UPLC-MS/MS測定葡萄酒中29 種單體酚方法的建立

楊志偉，王圣儀，齊鵬宇，張 昂*，李 響，王 飛，張進杰

（秦皇島出入境檢驗檢疫局技術中心，河北 秦皇島 066004）

多酚類化合物是葡萄的重要次生代謝產物和葡萄酒中重要組成成分，主要來源于葡萄、微生物發酵和橡木桶，直接關系著葡萄酒的貯藏時間、色澤、苦味、回斂性等特性[1]，同時具有抗癌、清除自由基及預防心血管疾病等多種功能[2-4]，是葡萄酒中營養成分的主要來源。因此分析葡萄酒中酚類物質的種類和含量，建立同時快速、準確分析葡萄酒中多種酚類物質的方法，可以為葡萄酒行業及相關檢測機構提供真偽鑒別和等級評定新方法，對全面評價葡萄酒品質有重要意義[5-6]。

酚類化合物是含有酚官能基團的物質，葡萄酒中酚類化合物根據結構不同主要分為非類黃酮類和類黃酮類[7]，其中類黃酮類根據其分子結構可分為黃酮醇、花色素、黃烷醇類；非類黃酮類主要為酚酸類化合物[8-9]。葡萄酒中酚類物質種類和含量受選用葡萄品種、釀造方式、陳釀方式等因素影響[10-11]。

目前國內關于葡萄酒中單體酚的定性和定量檢測，主要有高效液相色譜[12]（high performance liquid chromatography，HPLC）法、高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技術[13-15]和超高效液相色譜[16-17]（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法等。許婷婷等[18]利用HPLC法研究了葡萄酒中9 種單體酚的檢測方法，檢測單體酚種類少且回回率較低；孫翔宇等[19]利用反相-HPLC法和HPLC-MS法同時測定葡萄酒中16 種單體酚含量，檢測單體酚種類較少且時間長；張星星等[16]利用UPLC法測定葡萄酒中17 種酚類物質，該方法檢測時間較短，但由于葡萄酒中受多種成分影響，很難將全部單體酚分離，因此僅通過保留時間色譜圖分析對定量結果影響較大。

UPLC-MS/MS技術可以在HPLC-MS基礎上進行2 次質量數篩選，盡可能降低背景噪音。這種技術的檢測靈敏度高，近年來以縮短檢測時間、分離能力強等優點迅速發展[20-21]。目前國內外學者利用UPLC-MS/MS在檢測藥物[22-23]或食品[24]中酚類物質的研究較多。Maric等[25]使用UPLC-MS/MS建立了從植物粗提物中原花青素的快速定性定量方法；羅益遠等[26]利用UPLC-MS/MS技術建立測定何首烏中二苯乙烯、蒽醌、黃酮和酚酸等共14 種目標成分的方法；Ortega等[27]對UPLC-MS/MS和HPLC-MS/MS測定可可樣品中原花青素和生物堿進行比較，結果表明，UPLC-MS/MS技術能夠在12.5 min內以低濃度水平測定原花青素含量。

故本實驗采用UPLC-MS/MS技術建立快速定性定量分析葡萄酒中29 種單體酚的測定方法，以期為葡萄酒中多種單體酚類化合物的同時檢測提供新方法，為葡萄酒相關研究提供方法學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單體酚標準品（純度≥95%）：沒食子酸（gallic acid，GA）、原兒茶酸（protocatechuate acid，PA）、(+)-兒茶素（(+)-catechin，CA）、(-)-表兒茶素（(-)-epicatechin，EC）、(-)-表沒食子兒茶素（(-)-epigallocatechin，EGC）、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）、(-)-表兒茶素沒食子酸酯（(-)-epicatechin gallate，ECG）、咖啡酸（caffeic acid，CAA）、反式阿魏酸（trans-ferulic acid，FA）、對香豆酸（trans-p-coumaric acid，p-CA）、綠原酸（chlorogenic acid，CGA）、順式白藜蘆醇（cis-resveratrol，cis-Res）、反式白藜蘆醇（trans-resveratrol，trans-Res）、順式白藜蘆醇-3-O-β-D-葡萄糖苷（resveratrol-3-O-β-D-glycoside，Res-3-Gly）、山柰酚（kaemperol，Kae）、槲皮素（quercetin，Que）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（quercetin-3-glucoside，Que-3-Glu）、楊梅素（myricetin，Myr）、桑色素（morin hydrate，Mor）、漆黃素（fisetin，Fis）、芹菜素（apigenin，Api）、木犀草素（luteolin，Lut）、牡荊素-2-O-鼠李糖苷（vitexin，Vit）、原花青素B1（procyandin B1，Pro B1）、原花青素B2（procyandin B2，Pro B2）白皮杉醇（piceatannol，Pic）、香草酸（vanillic acid，VA）、葡萄素（viniferin，Vin）、紫鉚因（butein，But） 德國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

