小米蛋白的分子組成及結構特性

郭蓮東，徐 麗，歐才智，丁陽月，張高鵬，倪春蕾，程建軍*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

小米（Setaria italica Beauv.），禾本科狗尾草屬植物，是谷子脫殼后的產物，但它并不是一個單一品種，而是珍磁稷、谷子、黍以及穇子[1]等幾種小粒谷物的總稱。小米的營養價值與其他谷物相比相當或更優[2]。與大米和小麥相比，小米含有較高的鈣、膳食纖維和蛋白質[3]；與水稻、玉米和高粱等谷物相比，小米的蛋白質含量與之相等甚至更高[4]。

存在于谷物種子中的蛋白質是在種子發育階段特異性合成的，且受到營養素的調節[5]。傳統上，這些蛋白質根據溶解度的物理性質分為清蛋白（水溶性）、球蛋白（鹽溶性）、醇溶蛋白（醇溶性）和谷蛋白（堿溶性）[6]。其中，醇溶蛋白和谷蛋白[7-9]在大多數谷物中含量較高，受到較多關注。玉米醇溶蛋白不溶于水，但在醇、高濃度尿素、堿（pH≥11）或陰離子洗滌劑存在下可溶，這是由于非極性氨基酸殘留的比例很高，并且缺乏酸性和堿性氨基酸的緣故[8]。玉米醇溶蛋白可分為α-、β-、γ-、δ-醇溶蛋白[10]，α-醇溶蛋白含量占醇溶蛋白總含量的75%～80%，并且根據略有不同的分子質量（19、22 kDa）分為兩組。麥醇溶蛋白主要是單體蛋白質，被分為α-、β-、γ-、ω-麥醇溶蛋白，其分子質量為28～55 kDa。麥谷蛋白是一種聚合物，并且可分為高分子質量組（70～90 kDa）和低分子質量組（20～45 kDa）[11]。麥醇溶蛋白和麥谷蛋白亞基都具有異常高水平的脯氨酸和谷氨酰胺[5]。與小麥、大麥和玉米相比，小米具有較高比例的醇溶蛋白和谷蛋白[12]。其中，小米醇溶蛋白可分為α-、β-、γ-醇溶蛋白[13]，且分子質量較小（約25～26 kDa）[12]；而谷蛋白，一般可以分為高分子亞基組和低分子亞基組[11]。除此之外，有研究表明小米中的蛋白質可能以聚集體的形式存在[14]。趙學偉等[15]對4 種小米蛋白組分的提取、溶解性等功能性質以及相對分子質量做了一定的研究。

目前，谷物蛋白中研究較多的是大豆[16-17]、小麥[7,18]和玉米蛋白[10,19]等，本研究旨在探討小米蛋白組分的結構特性，以期為今后小米產品的開發與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（龍谷25） 黑龍江省肇源縣古龍鎮；考馬斯亮藍G250和R250 上海躍騰生物技術有限公司；氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸 天津市天力化學試劑有限公司；氯化鈉 天津市光復科技發展有限公司；甲醇天津市富宇精細化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）制備試劑盒、牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷 北京太陽神科技有限公司；甘氨酸 北京生物科技有限公司。所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UVmini-1240紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；BG-Power 600i SDS-PAGE儀 北京百晶生物技術有限公司；Alpha 1-2 LDplus冷凍干燥機德國Christ公司；SU8010掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司；DSC 3+差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 瑞士梅特勒-托利多公司；ALPHA-T傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 小米蛋白組分的制備

將小米粉碎過80 目篩，使用索氏抽提法將小米粉中脂肪除去，使用脫脂后的小米粉進行蛋白質的提取。由于傳統上將谷物蛋白根據溶解度分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[6]。用Osborne法[20]分離提取出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。清蛋白和球蛋白分別是水溶性蛋白及鹽溶性蛋白，醇溶蛋白溶于醇溶液，谷蛋白溶于堿性溶液。因此，分別使用蒸餾水、3%氯化鈉溶液、75%乙醇溶液以及氫氧化鈉溶液按照以下流程對脫脂小米粉進行蛋白質的提取（圖1）。

圖1 小米蛋白組分提取的工藝流程Fig. 1 Flow chart of the extraction process for millet protein components

1.3.2 小米蛋白組分含量測定

使用凱氏定氮法[21]確定小米中蛋白質的含量。

1.3.3 SDS-PAGE分析

參考Laemmli[22]的SDS不連續電泳法并稍作改進。將樣品溶于樣品溶解液中，后于100 ℃煮沸3 min，冷卻后待用。分別配制15%分離膠以及5%濃縮膠，待膠凝固后可開始上樣，依次加入5 μL Marker，以及10 μL樣品，上樣后打開電泳儀將電壓調至80 V，當試樣到濃縮膠底端時，電壓調至120 V繼續實驗，當試樣帶距邊緣1 cm處停止電泳。將膠體取出，浸于染色液中染色后，于脫色液中脫色，直到蛋白質區帶清晰。然后繪制標準曲線，計算相對遷移率以及相對分子質量。

