基于膜濾法處理的預發酵椰子水促進細菌纖維素合成機理

傅美娟，鄧 健，羅佳茜，林 雪，李從發，劉四新,2,*

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南 海口 570228；2.海南大學理學院，海南 海口 570228）

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是某些細菌合成的由多個D-吡喃葡萄糖分子通過β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的葡聚糖，呈高度持水的凝膠狀[1]。其生物合成的途徑主要包括4步：聚合、分泌、裝配、結晶。合成過程中涉及到幾個關鍵酶（如尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、纖維素合成酶、葡萄糖激酶、異構酶等）和多種代謝途徑（如磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑、三羧酸循環和糖異生作用），圖1是早期研究時木醋桿菌（現在名稱為木駒形桿菌[2]）合成BC的主要碳代謝途徑[3]。

圖1 木醋桿菌合成BC的代謝途徑Fig. 1 Biosynthesis pathways of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum

目前，BC在國內食品工業中應用最廣泛，被稱為椰纖果、椰果、椰子凝膠等[4]。BC是區別于植物纖維素（常含半纖維素、木質素等）的納米級高純度纖維素，其具有高純度、高結晶度和聚合度、抗張強度、保水性、生物可降解性和生物適應性等優良特性[5-9]，所以BC被高附加值地應用于高級造紙、生物醫藥、醫學組織工程材料和紡織材料等研究領域[10-12]。因此對于BC的高效發酵工藝及其調控機制研究十分必要。

用于發酵生產BC的研究涉及到各種原料，均以提高產率和降低成本為目標[13]，包括椰子水[14]、酒廠廢水[15]、玉米漿[16]、果汁[17]、水解液[18]等，其中以椰子水為主要原料產量最高、效率最好。由于椰子水主要產于熱帶地區且不易貯存，因此，目前對于椰子水高效合成BC方面的研究鮮有報道。本團隊前期一直從事椰子水基質合成BC的研究，發現新鮮椰子水（natural coconut water，NCW）需經過自然預發酵過程，才能成為較好的合成BC的培養基原料，發酵生產的得率最終呈倍數增長[19-20]。Zhang Jiaochao等[21]、楊一沖[22]采用宏基因組學方法研究椰子水自然預發酵過程中微生物的組成及動態變化，發現其中存在乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等各類種屬不同的復雜微生物區系。本研究提出以膜過濾法處理預發酵椰子水（fermented coconut water，FCW），有效避開“熱效應”的不利影響和干擾，以探究FCW中菌體及其代謝產物對BC的合成作用，為進一步探明促進BC合成的“關鍵成分”及其調控影響機制提供新的研究思路和重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

NCW：海口集市批發椰子果，破殼取水，3 層紗布過濾，迅速分裝至干凈的礦泉水瓶中，置于-20 ℃速凍備用。

FCW：將已分裝至礦泉水瓶的新鮮椰子水存于室溫下，使其自然發酵至7 d，于-20 ℃速凍備用。

椰凍駒形桿菌（Komagataeibacter nataicola）Y19由海南大學食品生物技術實驗室保藏[23]。

硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、蔗糖、冰醋酸、氫氧化鈉（均為分析純） 廣州化學試劑公司；葡萄糖酸、D-酒石酸、草酸、L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純） 北京索萊寶科技有限公司；甲醇（色譜純） 美國Tedia公司；仲辛醇（色譜純） 美國阿拉丁試劑公司。

1.1.2 培養基

BC發酵培養基：3 g/L (NH4)2SO4、0.3 g/L MgSO4·7H2O、0.3 g/L KH2PO4，50%椰子水（新鮮/預發酵），50%蒸餾水，pH 5.0，調節糖度至6 °Brix。115 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

PB303-N電子分析天平、Delta320-S pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；Biofuge primo R高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司；SPX智能型生化培養箱 寧波江南儀器廠；G154DW自動壓力蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；SW-CJ超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；1200液相色譜儀、HP6890/5973N氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 FCW膜濾處理及培養基的設置

