不同花色福鼎白茶中揮發性萜類化合物的對映異構體分布

嚴 寒，朱 蔭*，穆 兵，呂海鵬，KANG Suyoung，張 悅，林 智*

（1.農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

揮發性萜類化合物是由甲戊二羥酸衍生、分子骨架以異戊二烯單元（C5單元）為基本結構單元的化合物及其衍生物，包含單萜、倍半萜等，往往具有較低的香氣閾值和宜人的香氣，廣泛存在于植物源性食品中[1]。揮發性萜類化合物大多具有1 個或多個手性碳原子，存在香氣特性及香氣閾值均可能迥異的對映異構體，如S-芳芳醇呈現甜香及花香（香氣閾值7.4 μg/L）[2]，R-芳芳醇呈木香（香氣閾值0.8 μg/L）[3]；(2R,5R)-芳芳醇氧化物A及(2R,5S)-芳芳醇氧化物B具有青葉香及泥土香，(2S,5S)-芳芳醇氧化物A、(2S,5R)-芳芳醇氧化物B、(2S,5R)-芳芳醇氧化物C及(2S,5S)-芳芳醇氧化物D具有甜香、花香及奶油香，(2R,5S)-芳芳醇氧化物C及(2R,5R)-芳芳醇氧化物D則具有泥土氣息等[4]。自然界中萜類化合物往往以不同比例的對映異構混合體形式存在于生命體或食品中，不同比例的混合形式導致了植物或食品繁多復雜的風味特性，尤其同一產地或品種來源的食品或植物中的部分萜類化合物具有高度一致性和特異性[5-7]。據此，萜類化合物的手性分布特性引起了食品科學領域的廣泛關注，萜類化合物的對映異構體分析已被初步應用于植物及風味食品的產地判別、品種溯源及真偽鑒別等方面[8-10]。

揮發性萜類化合物是茶葉香氣的重要組成，對茶葉優良香氣品質的形成起著舉足輕重的作用[11]。目前，揮發性萜類化合物的對映異構體研究在茶葉領域仍處于初步發展階段，僅有少數相關研究報道[4,12-17]。近期，本研究組建立了茶葉中15 種重要萜類化合物（包括芳芳醇、芳芳醇氧化物A～D、橙花叔醇、檸檬烯、α-松油醇、4-萜品醇、香香醇、α-紫羅蘭酮及茶螺烷等）的對映異構體分析方法，結果表明其對映異構體比例（enantiomeric ratio，ER）值及其含量在45 個市售的代表性茶樣中存在顯著性差異，且它們的對映異構體分布特征與茶樹品種、產地及加工工藝存在密切聯系[14-17]。由此可見，揮發性萜類化合物的對映異構體分布在茶葉真偽辨析及指紋圖譜構建等方面展現出較大的潛力。然而，目前鮮見針對具體茶類中揮發性萜類化合物對映異構體分布特征的系統研究報道，這也限制了手性分析技術在茶葉質量控制領域的進一步深入。

白茶是我國傳統六大茶類之一，產區有福鼎、政和、松溪和建陽等縣，其中產于“中國白茶之鄉”福鼎的福鼎白茶是白茶的典型代表[18]。根據其采摘標準及制茶原料的區別，可將福鼎白茶劃分為白毫銀針、白牡丹、壽眉和貢眉4 種花色[19]，它們的風味品質各俱特色，受到不同消費群體的喜愛與關注。目前，白茶的品質化學成分差異性分析已有較多的研究報道[20-24]，然而白茶中揮發性成分的對映異構體分布情況尚未明了，因此白茶中手性揮發性萜類化合物的研究具有較高的研究價值和理論意義。本研究擬在前期工作的基礎上，采用頂空固相微萃取（headspace-solid-phase microextraction，HSSPME）法結合手性氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用技術對不同花色福鼎白茶的香氣成分進行分析，旨在填補手性分析在白茶品質化學上的研究空白，分析揮發性萜類化合物在不同花色福鼎白茶中的對映異構體分布特征，為今后白茶指紋圖譜構建及香氣品質形成機理研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白茶樣品于當地市場采集或由合作廠家直接提供，并根據GB/T 22291—2017《白茶》篩選出具有代表性香氣品質的不同花色福鼎白茶共計11 個。其中白毫銀針樣品4 個，分別為福建品品香茶業有限公司提供的BHYZ-1及BHYZ-2，福建省天湖茶業有限公司提供的BHYZ-3以及福建鼎白茶業有限公司提供的BHYZ-4；白牡丹樣品3 個（BMD-1、BMD-2、BMD-3），均由福建譽達茶業有限公司提供；壽眉樣品4 個（SM-1、SM-2、SM-3、SM-4），其中SM-2由福鼎市天毫茶業有限公司提供，其余3 個樣品均由福建鼎白茶業有限公司提供。

