藍莓采后主要病原菌的分離鑒定及肉桂精油抑菌效果

王 丹，張 靜，賈曉曼，辛 力，翟 浩*

（山東省果樹研究所，山東 泰發 271000）

藍莓（Vaccinium spp.），學名越橘，屬于杜鵑花科越橘屬，為多年生灌木小漿果類果樹。其果實富含花青素、酚酸類等生物抗氧化活性成分，具有預防肥胖、糖尿病、心腦血管疾病、癌癥等慢性病的保健作用[1-2]。由各種真菌病原體引起的采后腐爛是商業藍莓生產中面臨的一個重要問題[3-5]，國內外從采后藍莓果實分離到的主要真菌病原體有炭疽菌屬（Colletotrichum spp.）、鏈格孢菌屬（Alternaria spp.）和葡萄孢菌屬（Botrytis spp.）[6-8]。對藍莓果實采后主要致病菌的分離鑒定，是選擇采后防腐保鮮方法的前提，明確藍莓采后病害種類和防治方法，對于制定有效的防治措施尤為重要。

控制藍莓采后腐爛常見技術有低溫、氣調、采前殺菌劑噴霧、采后化學藥劑浸果等[9-12]，然而這些技術具有一定的局限性，如低溫不能完全防止病原微生物對果實的侵染，尤其是鏈格孢菌屬、葡萄孢菌屬等，且頻繁和高濃度使用化學藥劑會造成其在果實上的殘留量超標而威脅人類的健康。

植物精油是一類具有揮發性的芳香物質，其一般從植物的花、葉、莖、根或果實中，通過水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法或溶劑提取法提煉萃取而得[13]。植物精油作為一種發全的植物源食品保鮮劑，具有抗細菌、抗真菌和抗氧化等作用，作為廣譜殺菌劑，因其作用高效性和長效性，已逐漸應用于食品保鮮中[14-15]。肉桂精油主要功能成分肉桂醛含量在75%以上，殺菌、抗氧化功能顯著[16]。有研究表明肉桂精油對葡萄、番茄、芒果采后貯藏有明顯的保鮮效果[16-18]，但其在藍莓采后病原菌控制方方的研究鮮見報道。

本研究從山東泰發本地產“晚豐”藍莓上分離優勢致病菌，采用傳統形態學鑒定方法結合rDNA-ITS序列分析對病原菌進行分離鑒定，并對其致病性進行測定；進一步研究肉桂精油對藍莓采后主要優勢病原菌的抑菌效果，以期為藍莓采后病害的預測預報和病原菌的綠色防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2018年6月21日，在山東泰發良莊藍莓基地采集藍莓品種“晚豐”，挑選成熟度相同（8～9 成熟）且健康無病的果實，室溫放置，待發病后分離病原菌進行后續實驗。植物精油購自廣州恒信香料有限公司，提取自肉桂樹皮，純度為85%。

1.2 儀器與設備

ChamlGel 6000全自動凝膠成像分析系統 美國Sage Creation公司；GR110DR全自動高壓滅菌鍋 美國Zealway公司；SPX-320生化培養箱 寧波江南儀器廠；S1000聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、PowerPac Basic電泳儀 美國Bio-Rad公司；3730XL全自動DNA測序儀 美國Applied Biosystems公司；SU8020掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的采集與分離純化

參照《植病研究方法》[19]，采用常規組織分離法，對發病果實上的病原菌進行分離，并經單孢分離獲得純培養菌株。

1.3.2 病原菌形態鑒定

將純化菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基，26 ℃恒溫箱培養，待產孢后觀察菌落形態，利用光學顯微鏡記錄孢子形態和結構，并測量孢子大小。

1.3.3 病原菌對藍莓果實的致病性

選擇健康無傷的藍莓果實，將果實表面消毒后，采用針刺法將菌餅接種于果實被刺傷部位。以接種無菌的PDA培養基塊作為對照，在25 ℃恒溫箱中培養7～10 d后觀察發病情況。每種病原菌處理3 個重復，每個重復10 個果實。記錄發病率及病害癥狀。