1.3.4 SEM觀察

使用SU8010 SEM觀察小米蛋白組分的微觀形態。在加速電壓為5 kV的條件下，于5 000～20 000不同放大倍數下觀察樣品，并使用內置軟件捕獲圖像[14]。

1.3.5 DSC分析

使用DSC儀測量熱穩定性。將1～3 mg蛋白質樣品置于鋁盤內，鋁盤用鋁蓋密封，然后以2.0 K/min的速度在0～300 ℃條件下，使用干燥氮氣以50.0 mL/min恒溫吹掃。使用密封的空鋁盤作為參考。通過STARe軟件從熱分析圖譜中分析變性溫度[23]。

1.3.6 FTIR分析

使用FTIR儀研究小米蛋白組分的二級結構。使用溴化鉀壓片法，將經過冷凍干燥的樣品置于機器上以記錄300～4 000 cm-1范圍內的光譜變化，用32 次掃描和4 cm-1分辨率記錄FTIR光譜[24-25]。

1.4 數據分析

每組實驗進行3 次作為平行，使用SPSS軟件（Windows 13.0）對數據進行顯著性分析，并使用OriginPro 8.5作圖。P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小米蛋白組分含量

經凱氏定氮法測定，小米中總蛋白質質量分數為10.47%，清蛋白占總蛋白含量的4.12%，球蛋白為11.42%，谷蛋白為20.77%，醇溶蛋白為43.02%，與魏益民等[13]研究的結果相似。

2.2 蛋白組分亞基分析

圖2 小米蛋白組分的SDS-PAGE圖Fig. 2 SDS-PAGE images of the millet protein components

由圖2可知，清蛋白具有多條譜帶，在分子質量11～100 kDa的范圍內均有存在，并且高低分子質量范圍內各有1 條較明顯的譜帶，分別為108.17 kDa和23.98 kDa；球蛋白的譜帶主要集中在低分子質量范圍內（11～25 kDa），主要由22.77 kDa等分子質量較小的亞基組成；醇溶蛋白由3 條比較明顯的譜帶，其分子質量分別為18.96、11.86、24.94 kDa等小分子亞基組成，這3 條譜帶分別稱為α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白[13]；谷蛋白存在多條譜帶，可分為低分子亞基組（11～48 kDa）以及高分子亞基組（48～180 kDa），但無特征譜帶出現。同時發現，這4 種蛋白組分有亞基重合現象，如24.94 kDa和16 kDa的亞基在4 種蛋白條帶上均有出現，但條帶深淺不同，可能是蛋白含量不同導致的；分子質量為108.17 kDa和63 kDa的亞基在清蛋白和球蛋白上均有出現，說明清蛋白與其他3 種蛋白組分中存在相同的亞基條帶。

2.3 蛋白組分的微觀結構

圖3 小米中4 種蛋白組分的SEM圖Fig. 3 SEM images of four protein components in millet

從圖3a可見，放大5 000 倍可以清晰地看到清蛋白顆粒，但某些顆粒呈現不規則的球狀，其粒徑范圍約在604～2 500 nm之間，較其他3 種蛋白組分的粒徑偏大；而在圖3b可以看到，球蛋白以簇狀形態存在，顆粒形狀不規則，其粒徑范圍約在319～847 nm之間。醇溶蛋白和谷蛋白均以顆粒形式存在，但是其聚集狀態存在較大差異，醇溶蛋白分子連接緊密，其粒徑范圍約在202～1 310 nm之間，而谷蛋白顆粒之間連接松散，表面光滑，粒徑范圍約在225～686 nm之間（圖3c、d）。Gulati等[14]在黍米粉和提取的蛋白質中觀察到球形蛋白體，以簇狀形態存在，并認為這很有可能是提取過程和樣品制備造成的結果，與本次實驗結果相似。Liao Lan等[7]使用原子力顯微鏡觀察了小麥面筋蛋白的微觀結構，發現小麥面筋蛋白是一種由類島狀和條狀聚集體復合形成的復雜網絡。小米蛋白與小麥蛋白相似，均以聚集體的形式存在。

2.4 熱特性分析

圖4 小米中4 種蛋白組分的DSC曲線Fig. 4 DSC curves of four protein components in millet

熱變性是通過共價和非共價以及疏水相互作用的分子聚集而誘導蛋白質變性[26]。圖4顯示了醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白的DSC熱分析圖譜。這4 種小米蛋白組分的變性溫度分別為110.67、84.80、98.97、71.33 ℃，對應的焓變（ΔH）分別為75.61、78.60、52.23、6.37 J/g。而蛋白質變性所需的能量反映了將其解離成更簡單的結構以及展開蛋白質所需的能量，當蛋白質結構更穩定時，變性溫度就會更高[23]，因此，醇溶蛋白的結構可能比其他3 種蛋白質更穩定。蛋白質有序構象的情況則通過焓變反映出，焓值變化較小表明變性所需要的能量越小[27]，且根據SEM圖（圖3）可以看到，球蛋白顆粒并不像其他3 種蛋白組分較為密集地聚集在一起，可能是谷蛋白顆粒之間的疏水相互作用更強導致的。因此在達到變性溫度后，球蛋白更易于變性，而醇溶蛋白、谷蛋白和清蛋白則需要吸回更多的熱量后才發生變性[28]。