將FCW在9 000 r/min條件下離心20 min后，取上清液配制BC發酵培養基，以0.45 μm膜抽濾除菌得到膜濾上清液組培養基（以下簡稱FCW-M）；取離心菌體及濾膜上截留菌體添加（帶濾膜）至NCW中，得到菌體組BC發酵培養基（以下簡稱FCW-P），分別設NCW和FCW培養基為陰性和陽性對照，每個組設3 個重復。全部培養基調pH 5.0，后三者經121 ℃、15 min滅菌。

1.3.2 BC的發酵及產量測定

將已活化好的Y19二級種子液以2%接種量分別接種到上述4 種發酵培養基中（100 mL三角瓶裝液量50 mL），30 ℃靜置培養7 d，回獲BC膜。

水洗、浸泡于NaOH稀溶液中80 ℃水浴保溫直至BC膜呈乳白色，依次以稀乙酸中和、去離子水洗直至pH值呈中性，置于80 ℃烘箱烘至恒質量。產量以干質量（g/L）計。

1.3.3 氣相色譜-質譜測定條件

色譜條件：DB-5毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；恒定流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣（99.999%）；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持6 min，以3 ℃/min升溫至120 ℃，然后以4 ℃/min升溫至230 ℃。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；質量掃描范圍30～450 u；采集方式為全掃描；溶劑延遲3 min。

定性定量分析：采用對總離子流色譜圖中的各個峰經質譜掃描后的質譜圖，與質譜儀自帶的數據處理系統MSWORKSTATION version7.0.NIST譜庫檢索，并結合保留指數和查閱相關文獻進行人工譜圖解析，定性分析，獲得初步的鑒定結果。樣品定量分析采用內標法。

1.3.4 高效液相色譜法測定有機酸組成

分別測定FCW-M和NCW中的有機酸組成。將待測樣品于9 000 r/min離心20 min，取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾到進樣瓶中，進樣量10 μL，結果用回歸方程計算各成分含量。

色譜條件：Z O R B A X-S B-A q色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；紫外檢測器；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min，流動相為pH 2.3磷酸溶液；進樣量10 μL。采用外標法進行定量分析。

1.4 數據處理

采用SPSS Statistics V20.0軟件進行均值、方差分析和Pearson相關性分析，采用Duncan檢驗方法（P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著）；使用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 FCW-M組和FCW-P組對BC合成的影響

圖2 預發酵7 d的FCW中上清液和菌體對BC合成的影響Fig. 2 Effects of filtrate and bacterial cell residue of 7 d fermented coconut water on BC synthesis

如圖2所示，膜濾液組FCW-M的BC產量為陰性對照組NCW的10 倍，呈極顯著差異，而只比陽性對照組FCW產量稍低，但無極顯著差異（P＞0.01），說明膜濾液中含有與未經過濾的FCW幾乎相同，且對BC合成有極顯著促進作用的未知成分。FCW-P的BC產量僅有1.56 g/L，但從差異分析上發現，與陰性對照組NCW也存在極顯著性（P＜0.01），可能是因為菌體經熱滅菌后死亡、崩解，菌體碎片提供了BC發酵合成的生長因子等營養成分，但其對BC的促進顯著弱于FCW-M組（增產10 倍）和FCW組（增產10.5 倍）。說明椰子水經過預發酵后顯著促進BC合成的主要貢獻來自預發酵中微生物的未知代謝產物，而且可能涉及BC合成代謝通路上的調控因子，而非普通的菌體生長營養成分（如氨基酸核苷酸類等生長因子）。

2.2 預發酵時間對FCW-M組和FCW-P組合成BC影響程度的比較

圖3 預發酵過程中FCW-M和FCW-P對BC產量的影響Fig. 3 Effects of filtrate and bacterial cell residue with different fermentation times on BC yield