1.3.4 病原菌rDNA-ITS序列與系統發育分析

利用CTAB法提取菌株DNA，選用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對病原菌進行PCR擴增。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序，測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST比對分析，搜索同源性較高的已知序列，用DNAMAN軟件對已知序列計算相似性；利用MEGA 5.1軟件以鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.5 肉桂精油對3 種病原菌體外抑菌效果

選擇61 mL（直徑75 mm）的培養皿，取一片直徑30 mm的濾紙貼在皿蓋中央，與培養皿一同滅菌后使用。倒入PDA培養基后，用無菌打孔器取直徑7 mm的病原菌菌餅接入，分別取一定量的肉桂精油滴于濾紙片中央，使其含量為15、30、60、90 μL/L，不加精油為對照組。于26 ℃培養5～7 d，每天測量菌落直徑，直徑大小反映菌絲生長速率。肉桂精油的體外抑菌效果可以分別采用菌落直徑與抑菌率表示。48 h內，以菌落直徑7 mm或抑制率100%的最低精油含量為其最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。每個處理4 個重復。抑菌率計算見下式：

1.3.6 掃描電鏡觀察肉桂精油對3 種病原菌菌絲形態的影響

取肉桂精油（25 μL/L）處理和對照菌絲，用2.5%戊二醛溶液固定24 h，然后依次放入到體積分數50%、75%、100%的乙醇溶液各脫水20 min，完成樣品的脫水。采用臨界點干燥法進行樣品的干燥，噴金處理。在掃描電鏡下觀察樣品并進行拍照。

1.4 數據處理

實驗數據用Excel軟件進行計算和作圖，采用SPSS軟件對實驗數據進行方差分析和顯著性檢驗（Duncan新復極差法）。實驗結果用表示。

2 結果與分析

2.1 藍莓采后病原菌的鑒定

2.1.1 病原菌形態鑒定結果

圖1 3 種病原菌菌絲形態特征Fig. 1 Morphological characteristics of hyphae of the three pathogens

圖2 3 種病原菌分生孢子形態特征Fig. 2 Morphological characteristics of conidia of the three pathogens

L1形態特征見圖1a、2a，在PDA培養基上，菌絲白色絨狀，后顏色變為淺灰色，不產色素。小型分生孢子數量多，卵圓形或橢圓形，大小為（5.2～10.6）μm×（2.5～4.4）μm。大型分生孢子月牙形、鐮刀型，稍彎，頂部稍尖，多為3 個隔膜，大小為（11.4～40.2）μm×（2.7～5.5）μm。

L2形態特征見圖1b、2b，在PDA培養基上，菌落初為灰色絨狀，后顏色變為黑色，有同心圈。菌絲透明，有分隔，分生孢子褐色，單生或2～5 個孢子形成短包子鏈。分生孢子頂端微曲，大?。?1.1～33.8）μm×（5.4～9.5）μm，倒棒錘形或卵圓形，有縱橫分隔，縱隔1～3 個，橫隔1～7 個，分隔處縊縮，具有圓錐狀或圓柱狀短喙，喙長4.2～9.1 μm。

L3形態特征見圖1c、2c，在PDA培養基上，菌絲初為白色絨狀，后顏色變為淺褐色，形成黑色菌核。分生孢子梗數根叢生，直立或稍彎曲，具隔膜，頂端呈1～2 次分枝，分枝的末端膨大，上密生小梗，小梗上聚生大量分生孢子。分生孢子卵圓形、橢圓形，無色至淡褐色，單孢，（8.3～11.3）μm×（6.3～10.1）μm。

2.1.2 病原菌的致病性

圖3 人工接種病原菌發病癥狀Fig. 3 Symptoms of blueberry fruit inoculated separately with each of the three pathogens