2.5 FTIR分析

圖5 小米中4 種蛋白組分的FTIR圖譜Fig. 5 FTIR spectra of four protein components in millet

圖5 清晰地顯示了小米中醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白的特征紅外吸回峰。存在于1 700～1 200 cm-1之間的吸回峰包含蛋白質和多糖的振動區域[29]。其中酰胺I帶的吸回峰發生在1 600～1 700 cm-1處，它主要是由C＝O以及較弱的C—N伸縮和N—H彎曲引起的[30]。在圖5中，可以看到醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白在此范圍內有1 649、1 645、1 644、1 648 cm-1處的吸回峰；酰胺II帶發生在1 500～1 600 cm-1處，主要是由于C—N伸展以及N—H彎曲振動產生的，圖中分別處于1 518、1 526、1 530、1 523 cm-1的吸回峰則對應酰胺II區域；以及1 444、1 440、1 425、1 424 cm-1附近的酰胺III帶（C—N吸回峰）。在3 285 cm-1處4 種蛋白樣品出現了強且寬的吸回峰，這主要是O—H鍵伸縮振動吸回，該吸回峰較強所以干擾了出峰位置相近的N—H伸縮振動吸回峰。

而多糖的吸回峰所在的區域位于900～1 200 cm-1，在此范圍內出現了多糖及其糖類異構體的吸回，其中1 145 cm-1附近吸回峰歸屬為C—O以及C—C鍵的伸縮振動；1 012 cm-1附近吸回峰歸屬為C—O鍵的伸縮振動以及C—OH的彎曲振動。這可能是由于蛋白組分中存在糖蛋白，這有待于進一步探討。

擬合圖譜中各子峰與二級結構對應關系為：1 650～1 660 cm-1附近的吸回峰為α-螺旋，1 610～1 642 cm-1為β-折疊結構，1 660～1 680 cm-1為β-轉角，1 680～1 700 cm-1為β-反平行折疊，1 642～1 650 cm-1為無規卷曲[31]。從表1可以看到，小米蛋白的二級結構中存在α-螺旋、β-折疊、β-轉角、β-反平行折疊，但是未發現無規卷曲結構。除清蛋白外，其他3 種蛋白組分中均以β-折疊結構為主，其次是α-螺旋和β-轉角，β-反平行折疊含量最低，醇溶蛋白的β-轉角以及β-反平行折疊結構最豐富，并與其他蛋白結構含量差異顯著（P＜0.05）。本研究結果與Beck等[32]等通過擠壓豌豆分離蛋白所形成的蛋白質聚集物二級結構的組成一致，都是由α-螺旋、β-折疊、非共價鍵合的β-轉角或反平行β-折疊結構形成。

表1 小米蛋白組分的二級結構含量Table 1 Secondary structure contents of millet protein components

3 結 論

通過SDS-PAGE、SEM、DSC以及FTIR對小米中的4 種蛋白組分進行結構分析。從SDS-PAGE圖像觀察到醇溶蛋白是由低分子質量亞基（11～25 kDa）構成，有3 條比較明顯范圍的條帶，分別為α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白；而清蛋白、球蛋白和谷蛋白亞基分布較廣（11～180 kDa），其中清蛋白所含亞基數目最多，并且清蛋白與其他3 種蛋白組分中存在相同的亞基條帶，如24.94 kDa和16 kDa的亞基在4 種蛋白條帶上均有出現。

SEM圖與DSC圖譜顯示，球蛋白顆粒并不像其他3 種蛋白組分較為密集地聚集在一起，且焓值變化較其他3 種蛋白組分更小，因此在達到變性溫度后，球蛋白更易于變性。而醇溶蛋白的變性溫度最高，其蛋白質結構較其他3 種蛋白質的結構更穩定。

FTIR圖譜顯示，4 種蛋白組分處于酰胺I帶的吸回峰對應α-螺旋、β-折疊、β-轉角、β-反平行折疊，但是未發現無規卷曲結構。除清蛋白以外，其他3 種蛋白組分的二級結構含量：β-折疊＞α-螺旋＞β-轉角＞β-反平行折疊。醇溶蛋白的β-轉角以及β-反平行折疊結構含量比其他3 種蛋白組分更豐富，并與其他蛋白結構含量差異顯著（P＜0.05）。