2.1 節僅表明預發酵時間7 d時的FCW中FCW-M組對BC合成有顯著促進作用，故繼續探究預發酵過程中（1～7 d）每個時間點是否都存在類似的規律，如圖3所示，預發酵前4 d 3 組BC產量差異顯著（P＜0.05），FCW-M組對BC產量的促進作用沒有得到體現，預發酵后期（5～7 d）FCW組和FCW-M組的BC產量明顯提高，FCW-M組第3天的BC產量較第1天僅提高2.8 倍，直到第7天提高12.5 倍，此時組內顯著性差異分析發現，預發酵第5天時FCW組的BC產量與FCW-M組無顯著性（P＞0.05），與FCW-P組存在顯著差異（P＜0.05），預發酵第6、7天時FCW組與FCW-P組的差異達到極顯著（P＜0.01）。結果表明，FCW-M組對BC產量的促進作用主要集中在預發酵后期，推測可能是FCW-M中不同種微生物積累的某類“促進作用”代謝產物不斷增加，也可能是某一類微生物所產該“促進作用代謝產物”濃度不斷增大。上清液和菌體促進BC合成的時間響應程度差異再次說明促進BC合成貢獻最大的是FCW-M，而非菌體，推測預發酵過程產生了對BC合成有重要調控作用的代謝產物。

并且實驗發現膜濾的速度隨椰子水預發酵時間而顯著不同，呈逐漸加快的趨勢，預發酵1、3、5 d和7 d的椰子水膜濾平均速率約為0.33、6、10 mL/min和15 mL/min，推測預發酵過程中，微生物將椰子水中的糖類、蛋白質類以及其他可能的帶黏性類物質逐漸分解利用，使體系的黏度降低，而加快了過濾除菌的速度。椰子水培養基體系的黏度變化是否對BC合成產生影響，以及預發酵超過7 d后的BC產量情況，值得進一步研究。

2.3 FCW-M的成分分析

圖4 NCW（A）和FCW-M（B）的氣相色譜-質譜總離子流圖Fig. 4 GC-MS total ion current chromatograms of NCW (A) and FCW-M (B)

表1 GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis of volatile compounds of NCW and FCW-M

2.1 節和2.2節結果表明FCW-M對BC的產量有顯著促進作用，說明預發酵過程產生了對BC合成有重要調控作用的代謝產物。因此對NCW、FCW-M進行氣相色譜-質譜聯用法分析比較，結果如圖4、表1所示。NCW共檢出76 種化合物，醇類和醛類所占比例最大，達2/3以上，醇類相對含量約為46%。FCW-M共檢出66 種化合物，醇類相對含量最高，約占62%。從化合物的總含量上分析，NCW中能檢出的揮發性成分含量較少，FCW-M中的成分總量約為NCW的5 倍。FCW-M中的醇類及酸類的含量遠超過NCW，但醛類相對含量遠低于NCW，說明椰子水經預發酵后醇類和酸類物質變化較大。FCW-M中的醇類物質以乙醇為主，酸類物質以乙酸為主，FCW-M中的乙醇質量濃度（2 149.615 μg/L）是NCW（483.416 μg/L）的4.5 倍，乙酸質量濃度（522.808 μg/L）是NCW（10.95 μg/L）的48 倍，乙酸、乙醇質量濃度的增加與BC產量的提高具有一致性，說明乙酸和乙醇可能參與菌種Y19的代謝調節而影響BC的合成。另一方面，預發酵后醛類物質減少，也可能減弱了BC合成過程中的負調控，值得深入研究。

根據國內外其他人的研究，Li Yuanjing等[24]為改善BC的合成，在發酵過程中將乙醇和檸檬酸鈉加入培養基中，指出乙醇快速氧化所產生的高能荷三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是戊糖磷酸途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑，從而使代謝流量更多的進入BC合成方方。Sakurai等[25]采用DNA微陣列技術分析了乙醇作用下A. acetiNBRC 14818細胞生長過程中轉錄組的變化，結果發現細胞開始氧化乙醇后，乙醛酸途徑酶基因顯著上調，說明該途徑對乙醇作為碳源的利用具有重要意義。Mohammadkazemi等[26]研究乙酸對K. xylinusI 2281合成BC的影響，表明乙酸可以被活化成乙酰輔酶A進入乙醛酸途徑，經糖異生作用形成葡萄糖，而利于BC的生物合成。類似的還有張麗平等[27]研究發現乳酸、乙酸、蘋果酸等對木醋桿菌合成BC有促進作用，馬霞等[28]研究發現培養基中含有乳酸鹽或甲硫氨酸，能加速細胞生長，提高纖維素產量。因此，推斷椰子水經預發酵后乙酸和乙醇含量的增加對BC的合成途徑具有一定的正調控作用。

