高產γ-氨基丁酸植物乳桿菌的益生特性

李 文，王 陶，董玉瑋，李同祥

（徐州工程學院 江蘇省食品資源開發與質量發全重點建設實驗室，江蘇 徐州 222018）

乳酸菌在自然界中廣泛存在，一般認為是發全的（generally regards as safe，GRAS）[1]。其作為益生菌，具有免疫調節、抑制病原菌、控制腸道內穩態、抗胃酸、抗膽汁酸阻力、抗過敏、抗腫瘤、延緩衰老等多種功能[2-5]，被廣泛用于食品行業，如乳制品、面包、發酵蔬菜、肉類和魚類等[6-8]。乳酸菌體內具有谷氨酸脫羧酶，因此，可以發酵生產γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）。GABA作為中樞神經系統的重要神經遞質，具有抗焦慮、降血壓、調節情緒、延緩腦衰老、營養神經等多種生理功能[9-11]。采用乳酸菌發酵的方式增加食品中GABA含量是發全的，能夠增強食品的營養和功能特性，且賦予食品更好的口感，對于乳酸菌發酵食品基質的選擇顯得尤為重要。

鷹嘴豆被稱為“豆中之王”，富含蛋白質、氨基酸、維生素、膳食纖維、及鈣、鐵、鎂等成分，具有降膽固醇、降血糖、降血壓等多種保健功效[12]，經乳酸菌發酵后，鷹嘴豆的功能特性可以進一步提升，同時，乳酸菌的益生功能也可以得到很好的體現。若發揮乳酸菌的益生功效，必須克服宿主體內的物理和化學障礙，以順利進入宿主體內。除具備耐受胃腸道中酸和膽鹽的能力[13]，還需要能夠黏附宿主的腸壁細胞，這是乳酸菌發揮益生作用的先決條件[14]。此外，益生菌的分泌物或者分解產物應為抗菌物質，從而能夠有效抑制致病菌的增殖，改善胃腸道微生態環境[15]。

前期經誘變選育得到1 株具備在鷹嘴豆乳中發酵產GABA的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）UL-4[16]。本研究選取此菌株，動態監測其在鷹嘴豆乳中的生長和產GABA能力；并通過測定菌株的耐酸耐膽鹽特性、抑菌性能、表面特性、降解膽固醇和甘油三酯的能力評價其益生特性，以期為進一步利用此菌株開發功能性食品提供良好的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌UL-4、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、大腸桿菌（Escherichia coli）保藏于本實驗室。

GABA標準品 美國Sigma公司；膽固醇測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒 長春匯力生物技術有限公司；豬膽鹽、膽固醇、葡萄糖、無水乙酸鈉、檸檬酸銨、K2HPO4?3H2O、MnSO4?H2O、MgSO4?7H2O、吐溫-80、鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇、二甲苯、正己烷、蔗糖酯等均為國產分析純；牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等均為生化試劑。

MRS（de Man Rogosa Sharpe）培養基：葡萄糖20.0 g、牛肉膏15.0 g、酵母膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、檸檬酸銨2.0 g、K2HPO4?3H2O 2.62 g、MnSO4?H2O 0.198 g、MgSO4?7H2O 0.58 g、吐溫-80 1.0 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 6.0～6.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。LB液體培養基：胰蛋白胨10 g、酵母浸膏5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。LB半固體培養基：在LB液體培養基中加0.75 g/100 mL瓊脂粉。LB固體培養基：在LB液體培養基中加1.5 g/100 mL的瓊脂粉。膽鹽培養基：MRS液體培養基中分別加入0.03、0.15、0.3 g/100 mL的膽鹽，121 ℃滅菌20 min。膽固醇培養基：MRS培養基中加入0.01 g/100 mL膽固醇、0.01 g/100 mL蔗糖酯、0.1%（體積分數，下同）Tween-80、0.5%冰乙酸、0.2 g/100 mL巰基乙酸鈉，pH 6.0，121 ℃滅菌15 min。甘油三酯培養基：MRS培養基中加入5% Tween-80和1%豬油、0.2 g/100 mL巰基乙酸鈉，pH 6.0，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

