5 株乳酸菌吸附丙烯酰胺穩定性的比較

趙思佳，李 蕊，劉 彤，孫洪洋，沈 玉，趙筱鐸，商佳琦，邵美麗,2,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

日常飲食中，由于生冷食材的貯藏、加工、或者烹飪方式不當會產生一些有害物質，丙烯酰胺（acrylamide，AA）在食品熱加工過程中由天冬酰胺和葡萄糖經美拉德反應形成[1-2]。研究證實AA會對人體和動物產生神經毒性、遺傳毒性、生殖毒性和致癌性，給健康造成極大隱患[3-6]，已被國際癌癥研究機構劃分為2A組致癌物質。因此，人們利用各種物理、化學、生物等方法減少AA含量，或降低其在食品中所帶來的負面影響[7-10]。然而，物理和化學方法具有一定的局限性，例如：某些營養成分可能會喪失，或影響到食品的發全性，或必須用到昂貴的設備[11]。因此，近年來，專家學者對利用生物方法降低有害物質毒性進行了重點探究。

乳酸菌作為生物吸附方法的常用工具不僅應用范圍廣，而且兼具發全高效、生理功能多樣性等明顯優勢。已證實乳酸菌對多種有害物質具有良好的吸附能力。例如嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌對黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素G1具有較好的吸附能力[11-12]；Corassin等[13]發現鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌對黃曲霉毒素M1的吸附率均在11%左右；Abbès等[14]利用副干酪乳桿菌對伏馬菌素B1進行去除，也取得良好效果；Wang Ling等[15]通過實驗證實6 株乳酸菌對棒曲霉毒素具有清除效果；并且一些乳酸菌對許多重金屬[16-18]及其他有害物質[19]也具有較好的吸附作用[20]。

目前有關乳酸菌吸附AA的研究很少。Serrano-Ni?o等[21]認為乳酸菌細胞表面可以與AA單體結合形成比較牢固的網狀基質。Shen Yu等[22]發現乳酸菌細胞比表面積和細胞壁的粗糙程度與其吸附能力密切相關，細胞比表面積大的乳酸菌具有更好的吸附能力，并且AA的吸附率與細胞壁粗糙程度呈正比，細胞壁結構主要由肽聚糖和表面蛋白構成，二者共同影響細胞壁表面粗糙程度。肽聚糖中的3 種官能團（C—O、C＝O、N—H）被認為是細胞壁“高度多孔”的主要因素，增加了細胞壁粗糙程度，從而增強了對AA的吸附能力。Zhang Dan等[23]發現肽聚糖的完整性越高，乳酸菌對AA的吸附率越高，并且肽聚糖中的4 種氨基酸（丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸）總含量與AA吸附率呈正比，同時4 種氨基酸中丙氨酸含量對AA吸附率的影響較為明顯。

盡管少數實驗證實了乳酸菌可以有效吸附AA，并對其吸附機制有了一定的認識，但沒有對乳酸菌的吸附穩定性進行深入研究。而乳酸菌與AA形成的乳酸菌-丙烯酰胺復合物（lactic acid bacteria-acrylamide，LAB-AA）在體內外環境下能否穩定存在則是抑制AA毒性的關鍵環節。因此，本實驗選擇5 株乳酸菌作為研究對象，以AA釋放率為考察指標，比較5 株乳酸菌與AA形成的復合物在無菌去離子水、不同有機溶劑（甲醇、乙腈-水、丙酮）及體外模擬胃、腸道環境下的穩定性，同時比較5 株乳酸菌滅活前后與AA形成復合物的穩定性差異，以期為AA毒性抑制的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌ATCC8014（Lactobacillus plantarum ATCC8014）、植物乳桿菌1.0665（L. plantarum 1.0665）、植物乳桿菌806（L. plantarum 806）、干酪乳桿菌ATCC393（L. casei ATCC393）、嗜酸乳桿菌 KLDS 1.0307（L. acidophilus KLDS 1.0307）均由東北農業大學食品學院菌種庫保存。