圖3 結果表明，經針刺接種的藍莓果實均能發病。3～5 d癥狀顯現，7 d后均發病嚴重，與原發病狀較一致，重新分離后，其培養性狀與原菌株相同，而對照處理均不發病。

2.1.3 病原菌rDNA-ITS序列分析

利用真菌通用引物ITS1/ITS4對3 個純化菌株rDNAITS進行PCR擴增，獲得3 個擴增條帶。將測序獲得的序列與NCBI上已知菌株進行BLAST比較，發現所測3 個菌株和已知菌株均有較高的相似性。

2.1.4 rDNA-ITS系統發育分析

將所測序列在GenBank數據庫中進行同源比對，并將3 種病原菌的序列及其相似序列用MEGA 5.2軟件的NJ法構建系統發育樹，以明確病原菌分類地位。

如圖4所示，菌株L1與中國（寄主不詳）的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（KU512835.1）、葡萄牙葡萄寄生菌木賊鐮刀菌（F. equiseti）（MF072591.1）聚為一類，結合孢子的形態特征，將菌株L1鑒定為尖孢鐮刀菌；菌株L2與分離自中國獼猴桃（KX609761.1、KX609766.1、KX609763.1、KX609765.1、KX609764.1），中國無患子（KY213958.1）及印度分離自印度人參（KX494864.1）的鏈格孢菌（Alternaria alternata）聚為一類，結合孢子形態特征，鑒定菌株L2為鏈格孢菌；菌株L3與分離自中國番茄灰霉病的富克葡萄孢盤菌（Botryotinia fuckeliana）（JX875915.1）、意大利（寄主不詳）灰葡萄孢菌（B. cinerea）（KT587323.1）聚在同一枝，結合孢子形態特征，將菌株L3鑒定為灰葡萄孢菌。其中富克葡萄孢盤菌為有性世代，灰葡萄孢菌菌為無性世代。

圖4 基于ITS區序列和鄰接法構建的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree derived from Neighbor-Joining analysis and rDNA ITS domain sequences

2.2 肉桂精油對藍莓采后病原菌的抑菌活性

2.2.1 肉桂精油體外抑菌效果

圖5 不同含量肉桂精油對3 種病原菌的體外熏蒸抑制效果Fig. 5 Inhibitory effects in vitro of cinnamon oil at different concentrations against the three pathogens

從圖5可以看出，肉桂精油對尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌、灰葡萄孢菌的48 h MIC分別為60、30、30 μL/L。熏蒸72 h后，當肉桂精油在60 μL/L和90 μL/L時，與對照組相比，對于3 種病原菌抑菌率均在98%以上。熏蒸96 h后，除尖孢鐮刀菌抑菌率為80%外，對其他兩種病原菌的抑制均在98%以上。

2.2.2 肉桂精油對3 種病原菌菌絲形態變化的影響

圖6 肉桂精油對3 種病原菌菌絲微觀形態的影響Fig. 6 Scanning electron micrographs of the three pathogens treated or not treated with cinnamon oil

對3 個病原菌樣品經臨界點干燥后，進行掃描電鏡觀察，結果見圖6?？梢钥闯?，未用精油處理的3 種菌絲體均生長健康正常，表面光滑飽滿，粗細均勻一致。經肉桂精油（25 μL/L）處理的尖孢鐮刀菌出現強烈變形，皺縮凹陷明顯；經肉桂精油（25 μL/L）處理的鏈格孢菌表面粗糙，有凸起；經肉桂精油（25 μL/L）處理的灰葡萄孢菌菌絲皺縮，不平整，且菌絲之間出現嚴重黏連現象。

3 結論與討論

經形態鑒定、分子生物學鑒定及人工接種實驗，初步確定泰發產區“晚豐”藍莓采后主要病原菌為尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌和灰葡萄孢菌。其中，尖孢鐮刀菌引起的藍莓果實采后病害為國內首次報道，鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的侵染與戴啟東等[20]研究有部分相同之處，但不同地區藍莓采后病原菌種群組成存在差別，是否存在屬內多個種的復合侵染有待于進一步探明。