揮發性萜類化合物標準品（15 種萜類化合物的消旋體及對映異構體）：(±)-α-蒎烯、R-α-蒎烯、S-α-蒎烯、(±)-芳芳醇、(±)-香香醇、S-香香醇、(±)-α-紫羅蘭酮、無水乙醇、反式-橙花叔醇（均為色譜級） 北京百靈威（J&K）科技有限公司；R-檸檬烯、S-檸檬烯、芳芳醇氧化物（呋喃型）、(±)-4-萜品醇、R-4-萜品醇（均為色譜級） 上海TCI公司；R-芳芳醇、(±)-茶螺烷、S-α-松油醇、順式-橙花叔醇（均為色譜級） 美國Sigma-Aldrich公司；(±)-α-松油醇（色譜級） 上海Aladdin公司；茉莉酸甲酯（色譜級） 日本Wako公司；氯化鈉（分析級） 北京普益華科技有限公司；純凈水 杭州娃哈哈集團。

1.2 儀器與設備

密封萃取瓶 自制；手動SPME手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）涂層纖維萃取頭、Astec CHIRAL DEX B-DM色譜柱（30 m×0.25 mm，0.12 μm） 美國Supelco公司；7890A-5975C GC-MS聯用儀 美國Agilent公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；SQP型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；S025 Tube Mill C控制型試管研磨機 艾卡（廣州）儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取茶粉1.00 g，加入到自制的改良萃取瓶中并充分混合，加入5 mL沸水沖泡，立刻旋蓋，放入50 ℃水浴鍋平衡3 min，然后插入裝有已老化過的DVB/CAR/PDMS萃取頭的手動進樣器，在水浴條件下頂空萃取30 min，萃取時間到達后取出并立即插入GC進樣口中，解吸附5 min，回集數據。每個樣品平行重復3 次。

1.3.2 色譜條件

GC條件：Astec CHIRAL DEX B-DM色譜柱（30 m×0.25 mm，0.12 μm）；進樣口溫度250 ℃；分流進樣，分流比1 0∶1；載氣：高純氦氣（純度≥99.99%），柱流速1.0 mL/min；升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持2 min，再以2 ℃/min升溫至150 ℃，保持10 min，最后以4 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min。

1.3.3 MS條件

電子電離源；電離能量-70 eV；離子源溫度220 ℃；四極桿溫度150 ℃；運行全掃描模式；質譜傳輸線溫度250 ℃，質量掃描范圍30～600 u；溶劑延遲5 min。

樣品前處理方法及GC-MS分析方法均在本研究組已采用的提取方法[17]基礎上進行微調。

1.3.4 感官審評

參照GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》，委托茶葉感官審評專家對11 個不同花色福鼎白茶進行感官審評，針對茶葉的外形、湯色、香氣、滋味及葉底5項因子進行百分制評分，茶樣各因子的評分乘以相應評分系數并累加即得該茶樣的審評總分。