LRH-150型生化培養箱 上海益恒實驗儀器有限公司；PB-20型pH計 德國Sartarius公司；64RL高速冷凍離心機 美國Beckeman公司；1100型高效液相色譜儀美國Agilent公司；722型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；SynergyHI酶標儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌UL-4發酵鷹嘴豆乳產GABA

1.3.1.1 菌懸液的制備

將保藏于甘油管的植物乳桿菌UL-4接種于MRS培養基，37 ℃厭氧培養24 h，再以3%的接種量接種到MRS培養基中，37 ℃厭氧培養14～16 h。將活化后的乳酸菌用0.85 g/100 mL生理鹽水清洗2 次，獲得菌懸液。

1.3.1.2 鷹嘴豆乳的制備與發酵

選取優質鷹嘴豆，清水沖洗后，室溫浸泡12 h，以豆水比1∶10（g/mL）加入水，煮沸15 min，放入食物攪拌器中磨漿，雙層紗布過濾，棄濾渣，濾液中加入0.2 g/mL的谷氨酸鈉，108 ℃滅菌15 min。待豆乳冷卻后，按5%的接種量接入處理好的菌懸液，37 ℃發酵48 h。從0 h開始，定期取適量發酵液低溫冷凍離心（10 000×g，4 ℃，10 min），檢測上清液中的GABA含量，并采用梯度平板法，對發酵鷹嘴豆乳中的乳酸菌進行活菌計數。

1.3.1.3 GABA產量測定

采用高效液相色譜法檢測GABA產量[17]。

衍生試劑的配制：0.4 mol/L的硼酸緩沖液：稱取硼酸2.47 g，用雙蒸水溶解，調節pH 10.4，定容至100 mL容量瓶中；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）溶液配制：稱取40 mg OPA，溶解于10 mL乙腈中，再加入40 μL β-巰基乙醇，混勻。

樣品衍生：依次吸取5 0 0 μ L硼酸緩沖液、100 μL OPA、100 μL發酵上清液，渦旋振蕩30 s，5 min后用0.22 μm微孔濾膜過濾。

色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相分析柱（4.60 mm×250 mm，5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器（G1315 B）；流動相A為20 mmol/L的醋酸鈉（pH 7.3），流動相B為乙腈；檢測波長：334 nm；柱溫：25 ℃；流速：48 cm3/h；進樣方式：手動進樣；進樣量：20 μL。洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution of mobile phase

標準曲線配制：將質量濃度為1 mg/mL的GABA標準溶液稀釋為質量濃度分別為100、200、300、400、500、600 μg/mL的6 種標準工作液，經OPA衍生后，進樣檢測，以GABA的色譜峰面積為縱坐標，以質量濃度為橫坐標，繪制GABA標準曲線。

1.3.2 耐酸性測定

調節MRS培養基的pH值依次為2、3、4，分別接種體積分數4%的乳酸菌，37 ℃厭氧培養0、1、2、3 h，取不同處理條件下的菌懸液適當稀釋后，進行平板菌落計數，按照式（1）計算菌株存活率[18]：

式中：Nl為各時間段的活菌數/（CFU/mL）；Nf為0 h的活菌數/（CFU/mL）。

1.3.3 膽鹽耐受性測定

將活化好的乳酸菌接種至含0.03%、0.15%、0.3%的膽鹽培養基中，37 ℃靜置培養，在培養0、1、2、3 h后取出對應的菌懸液，適當稀釋，然后做平板菌落計數[19]。并按照1.3.2節公式計算菌株存活率。