2.4 椰子水預發酵過程中有機酸的變化分析

圖5結果顯示，在椰子水整個預發酵過程中乙酸、乳酸和葡萄糖醛酸為主體酸，含量較豐富，其次是檸檬酸、蘋果酸、酒石酸和琥珀酸等。椰子水經預發酵后其中乳酸及乙酸含量呈持續上升趨勢，表明FCW中乳酸菌、酵母菌及醋酸菌生長活躍。BC產量（圖2）結果與此對應，將FCW 1、3、5 d和7 d的BC產量與乙酸、乙醇含量經Pearson相關性分析（圖6）可知，乙酸和乳酸含量與BC產量呈正相關，相關系數分別為0.690和0.712，可能說明乳酸和乙酸的增長對BC合成起到促進作用。BC合成是一個需要消耗大量ATP的過程，乳酸和乙酸可進入三羧酸循環，參與胞內代謝并產生大量ATP，較多的能量可以促進BC的合成[29-30]。經過1～2 d預發酵后椰子水中葡萄糖酸含量降低，至第3天達最低，此時其BC產量（圖2）增長也達顯著。葡萄糖酸是葡萄糖-6-磷酸的氧化產物，其含量的降低說明葡萄糖-6-磷酸進入經變位酶后生成尿苷二磷酸葡萄糖的途徑，從而使BC得以順利合成、顯示其產量進入快速增長階段[31-32]。檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸和草酸等幾種有機酸在發酵過程中變化不顯著，這些有機酸是三羧酸循環中常見的中間產物，從對BC的合成途徑影響看可能性不大，說明預發酵過程中產醋酸、乳酸的微生物可能對BC產量的影響較大。

圖5 椰子水預發酵過程中FCW-M的有機酸含量Fig. 5 Changes in organic acid contents of FCW-M during the fermentation of coconut water

圖6 BC產量與L-乳酸（A）、乙酸（B）的相關性分析Fig. 6 Correlation analysis of BC yield with L-lactic acid (A) and acetic acid (B)

3 結 論

本實驗將椰子水在預發酵FCW中的菌體與上清液分開，研究其對BC合成產生顯著促進性影響的可能原因。結果顯示，在預發酵7 d時FCW-M組與FCW組的BC產量無極顯著差異（P＞0.01），而菌體沉淀組FCW-P對BC的促進作用顯著弱于FCW-M組和FCW組。從不同預發酵時間角度比較時，組內顯著性分析發現預發酵前期（1～4 d）FCW-M組的BC產量與FCW組差異顯著（P＜0.05），此時FCW-M對BC的促進作用沒有得到體現，后期（5～7 d）可能由于預發酵中微生物積累的某類“促進作用”代謝產物種類不斷增加或是“促進作用代謝產物”濃度不斷增大，FCW-M組的BC產量與FCW組在極顯著水平無差異（P＞0.01），說明FCW-M中存在對BC合成有重要調控的代謝產物。因此，由進一步的氣相色譜-質譜法和高效液相色譜法對FCW-M預發酵過程中的揮發性成分和有機酸成分分析，初步推測預發酵椰子水中的乙酸、乳酸和乙醇很可能參與促進BC合成的調控過程。本研究以膜濾除菌代替加熱滅菌、避開“熱效應”的干擾影響，揭示了椰子水預發酵中是代謝產物而非菌體對BC合成的促進性影響發揮了最關鍵作用的規律，解答了“預發酵過程是否提供了酵母膏樣生長因子”的質疑問題。下步擬將以代謝組學技術分析FCW中的各差異代謝物，并進一步解析預發酵過程與BC合成代謝的調控過程之間的相關關系，為最終研究BC的代謝調控路徑及調控機理提供理論基礎。