1.3.5 白茶中揮發性萜類化合物對映異構體的定性定量分析

定性分析通過比對各標準品的保留時間及質譜的特征峰離子；相對定量分析采用峰面積歸一化法計算獲得，僅計算各對映異構體在所有目標萜類化合物所占比例，按式（1）計算：

式中：C1為某揮發萜類化合物對映異構體的相對含量/%；A1為該對映異構體的定量離子峰面積；A總為可定性出的所有揮發性萜類化合物的峰面積總和。

采用ER值[25]描述白茶中揮發性萜類化合物對映異構體分布情況。按式（2）～（4）計算：

式中：ER直接以比值形式呈現（不計算具體數值，E1+E2=100）；A1和A2分別為某揮發性萜類化合物的一對對映異構體的定量離子峰面積。

1.4 數據多元統計分析

采用Excel 2010（美國Microsoft公司）對原始數據進行標準化處理，并繪制柱狀圖；偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）采用SIMCA-P 12.0軟件（瑞典Umetrics公司）完成；非參數檢驗采用SPSS Statistics 20軟件完成（美國IBM公司）；層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）使用MeV生物信息學分析軟件（美國Oracle公司）完成。

2 結果與分析

2.1 感官審評結果

表1 福鼎白茶的感官審評結果Table 1 Sensory evaluation results of different types of Fuding white teas

本研究所選用的11 個福鼎白茶均產自福建福鼎市，鮮葉原料為福鼎大白茶或福鼎大毫品種，采用傳統白茶工藝（采摘、萎調、干燥、揀剔）加工而成，其中白毫銀針的采摘標準為單芽，白牡丹采摘標準為一芽一、二葉，壽眉采摘標準為嫩梢或葉片。如表1所示，白毫銀針樣品的感官特征主要是“外形披毫，湯色杏黃，香氣清甜帶毫香，滋味清甜，葉底勻整、肥壯、軟嫩”，總分均在90以上；白牡丹樣品的感官特征主要是“外形灰綠顯毫、尚勻整，湯色杏綠明亮，香氣毫香顯、透熟，滋味清甜，葉底灰綠尚勻整”，總分介于87.5～88.9之間；壽眉樣品的感官特征主要是“外形灰褐，湯色黃、尚亮，香氣純正，滋味尚醇，葉底粗老、尚勻”，總分介于82.3～84.2之間。由此可見，本研究所采用的福鼎白茶樣品均具有較好的代表性，3 種不同花色的福鼎白茶在香氣品質上具有較大的差異性（白毫銀針＞白牡丹＞壽眉），適合進行下一步的揮發性萜類化合物對映異構體的檢測分析實驗。

2.2 福鼎白茶中揮發性萜類化合物對映異構體的定性及相對定量分析

采用前期實驗中已篩選出的最優前處理及手性GC-MS分析方法[17]對不同花色福鼎白茶中的揮發性萜類化合物進行分析，經定性和相對定量分析后（表2），發現除α-蒎烯外，其余14 種萜類化合物的1～2 個對映異構體在所有樣本中均可以被檢測到，經數據處理后獲得的不同花色福鼎白茶中揮發性萜類化合物的ER值及相對含量如表3所示。由于樣本的廠家來源、生產日期及原料等級等均不同，部分萜類化合物的ER值及相對含量在不同樣本間存在較大差異性，從而導致其ER值及相對含量的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）及標準差較高，但平行樣本的重復性均較為理想，RSD普遍小于10%。

表2 揮發萜類化合物對映異構體的氣味特征及特征離子Table 2 Odor characteristics and characteristic ions of volatile terpenoid enantiomers

圖1 福鼎白茶中揮發性萜類化合物對映異構體的相對含量比較Fig. 1 Comparison of contents of volatile terpenoid enantiomers among different types of Fuding white teas

表3 福鼎白茶中揮發性萜類化合物的ER值及相對含量Table 3 ER values and relative contents of volatile terpenoids in different types of Fuding white teas