1.3.4 表面凝集性測定

吸取一定量生長至對數期的乳酸菌液于離心管中，4 000 r/min離心10 min，倒去上清液，用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.0）洗滌2 次后，調節菌懸液在600 nm波長處的吸光度0.8左右。吸取5 mL菌懸液放在37 ℃培養箱中靜置培養2 h，在不搖動的情況下，輕輕吸取200 μL上層懸浮液，測定其在波長600 nm處的吸光度[20]。菌體表面凝集性按式（2）計算：

式中：Ai為菌懸液初始吸光度；At為菌懸液靜置后吸光度。

1.3.5 表面疏水性測定

按照1.3.4節方法制備菌懸液，運用微生物黏著碳烴化合物法檢測其表面疏水性[21]。使用直徑10 mm的圓底試管，取4 mL已調整好濃度的菌液于試管中，再取1 mL的正己烷加入到管中，不加正己烷的作為對照組，蓋好塞子，在室溫條件下于旋渦混勻器上振蕩1 min，輕輕放置在試管架上，待15 min后分層。將無菌注射針頭快速插入到下層水相中，吸取3.0 mL作為實驗組，以Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液作為空白對照，在600 nm波長處測定吸光度，表面疏水性按式（3）計算：

式中：A0為對照組吸光度；A1為實驗組吸光度。

1.3.6 抑菌特性分析

1.3.6.1 指示菌活化

將金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌的甘油管，分別接種至LB液體培養基中，放在37 ℃、120 r/min搖床中培養12 h，使其達到對數生長期后備用。

1.3.6.2 抑菌活性測定

采用牛津杯法，測定乳酸菌發酵液的抑菌活性。將3 種指示菌分別用LB半固體培養基稀釋至濃度為106～107CFU/mL，倒平板。凝固后，把滅過菌的牛津杯放在瓊脂表面上。設置4 組樣品：1）乳酸菌發酵上清液；2）乳酸菌發酵上清液，用6 mol/L NaOH溶液調節pH 6.5；3）空白培養基；4）空白培養基，用乳酸調節pH值與發酵上清液相同。以上4 組樣液均用無菌過濾膜（0.22 μm）過濾除菌，分別吸取200 μL加到牛津杯中，于37 ℃的恒溫培養箱中，培養24 h后，觀察并測量抑菌圈直徑[18]。

1.3.7 對膽固醇的降解特性

乳酸菌接種于膽固醇培養基，37 ℃靜置培養48 h，5 000 r/min離心10 min后，取上清液，按照膽固醇試劑盒的說明，測定0 h及48 h發酵上清液的膽固醇濃度[22]。膽固醇降解率按式（4）計算：

式中：Ci為0 h膽固醇濃度/（mmol/L）；Ct為48 h后膽固醇濃度/（mmol/L）。

1.3.8 對甘油三酯的降解特性

乳酸菌接種于甘油三酯培養基，37 ℃靜置培養48 h，5 000 r/min離心10 min后，取上清液，按照甘油三酯試劑盒的說明，測定0 h及48 h發酵上清液的甘油三酯濃度[22]。甘油三酯降解率按式（5）計算：

式中：C0為0 h甘油三酯濃度/（mmol/L）；C1為48 h后甘油三酯濃度/（mmol/L）。

1.4 統計分析

實驗數據均為3 次重復結果的平均值，表示為 ±s，采用SPSS 16.0對數據進行統計分析，采用Duncan ANOVA進行多重比較，P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 菌株發酵鷹嘴豆乳產GABA分析

圖1 鷹嘴豆乳發酵產GABA的時間曲線Fig. 1 Time-course curves of GABA production and viable cell count during chickpea milk fermentation

如圖1所示，當植物乳桿菌UL-4接種到鷹嘴豆乳中后，迅速生長，8 h可達穩定期，乳酸菌活菌數為7.81（lg（CFU/mL）），比剛接入時增加了1.54 個數量級，因此，鷹嘴豆乳可以作為良好的功能性食品基質。GABA在最初接種的8 h的生成較為緩慢，8 h后生成迅速，48 h產量到達最大值371.14 mg/L，之后無顯著變化（P＞0.05）。曾有研究報道黑豆乳、豌豆可通過乳酸菌發酵產GABA[23-24]，鮮有乳酸菌發酵鷹嘴豆乳產GABA的報道。