植物精油是具有揮發性的植物次級代謝產物，廣泛存在于植物的各個部位，其抑菌廣譜性好、對環境危害小，具有較好的發展前景。肉桂精油有效成分為肉桂醛（75%～90%）[21]。有學者指出，肉桂醛能有效抑制真菌繁殖，主要是通過破壞細胞壁，并對細胞內物質造成損壞，進而起到抑菌作用[22]。近年來，肉桂精油在食品防腐及抑制果蔬采后病害發生等方面已有部分研究[16-18]。本研究通過體外熏蒸抑菌實驗，明確了肉桂精油對藍莓采后3 種主要致病菌尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的抑制作用，其48 h內MIC分別為60、30、30 μL/L，但實際效果有待于后續活體實驗驗證，且具體作用濃度需要綜合藍莓對精油的耐受力、精油的其他效應如抗氧化作用以及對采后果實品質的影響等指標進行全面考量。

肉桂精油抑菌效果的研究已有許多相關報道。林樹花等[23]研究了10 種植物精油對藍莓有害真菌及革蘭氏細菌的抑制能力，結果表明肉桂精油對真菌以及革蘭氏陰性和陽性菌均有強烈抑制效果，MIC在0.039 1～0.156 0 μL/mL之間，這與本課題前期優選肉桂精油用于本實驗的結果較為一致。黃文部等[24]選擇6 種精油對莫蘭花貯存期間鏈格孢菌進行抑菌實驗，結果發現肉桂精油抑菌效果最佳，其MIC和最小殺菌濃度分別為0.05 μL/mL和0.15 μL/mL，本實驗肉桂精油對藍莓鏈格孢菌的抑菌效果也較好，MIC為30 μL/L，與文獻濃度略有差異的原因可能是鏈格孢菌種屬差別造成其對抑菌劑耐受力不同，另一方面本實驗采用熏蒸處理，而上述文獻采用的是直接接觸方式，這也是造成有效濃度差異的原因之一。

不同成分組成的精油，采用不同抑菌方式其抑菌機制也不盡相同，進而影響抑菌效果。熏蒸方式主要是精油的揮發性組分接觸菌絲，由于菌絲的親脂性，揮發組分聚集在菌絲上進而起到抑菌作用。而直接接觸方式則是精油中所有成分均可直接接觸到菌絲[25]。劉瑞玲等[26]比較了3 種精油接觸及熏蒸方式對火龍果采后腐爛病原真菌的抑制作用，表明兩種作用方式抑菌效果不同，直接接觸抑菌效果的優劣順序為香芹酚＞百里香＞肉桂，而熏蒸處理的優劣順序為香芹酚＞肉桂＞百里香。藍莓表面的蠟質層是保持外觀品質和耐貯性的基礎[27-28]。常規的浸果殺菌方式易沖洗掉果實表面的蠟質層，破壞其完整性，進而影響采后品質的維持。因此本實驗采用肉桂精油熏蒸的方式，進行體外抑菌實驗。實際應用中應根據待測樣品的特點及不同種類精油的抑菌特征，選擇合理的抑菌方式，從而能夠保證最優抑菌效果。

掃描電鏡觀察到菌絲形態受到嚴重破壞，發生了表面皺縮、凸起、不平整、黏連等一系列變形，其內在機制可能是由于精油的強疏水性引起細胞膜流動性發生變化，導致細胞內滲透壓不平衡，酶促反應受阻，細胞內容物泄露，最后導致細胞質膜破裂，細胞死亡[25]。但是，由于精油成分的復雜性及成分間相互作用的多樣性，目前國內外關于植物精油的作用機理還僅停留在根據實驗結果做出的推測，因此，植物精油成分和結構以及抑菌機理有待于進一步闡明。