1.1.2 試劑

AA標準品（純度≥99%） 美國Amresco公司；甲醇（色譜純） 廣州市健碩科技有限公司；丙酮、乙腈（色譜純） 哈爾濱市志飛生物技術公司；胃蛋白酶、濃硝酸、濃鹽酸、膽鹽、胰蛋白酶 遼寧博雅生物科技有限公司；MRS培養基 常州蘭華試驗試劑公司。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜系統 日本島津公司；GL-21M高速冷凍離心機、HVE-50高壓滅菌鍋 浙江德育制造有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養箱 江蘇中坤儀器廠；DK-98-II恒溫水浴鍋 遼寧大成試驗分析儀器廠；DB-3B電子分析天平 深圳物生生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及菌懸液配制

將實驗用的5 株乳酸菌接種在MRS培養基中于37 ℃培養24 h，并連續活化2 次，培養時間為8～12 h。再將乳酸菌以3%的接種量于MRS培養基中37 ℃培養過夜，8 000×g、4 ℃離心5 min回集沉淀，并用無菌去離子水洗滌2 次，然后將其懸浮在50 mL無菌去離子水中，得到活菌菌懸液。最后，選取一半懸浮液在121 ℃滅活15 min[23]，得到高壓滅活菌的細菌懸浮液。2 種懸浮液分別用于后續實驗。

1.3.2 AA結合實驗

分別在900 μL活菌和滅活組菌懸液中加入100 μL AA（6 μg/mL）溶液，37 ℃培養6 h。8 000×g、4 ℃離心5 min回集上清液，備用。

1.3.3 高效液相色譜法測定乳酸菌對AA吸附率

采用高效液相色譜法，色譜柱為Alltima Inertsil ODSP-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），以5%甲醇溶液為流動相，紫外線檢測器參數設置為205 nm，流速為1 mL/min，注射體積為20 μL。測定所回回上清液中AA含量[23]。以沒有添加菌懸液的AA工作液作為空白對照。乳酸菌對AA的吸附率按式（1）計算：

式中：A0為空白樣液中AA含量；A為加入AA的菌懸液經離心回集的上清液中AA含量。

1.3.4 LAB-AA復合物的體外穩定性分析

為測定LAB-AA復合物的穩定性，將其分別置于無菌去離子水、甲醇、丙酮、乙腈-水（2∶1，V/V）中連續洗滌3 次，8 000×g、4 ℃離心5 min，回集上清液，用高效液相色譜法測定AA釋放率。AA釋放率按式（2）計算：

式中：B為不同洗脫液中AA含量；A0為空白樣液中AA含量；A為加入乳酸菌菌懸液和AA反應后離心回集的上清液中AA含量。

1.3.5 LAB-AA復合物的體內穩定性分析

1.3.5.1 人工模擬胃環境

將10%的鹽酸溶液加入無菌去離子水中，再加入胃蛋白酶，完全溶解后，得到pH值分別為1.5、2.5、3.5的人工胃液，通過0.22 μm濾膜除菌。將活菌和高壓滅活菌的AA復合物分別懸浮在人工胃液中，在37 ℃培養1、2、3 h。然后，將懸浮液8 000×g、4 ℃離心5 min，回集上清液，用高效液相色譜法測定AA釋放量，并計算釋放率。

1.3.5.2 人工模擬腸道環境

將活菌和高壓滅活菌的AA復合物分別懸浮于不同質量分數的膽鹽溶液（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）和10 mg/mL的胰蛋白酶溶液，并調節pH值為6.8。在37 ℃培養3、4、5、6 h，8 000×g、4 ℃離心5 min，回集上清液，用高效液相色譜法測定AA釋放量，并計算釋放率。

1.4 數據處理

每組實驗重復3 次，所有結果表示為 ±s。數據采用SPSS 21.0進行統計分析，采用Origin pro 8.6進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌對AA吸附能力的比較