30-AD液相色譜儀 日本島津公司；Triple Quad?4500三重四極桿-線性離子阱復合質譜儀（配有電噴霧離子源、Turbo V離子源和Analyst 1.5數據處理系統） 美國AB Sciex公司；ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；Milli-Q去離子水機 美國Millipore公司；3-30KS超高速離心機 美國熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 UPLC條件

柱溫為30 ℃，進樣體積10 μL，流速0.25 mL/min，C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分離，根據單體酚性質確定流動相A為0.1%甲酸水；流動相B為0.1%甲酸乙腈。洗脫程序：0.00～3.00 min，5% B；3.00～6.00 min，30% B；6.00～9.00 min，50% B；9.00～12.00 min，70% B；12.00～17.00 min，5% B。

1.3.2 MS條件

電噴霧離子源，負離子模式；多反應監測；離子源溫度500 ℃；電噴霧電壓-4 500 V；氣簾氣壓力40 psi；碰撞氣：Medium；霧化氣壓力60 psi；輔助加熱氣壓力50 psi。

1.3.3 單體酚標準溶液和基質液配制

將29 種單體酚的標準品使用0.1%甲酸-甲醇溶液配制成100 mg/L的標準儲備液，于-20 ℃保存。使用時將單體酚標準儲備液使用10%甲醇（含有0.1%甲酸）溶液逐級稀釋成所需質量濃度標準工作液或混合標準工作液。

將150 mL乙醇和3 g酒石酸移入1 L的容量瓶中，去離子水定容，得到模擬酒樣，使用時取出適量模擬酒樣，再加入目標質量濃度的單體酚的單標或混標使用。

1.3.4 樣品前處理

取1 mL待測酒樣用10%甲醇溶液（含0.1%甲酸）稀釋100 倍，26 000 r/min離心5 min后取上清液進行測定，根據測定結果重新取樣1 mL稀釋至適當濃度重復離心，離心后取上清液至進樣瓶待測。

2 結果與分析

2.1 前處理優化

圖1 3 種濾膜與直接進樣比較Fig. 1 Comparison of 3 filter membranes with direct injection

由于直接進樣中雜質會對儀器造成影響，而微孔濾膜過濾會對單體酚產生吸附，本實驗采用尼龍66濾膜、親水性聚丙烯濾膜、聚醚砜濾膜和超高速離心沉淀去除雜質后對進樣結果進行比較，結果見圖1。每種濾膜對不同單體酚的吸附程度存在差異，其中尼龍66濾膜對29 種單體酚的吸附率為36.99%～67.59%，親水性聚丙烯濾膜的吸附率為39.12%～71.03%，聚醚砜濾膜的吸附率為31.56%～77.39%，由于3 種不同材質微孔濾膜均會對樣品產生明顯吸附作用，因此為實現標準物質對目標物準確定性定量，本實驗選擇超高速離心沉淀后直接進樣的前處理方法。

2.2 質譜參數優化

采用注射泵直接將標準溶液注入離子源的方式對29 種單體酚質譜參數進行優化。分別將29 種單體酚質量濃度為1 mg/L標準工作液以0.01 mL/min流速將標準工作液注入離子源，負離子化模式下對每種單體酚進行一級質譜分析（Q1），得到母離子峰。在進行目標離子二級掃描（MS2），得到碎片離子。

選取響應最高的2 個碎片離子用于定性與定量，進行條件優化得到相關參數，見表1。

表1 29 種單體酚質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters for 29 monomeric phenols