2.2 菌株對酸的耐受性

具有一定的酸耐受性，才能通過胃酸屏障進入腸道特定部位發揮作用。由表2可以看出，pH值為2時，1 h后，菌株的活菌數和存活率有所下降（P＜0.05），之后無顯著變化（P＞0.05），3 h后的存活率為46.67%；pH 3條件對菌株生長無顯著影響（P＞0.05），活菌數和存活率皆保持在較高水平；而pH 4條件下，隨著時間的延長，菌株的活菌數由7.20（lg（CFU/mL））上升為7.44（lg（CFU/mL）），存活率3 h后升至174.21%。總體而言，該菌株顯示出對酸較好的耐受性。

表2 益生菌耐酸實驗結果Table 2 Acid tolerance of UL-4

2.3 菌株對膽鹽的耐受性

膽鹽對微生物的生長繁殖具有明顯的抑制作用，因此，只有在較高膽鹽含量中保持活力并能夠繁殖的菌株才能抵抗住腸道消化作用而存活[19]。由表3可看出，隨著培養時間的延長，膽鹽質量分數為0.03%時，菌株沒有受到不良影響，活菌數和存活率有所上升（P＜0.05）。隨膽鹽質量分數增大，活菌數和存活率均受到一定影響，3 h后，菌株依然保持較高活菌數和存活率，0.15%和0.3%膽鹽質量分數下，存活率分別為91.81%和56.28%。可見，菌株對膽鹽具有一定耐受性。

表3 益生菌膽鹽耐受結果Table 3 Bile salt tolerance of UL-4

2.4 菌株的表面性質

在消化過程中，消化道會不斷回縮，許多微生物進入消化道時，開始具有較多數量，但很快被排出。因此，益生菌能夠發揮作用的前提是確保菌株能夠通過黏附作用定植于消化道內。通過測量菌株的表面疏水性和凝集特性評估菌株的表面特性，菌株的表面凝集性和表面疏水性分別為52.49%和61.50%，能夠較好地定植于消化道表面并進行繁殖。

2.5 菌株的抑菌活性

圖2 菌株對3 種指示菌的抑制作用Fig. 2 Inhibitory activities of the strain against three indicator pathogens

通過探究菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌的抑制作用所形成的抑菌圈直徑大小評估益生菌對體內致病菌感染的預防和抑制能力，確保益生菌發揮益生特性。如圖2所示，發酵上清液的抑菌圈直徑均大于13.00 mm，說明菌株對3 種致病菌具有較好的抑制作用，菌株對金黃色葡萄球菌抑制效果最明顯，抑菌圈直徑為15.77 mm，其次為大腸桿菌，抑菌圈直徑為14.40 mm，對傷寒沙門氏菌也有一定的抑制作用，抑菌圈直徑為13.36 mm。調酸的空白培養基有抑菌圈，但其抑菌圈直徑小于對應發酵上清液，調為中性的發酵上清液與空白培養基皆無抑菌活性。可見，除酸性pH值對致病菌的抑制作用外，發酵上清液中應該還存在一些非酸性的抑菌活性物質，而此類抑菌物質需在酸性條件下發揮作用。

表4 菌株對致病菌的抑菌活性Table 4 Inhibition zone diameters when various pathogens were exposed to the strain

2.6 菌株降膽固醇和降甘油三酯特性

將菌株培養在含膽固醇和甘油三酯的培養基中，測定0 h和48 h此兩種物質的含量，結果見表5。0 h時，膽固醇、甘油三酯濃度分別為1.27、6.28 mmoL/L；經乳酸菌發酵48 h后，濃度分別降為0.34、5.08 mmol/L，降解率分別為73.23%和19.11%。此菌株具備降解這2 種物質的能力。