由圖1可知，當乳酸菌暴露于AA環境中時，5 株高壓滅活菌株均表現出比活菌更高的AA吸附率。其中，植物乳桿菌ATCC8014的高壓滅活組和活菌組對AA的結合能力最高，吸附率分別為96.53%和93.16%，而嗜酸乳桿菌KLDS1.0307的高壓滅活組和活菌組對AA的結合能力最低。這一實驗結果與El-Nezami[24]和Piotrowska[25]等的研究成果相似。Piotrowska等[25]發現了3 種熱滅活乳酸菌的赭曲霉毒素A吸附能力高于活性菌，并提出經高壓滅活后細胞壁結構發生變化，并且通過細胞壁的疏水性，和電子供體-受體相互作用來促進與赭曲霉毒素A的結合。由此可推測，AA與乳酸菌細胞壁結合，且主要與乳酸菌肽聚糖和磷壁酸有關，而高溫處理會影響乳酸菌細胞壁雙層膜結構，并且肽聚糖的交聯被打破，從而導致孔徑增加。因此毒素除與細胞壁結合外，甚至還可以與細胞壁內的原生質膜結合，增加了乳酸菌與AA的結合位點。由此可見，細胞壁結構的改變對高壓滅活乳酸菌吸附能力起到關鍵作用。

圖1 5 株乳酸菌對AA的吸附率Fig. 1 AA adsorption percentages of the five strains of LAB

由圖1可知，無論活菌還是高壓滅活菌，5 株乳酸菌之間吸附率差異性顯著（P＜0.05）。Wang Ling等[15]發現不同乳酸菌與棒曲霉結合率不同，其原因是部分棒曲霉進入乳酸菌肽聚糖層，而不同品種乳酸菌肽聚糖具有不同官能團，導致肽聚糖的疏松程度不同。Zhang Dan等[23]認為，肽聚糖含量的差異也會導致不同菌種的吸附力差異。因此，推測5 株乳酸菌對AA吸附率差異是各自肽聚糖結構及含量不同導致的。

2.2 LAB-AA復合物的體外穩定性

表1 LAB-AA復合物經有機溶劑洗脫的AA釋放率Table 1 Stabilities of the LAB-AA complexes when exposed to organic solvents in vitro

如表1所示，LAB-AA復合物經有機溶劑的3 次洗滌，均沒有AA釋放，說明乳酸菌和AA的結合非常穩定。參考Serrano-Ni?o等[21]的結論可推測，AA單體結合與乳酸菌細胞表面形成比較牢固的網狀基質，因此，LAB-AA復合物具有良好的穩定性。

表2 LAB-AA復合物經無菌去離子水洗脫的AA釋放率Table 2 Stabilities of the LAB-AA complexes when exposed to aseptic deionized water in vitro%

如表2所示，5 株乳酸菌經無菌去離子水第1次洗滌后均有不同程度的釋放，并且高壓滅活菌的釋放率均低于相對應的活菌組。而經無菌去離子水第2次和第3次洗滌后，5 株高壓滅活菌和活菌的AA復合物對AA均不再釋放。且高壓滅活菌株的AA復合物對AA的釋放率范圍為3.59%～35.22%，明顯低于活菌的復合物對AA的釋放率7.34%～53.56%。有研究表明，疏水相互作用在乳酸菌與毒素相結合過程中起到了重要作用[26]。因此可推測，本實驗中復合物水洗液中有少量AA的釋放，是水對AA與乳酸菌之間的疏水作用產生影響而造成的，從而影響LAB-AA復合物穩定性。

2.3 LAB-AA復合物的體內穩定性

2.3.1 人工模擬胃環境

表3 pH值對LAB-AA復合物AA釋放率的影響Table 3 Effect of pH on the stability of the LAB-AA complexes%

由表3可以明顯看出，pH值與作用時間都會對LABAA復合物的穩定性產生影響。無論是高壓滅活組還是活菌組，植物乳桿菌ATCC8014的AA復合物在pH值為1.5、2.5的人工胃液中分別作用1、2 h后，均無AA釋放，說明在此條件下，該復合物是最穩定的；同時，AA釋放量隨著作用時間的延長而增加，當作用時間為3 h時，植物乳桿菌ATCC8014的高壓滅活組復合物的AA釋放率最低。綜上所述，植物乳桿菌ATCC8014的AA復合物在模擬胃環境中穩定性最佳。El-Nezami等[24]認為，pH值對乳酸菌吸附黃曲霉毒素B1的穩定性有影響，相同條件下pH值低則復合物穩定性強，這與本實驗結果一致：在模擬胃環境實驗中，LAB-AA復合物的穩定性受pH值的影響很大，并隨時間而變化。相關研究表明，pH值和作用時間對細菌活力有顯著影響，且據推測，酸處理會降解乳酸菌細胞壁肽聚糖的多糖結構，從而暴露更多結合位點，使乳酸菌與AA結合更加穩定[27]。因此，本實驗認為不同pH值改變了乳酸菌自身活力及其細胞壁結構，從而影響了復合物的穩定性。

