰，重組載體構(gòu)建、異源表達(dá)、電子自旋共振、同源模建、分子模擬、晶體結(jié)構(gòu)解析等手段的建立使上述研究過程中的瓶頸可能得以突破，有更多的手段和方法解析問題背后的本質(zhì)。