表5 菌株對膽固醇和甘油三酯的降解作用Table 5 Degradation rates of cholesterol and triglyceride by the strain

3 討 論

采用植物乳桿菌UL-4發酵鷹嘴豆乳48 h后，鷹嘴豆乳中GABA產量為371.14 mg/L，活菌數為7.81（lg（CFU/mL）），一方面，能夠滿足人體每日GABA的需求量為30～100 mg的要求，另一方面，鷹嘴豆乳中的乳酸菌活菌數能夠滿足益生產品對于乳酸菌數至少要達到106CFU/mL的要求[25]。因此，植物乳桿菌UL-4具備良好的開發功能性鷹嘴豆乳的潛力。

當人體攝入益生菌或含益生菌產品后，益生菌本身需要克服體內環境影響才能發揮其正常的益生作用。正常人的胃液在消化食物時pH值為3～4，空腹時胃液的pH值在2.0左右，食物在胃中的消化時間一般為1～2 h。本實驗所得植物乳桿菌在pH 2的環境中，3 h能保持46.67%的存活率，pH 3的環境能夠保持91.81%的高存活率，而在pH 4的環境有高達174.21%的存活率，為其能正常通過胃液進入腸液奠定了基礎。正常情況下，小腸內膽鹽在0.03%～0.3%[26]，而高含量的膽鹽具有抗菌活性。本實驗植物乳桿菌UL-4對低含量膽鹽具有較好的抗性，3 h后存活率高達382.83%，即使在0.3%膽鹽環境下，3 h后仍可保持56.28%的存活率，顯示出了較好的耐膽鹽特性。

乳酸菌要想發揮作用，須先定植到細胞上，可以通過競爭營養及黏附部位阻擋病原菌與細胞表面受體的結合，調節腸道內菌群平衡。經測定，植物乳桿菌UL-4表面疏水性和凝聚性分別為61.50%和52.49%，說明該菌株可能會黏附在人體腸道上皮細胞和黏膜表面上，發揮其益生功能。朱振軍等[27]報道羅伊氏乳桿菌LT018的疏水性和凝聚性分別為54.65%和67.20%，與本研究的類似。影響細菌表面疏水性與凝集性的因素有很多，比如細菌表面非極性基團的多少，表面蛋白、脂磷壁酸、菌毛、莢膜等結構，而這些因素因菌株的不同而存在差異。

腸道微生物構成的屏障是腸道屏障的重要組成部分，對宿主腸道功能的發揮具有重要作用。乳酸菌可以通過發酵過程中產生的乳酸、苯乳酸、細菌素等代謝產物，達到抑菌的目的，抑制和殺滅革蘭氏陰性菌、過氧化氫酶陽性細菌、大腸桿菌類和沙門氏菌等病原菌，調節腸道菌群平衡[28-30]。植物乳桿菌UL-4顯示出對3 種腸道致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌有較好的抑制作用，且發酵上清液的抑菌效果好于用乳酸調至等pH值的空白培養基的抑菌效果，這與林龍鎮等[31]的研究結果一致，一方面是由于菌株產生的乳酸等有機酸的抑菌作用，另一方面是由于菌株產生的在酸性條件下發揮作用的抑菌活性物質。有研究發現非酸性活性物質是在中性條件下發揮作用，而本研究所得菌株更適合應用于調節人的腸道[32-33]。

血清中膽固醇、甘油三酯含量過高，會誘發冠心病、腦中風、高血壓等心腦血管疾病，嚴重影響人類健康。因此，對膽固醇、甘油三酯的降解能力成了衡量益生菌益生特性的又一重要指標。植物乳桿菌UL-4對甘油三酯和膽固醇的降解率分別為73.23%和19.11%，說明菌株具備良好的降解這兩種物質的能力。綜上，植物乳桿菌UL-4具有發酵生產富含GABA鷹嘴豆乳的能力，同時顯示出較好的益生特性，因此，具備良好的應用潛力。