2.3.2 人工模擬腸環境

2.3.2.1 膽鹽對復合物穩定性影響

表4 膽鹽對LAB-AA復合物AA釋放率的影響Table 4 Effect of bile salt on the stability of the LAB-AA complexes%

由表4可知，在膽鹽環境中，5 株LAB-AA復合物均能釋放AA，但高壓滅活菌組的LAB-AA復合物的釋放率明顯低于活菌復合物的釋放率。同時，LAB-AA復合物的穩定性受時間和膽鹽質量分數的影響，從整體趨勢看，作用時間越長AA釋放率越高。其中，植物乳桿菌ATCC8014的高壓滅活菌組在0.4%膽鹽條件下3 h內穩定性最佳，AA釋放率僅為5.17%。先前研究發現，高質量分數膽鹽能迅速溶解膜脂類并引起膜蛋白的解離，低質量分數的膽鹽可通過對膜通透性和流動性的影響，從而破壞膜的完整性，并且影響細胞表面的疏水性和電位等物理化學性質[28-30]。因此，膽鹽的這種破壞作用可能影響乳酸菌的蛋白質及膜的結構，從而影響LAB-AA復合物的穩定性。

2.3.2.2 胰蛋白酶對復合物穩定性影響

表5 胰蛋白酶對復合物AA釋放率的影響Table 5 Effect of trypsin on the stability of the LAB-AA complexes%

由表5可知，在胰蛋白酶環境中，5 株乳酸菌的AA復合物均有AA釋放，且作用時間對復合物的AA釋放率影響不大。同樣，高壓滅活組的菌株復合物的穩定性明顯強于活菌組，并且，植物乳桿菌ATCC8014復合物的AA釋放率明顯低于另外4 株乳酸菌復合物，3 h釋放率最低為6.63%，說明其高壓滅活組的復合物在胰蛋白酶環境中穩定性最佳。

Serrano-Ni?o等[21]研究發現丙氨酸是乳酸菌與黃曲霉毒素和AA結合的重要位點。Zhang Dan等[23]也得出相同結論，不僅丙氨酸是乳酸菌和AA的重要結合位點，賴氨酸也在乳酸菌吸附AA的過程中起到關鍵作用。同時，本實驗發現5 株LAB-AA復合物的穩定性受胰蛋白酶的影響，胰蛋白酶可能正是通過作用在賴氨酸的結合位點，破壞乳酸菌和AA的結合，從而對LAB-AA復合物的穩定性產生影響。這一發現可能對乳酸菌在小腸暴露具有潛在的生物學意義，表明LAB-AA復合物可能在腸道內具有穩定性。

3 結 論

本實驗中的5 株乳酸菌株均能有效吸附AA，且高壓滅活菌株吸附AA的能力優于其活菌株。其中植物乳桿菌ATCC8014吸附能力最強，其高壓滅活菌組和活菌組的AA吸附率分別為96.53%和93.16%。5 株乳酸菌與AA形成的復合物在甲醇、丙酮、乙腈-水中均可穩定存在。盡管在第1次無菌去離子水洗滌后，LAB-AA復合物釋放出少量的AA，但第2、3次水洗均無AA釋放，這說明LAB-AA復合物在無菌去離子水中也呈現較為穩定的狀態。此外，通過體外胃腸道模擬實驗發現，LAB-AA復合物穩定性與pH值、膽鹽及作用時間有關，但在胰蛋白酶環境中LAB-AA復合物穩定性稍有減弱，且與作用時間無關。整體看，植物乳桿菌ATCC8014在上述環境中不僅對AA具有最強的吸附能力，而且其復合物也具有非常好的穩定性。本實驗為進一步探究乳酸菌吸附AA的可行性及降低食品中AA對機體危害提供了理論支持。