由于茶葉香氣化合物眾多復雜，為排除其他化合物的干擾且更直觀對比不同花色福鼎白茶間各揮發性萜類化合物對映異構體的含量情況，本研究僅對各揮發性萜類化合物對映異構體在所有目標萜類化合物中所占的比例值進行分析，如圖1所示，在3 種不同花色的白茶中，S-芳芳醇、S-Z-橙花叔醇及(2S,5R)-芳芳醇氧化物B在所有可測得的揮發性萜類化物中的相對含量均在10%以上，其中白毫銀針和壽眉中S-芳芳醇具有最高相對含量（25.25%，21.54%），而白牡丹中S-Z-橙花叔醇具有最高相對含量（29.73%）。除以上3 種化合物外，在白毫銀針樣品中，S-E-橙花叔醇、R-芳芳醇及S-α-紫羅蘭酮的含量相對較高（5.15%～10.14%）；白牡丹樣品中，(2S,5S)-芳芳醇氧化物A、S-E-橙花叔醇及R-芳芳醇的含量相對較高（4.41%～4.79%）；壽眉樣品中，S-E-橙花叔醇、R-α-紫羅蘭酮、S-α-紫羅蘭酮、(2S,5S)-芳芳醇氧化物A及R-芳芳醇的含量相對較高（5.42%～9.00%）。反之，茶螺烷的4 種對映異構體在3 種花色的白茶樣本中均僅具有極低的相對含量（＜1%）。

由茶樣感官審評結果（表1）可知，白毫銀針大多具有清甜的香氣特征，而該茶類中含量較高的S-芳芳醇、S-E-橙花叔醇及(2S,5R)-芳芳醇氧化物B均具有甜香特征，推測與白毫銀針“清甜香”的品質形成具有較為直接的聯系。據長期的茶葉加工及感官審評經驗可知，白毫銀針及白牡丹的“毫香”特征實為茶葉芽頭上的絨毛沖泡后產生的植物草本香氣，因此推測可能與茶葉中相對含量較高的清新木香型的S-Z-橙花叔醇、(2S,5S)-芳芳醇氧化物A、R-芳芳醇及S-α-紫羅蘭酮等具有一定的聯系。壽眉樣品香氣純正，具有一定的草本清香特征，推測與具有類似香氣特征的萜類化合物對映異構體相關，如S-Z-橙花叔醇、S-α-紫羅蘭酮、R-芳芳醇、S-α-松油醇、(2R,5R)-芳芳醇氧化物A及(2R,5S)-芳芳醇氧化物B等。值得注意的是，除以上揮發性萜類化合物外，在所測白茶香氣成分中仍存在許多其他重要的非手性香氣化合物，如苯甲醛、苯甲醇、苯乙醇、香葉醇及水楊酸甲酯等，它們在色譜圖上的峰響應度均高于本研究的目標揮發性萜類化合物，對白茶整體香氣品質的形成起著重要的作用，但因不是研究重點，不再贅述。此外，由于各揮發性化合物的氣味閾值差別迥異，以上化合物對白茶香氣品質形成的具體貢獻程度目前還無法確定，在今后的延續性工作中將采用香氣活性值法或氣相色譜-嗅聞-質譜聯用技術繼續深入研究。

2.3 福鼎白茶中揮發性萜類化合物的對映異構體分布比較

圖2 福鼎白茶中揮發性萜類化合物對映異構體分布比較Fig. 2 Comparison of enantiomeric distribution of volatile terpenoids among different types of Fuding white teas