2.3 色譜條件優化

由表1可知，通過質譜參數已經可以將大部分單體酚進行定性定量分析，但仍有少部分同分異構體結構無法通過離子對區分，因此需要選擇最佳色譜柱和流動相進行分離，通過不同保留時間對目標化合物進行定性定量測定。在1.3.1節條件下，29 種單體酚測定結果見圖2和表2、3。如圖2所示，使用C18色譜柱對29 種單體酚混合標準液的分離條件進行優化，發現其中3 對離子對質量數相同的化合物，trans-Res與Res-3-Gly、CA與EC、Pro B1與Pro B2能夠良好分離。對流動相組成和甲酸等條件進行優化，結果表明采用0.1%甲酸-乙腈和0.1%甲酸水作為流動相進行梯度洗脫，得到良好峰形，基質干擾小。

圖2 29 種單體酚總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of 29 monomeric phenols

表3 單體酚結構Table 3 Structural formulas of monomeric phenols

續表3

2.4 線性關系、檢出限及定量限測定結果

表4 方法學驗證Table 4 Methodological validation

續表4

在1.3.3節模擬酒基質液中定量加入29 種單體酚的混合標準溶液，分別在0.00、0.001、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500 mg/L水平下測定，分別以目標化合物峰面積（y）對其相應質量濃度（x）繪制標準曲線。按照1.3.4節樣品前處理方法制備樣品，平行實驗6 次，分別在0.01、0.10 mg/L和1.00 mg/L 3 個質量濃度進行添加，計算加標回回率和相對標準偏差，按信噪比3∶1得到目標化合物檢出限，10∶1得到目標化合物的定量限，結果見表4。29 種單體酚的定量限在0.001～0.01 mg/L之間，線性相關系數R2均大于0.99，加標回回率在90.8%～104.5%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在0.26%～7.54%之間。

2.5 實際樣品的檢測結果

表5 實際樣品中單體酚測定結果及稀釋倍數（n=27）Table 5 Results of determination and corresponding dilution folds of monomeric phenol in actual samples (n= 27)

為驗證方法可行性，對市售的27 種干紅、干白與桃紅葡萄酒進行檢測，其中干紅葡萄酒19 種，桃紅葡萄酒1 種，干白葡萄酒7 種。由于葡萄酒中的每種單體酚含量相差過大，需先將樣品稀釋100 倍進行預實驗，再根據結果分別將酒樣成倍稀釋，以保證每種單體酚測定結果都在線性范圍內，測定結果及稀釋倍數見表5，部分酒樣總離子流圖與標準品對照見圖3。

圖3 3 種不同類型葡萄酒總離子流與標準品對照圖Fig. 3 Comparative total ion current chromatograms of three different types of wine and reference standards

大多數的干紅葡萄酒與桃紅葡萄酒可以檢出PA、p-CA、VA、GA、CAA、FA、Res-3-Gly、trans-Res、Pic、CA、EC、Que、EGC、Myr、Pro B1、Pro B2、Res-3-Gly、Que-3-Glu這18 種單體酚，與張協光[28]和Leonhard[5]等的檢測結果比較，利用UPLC-MS/MS建立的方法能檢出更多單體酚類物質，且檢出限和定量限更低，能同時對3 組同分異構體進行測定。

這18 種單體酚化合物在葡萄酒中總量在75.560～331.243 mg/L之間，其中兒茶素在多數干紅葡萄酒中含量最高。干白葡萄酒所檢出的單體酚種類在11～17 種之間，cis-Res、trans-Res、Pic、Myr、Res-3-Gly、Que-3-Glu、Pro B2在部分干白葡萄酒中未檢出，且檢出這17 種單體酚化合物總量在8～40 mg/L之間，其中GA、PA和Res在干紅葡萄酒中的檢測結果范圍與李巍[29]和趙建勇[30]等測定結果接近。

3 結 論

本實驗采用UPLC-MS/MS技術建立了葡萄酒中29 種單體酚定性定量的檢測方法，通過儀器條件、流動相等優化考察，最終得到方法檢出限在0.000 3～0.003 mg/L之間，定量限在0.001～0.01 mg/L之間，加標回回率在90.8%～104.5%之間。

這種檢測方法操作簡便、靈敏度高、實用性強，相比于已有方法，檢測時間短且檢出限低，經方法學驗證，該方法能滿足葡萄酒中29 種單體酚的日常檢測要求，可應用于葡萄酒監測工作。