實驗結果表明3 類白茶中各揮發性萜類化合物的主導立體構型（ER值＞50%）基本一致，S-檸檬烯、(2S,5S)-芳芳醇氧化物A、(2S,5R)-芳芳醇氧化物B、S-芳芳醇、(2R,5R)-茶螺烷A、(2R,5S)-茶螺烷B、R-4-萜品醇、S-α-松油醇、S-香香醇、S-α-紫羅蘭酮、S-Z-橙花叔醇、S-E-橙花叔醇、(1R,2R)-茉莉酸甲酯及(1R,2S)-茉莉酸甲酯為相應萜類化合物中ER值較高的對映異構體。對不同花色福鼎白茶中揮發性萜類化合物的對映異構體組成分布進行進一步分析。如圖2所示，雖然主導構型一致，但除芳芳醇氧化物B在3 種白茶中的ER值十分接近（3∶97～5∶95）外，大部分萜類化合物的ER值在不同花色的福鼎白茶間具有較明顯的差異性。S-芳芳醇、(2R,5S)-茶螺烷B、R-4-萜品醇、S-香香醇及S-α-紫羅蘭酮在各化合物中的比例值與茶葉的采摘嫩度呈正比關系，在白毫銀針中具有最高的比例值，而在壽眉樣本中比例最低；其中R-4-萜品醇的差異性最為明顯，在壽眉中從主導構型變成次要構型（43%）。橙花叔醇雖然是茶葉“花香”的關鍵嗅感化合物，然而其4 個不同對映異構體中僅R-Z-橙花叔醇及S-E-橙花叔醇呈現花香特性，S-Z-橙花叔醇及R-E-橙花叔醇均呈現青氣及木香氣息[26]；S-Z-橙花叔醇的比例與茶葉采摘嫩度呈反比，在白牡丹和壽眉中的比例值顯著高于白毫銀針中（高達96%），推測該化合物與壽眉呈現的草本清香具有一定的關聯性。具有甜香、花香及奶油香的(2S,5S)-芳芳醇氧化物A在白毫銀針（91%）中的比例值顯著高于白牡丹及壽眉（74%、77%），推測與白毫銀針的“毫香”具有一定的關聯性。以上化合物的對映異構體分布規律為之后白茶的等級鑒別提供了新的技術思路。此外，其他萜類化合物ER值雖然在不同花色間的差異性較為明顯，但未呈現出與嫩度相關的明顯規律性，推測與茶葉本身的原料或品種具有一定的關聯性。

2.4 福鼎白茶中揮發性萜類化合物對映異構體的多元統計分析

為探究3 個不同花色福鼎白茶中揮發性萜類化合物對映異構體含量分布的具體差異性，基于各對映異構體特征離子的峰面積數據進行多元統計分析，如圖3所示。無監督的主成分分析（principal component analysis，PCA）[27]結果表明，白毫銀針、白牡丹及壽眉樣本的揮發性萜類化合物對映異構體輪廓具有較為顯著的差異性，除個別樣本（SM-4）外，各類別樣本可以獲得較好的聚類效果（R2X= 0.896，Q2=0.66；圖3A）。采用進一步PLS-DA[28]對具有顯著含量差異的關鍵萜類化合物對映異構體進行篩選，結果表明，3 種花色的福鼎白茶樣本可被建立的PLS-DA模型較好地區分，且該模型的解釋方差（R2Y=0.957）和交叉驗證的預測能力（Q2=0.866）較為理想。進而對該模型進行200 次交叉驗證，測試結果表明交叉驗證模型的R2和Q2的截距分別為0.361和-0.851，Q2回歸直線與Y軸的截距小于0，R2和Q2回歸線的斜率接近于1，從而證明已建立的PLS-DA模型不存在過擬合現象，且模型具有較強的可靠性（圖3C）。PLS-DA載荷圖（圖3D）表明了各變量與各組別樣本間的關聯性，是變量在PC1和PC2中2 個貢獻率所占程度的可視化表示。其中，越遠離X/Y軸的變量對該PLS-DA模型的貢獻率越大，表示它們在3 個組別間的差異性越顯著；越靠近各組別區域范圍（圖中方形散點附近）的變量與該組別的正關聯性越大；如R-Z-橙花叔醇與白毫銀針樣本存在正相關性，而(1S,2S)-茉莉酸甲酯與白牡丹樣本呈正相關。

圖3 福鼎白茶中揮發性萜類化合物分析Fig. 3 Analysis of differences in volatile terpenoids among different types of white teas

綜合以上分析結果，采用PLS-DA中的變量重要性因子（variable important for the projection，VIP）量化各萜類化合物對映異構體對已建立的PLS-DA模型的具體貢獻率，VIP大于1的化合物被認為是區分不同花色白茶的關鍵性物質，包括S-檸檬烯、(2R,5R)-芳芳醇氧化物A、R-芳芳醇、(2S,5R)-茶螺烷B、(2R,5S)-茶螺烷B、S-α-松油醇、R-α-紫羅蘭酮、R-Z-橙花叔醇、S-Z-橙花叔醇、R-E-橙花叔醇、S-E-橙花叔醇及(1S,2S)-茉莉酸甲酯。為了驗證以上分析結果的可靠性，采用非參數檢驗法（Kruskal-Wallis單因素方差分析）[29]對VIP大于1的12 種萜類化合物對映異構體進行進一步分析，分析結果表明以上化合物在3 個不同花色組別的樣本間存在顯著性差異（P＜0.01）。

最后，采用更直觀的HCA法[30]對這12 種萜類化合物對映異構體的含量分布進行展示。圖4中顏色從綠色方紅色的過渡代表了含量的逐漸增加，越接近紅色表明該化合物在相應茶葉樣本中的峰面積越大。分析結果表明，這12 種化合物可聚類為4 類：1）R-α-紫羅蘭酮在大部分壽眉樣本中具有較高的含量分布；2）R-芳芳醇、(2R,5S)-茶螺烷B、S-α-松油醇、R-E-橙花叔醇、R-Z-橙花叔醇、S-檸檬烯及S-E-橙花叔醇在白毫銀針樣本中的含量顯著高于其他2 種花色白茶；3）(2R,5R)-芳芳醇氧化物A及(2S,5R)-茶螺烷B在白毫銀針樣本中的含量顯著低于白牡丹及壽眉樣本；4）S-Z-橙花叔醇及(1S, 2S)-茉莉酸甲酯在白牡丹樣本中的含量顯著高于其他2 種花色白茶。以上分布規律為白茶花色或等級判別模型的構建提供了新的技術支持，今后將在本研究的基礎上擴大白茶的樣本數量進行深入研究。

圖4 福鼎白茶中關鍵揮發性萜類化合物對映異構體的含量分布熱圖Fig. 4 Heatmap of the quantitative distribution of the key volatile terpenoid enantiomers among different types of Fuding white teas

3 結 論

采用已建立的HS-SPME-手性GC-MS分析方法對11 個不同花色福鼎白茶樣本中的香氣成分進行分析，研究了14 種手性萜類化合物對映異構體在福鼎白茶中的相對含量及比例值。相對含量分析結果表明，S-芳芳醇、S-Z-橙花叔醇及(2S,5R)-芳芳醇氧化物B在白毫銀針、白牡丹及壽眉樣本中普遍具有較高的相對含量，茶螺烷的4 種對映異構體在所有福鼎白茶樣本中均具有極低的相對含量。ER值分析結果表明，3 種花色福鼎白茶中各揮發性萜類化合物的主導立體構型基本一致，其中S-芳芳醇、(2R,5S)-茶螺烷B、R-4-萜品醇、S-香香醇、S-α-紫羅蘭酮及(2S,5S)-芳芳醇氧化物A在各化合物中的比例值與茶葉的采摘嫩度呈正比關系，S-Z-橙花叔醇則呈現相反趨勢。進一步對揮發性萜類化合物對映異構體的含量進行多元統計分析，結果表明，12 種萜類化合物對映異構體的含量分布在不同花色的福鼎白茶樣本中具有顯著性差異，其中R-芳芳醇、(2R,5S)-茶螺烷B、S-α-松油醇、R-E-橙花叔醇、R-Z-橙花叔醇、S-檸檬烯及S-E-橙花叔醇在白毫銀針樣本中含量最高，(2R,5R)-芳芳醇氧化物A及(2S,5R)-茶螺烷B的含量與白毫銀針樣本呈負相關；S-Z-橙花叔醇及(1S, 2S)-茉莉酸甲酯在白牡丹樣本中含量普遍較高；而R-α-紫羅蘭酮的含量在壽眉樣本中有較高的含量分布。以上研究結果填補了對映異構體分析在白茶香氣化學領域的研究空白，為后續白茶香氣品質形成機理研究提供一定的理論依據，也為白茶花色、等級判別及指紋圖譜構建等實際應用提供了良好的技術思路。