基于SPME-GC-MS分析熏制材料對熏雞腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

劉登勇，趙志南，吳金城，鄒玉峰，王 逍，李明倩

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及發(fā)全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量發(fā)全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

煙熏肉制品是典型的中華傳統(tǒng)熟肉制品，是指腌制或熟制后的肉，以煙熏、高溫氣體或固體等為介質(zhì)熱加工制作而成[1]。煙熏肉制品一般采用富含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的硬木進(jìn)行熏制[2]。而我國北方，白砂糖熏制較普遍，且產(chǎn)品色澤誘人，風(fēng)味獨(dú)特，其中以溝幫子熏雞、卓資山熏雞最為著名[3-4]。還有部分煙熏肉制品為追求獨(dú)特風(fēng)味而添加一些茶末、稻糠、橘皮等熏材，例如徽州地區(qū)傳統(tǒng)的名菜茶熏雞[5]。

近年來，關(guān)于煙熏風(fēng)味的研究主要集中于果木等含纖維素較多的熏制材料以及煙熏液等。周緒霞等[6]研究了栗木、櫸木和桂圓木對煙熏鰹魚揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)栗木熏制的鰹魚煙熏味較明顯，桂圓木熏制品風(fēng)味更豐富，而櫸木熏制品含氮類物質(zhì)含量相對較高。Kosowska等[7]利用氣相色譜-嗅覺測量法和香氣提取物稀釋分析法對煙熏腰肉（分別采用山毛櫸、榿木熏制）的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)是煙熏過程產(chǎn)生的典型物質(zhì)，醛類物質(zhì)是肉本身在加熱過程中產(chǎn)生的物質(zhì)。Pino等[8]從稻殼煙熏液中分離鑒定出93 種化合物，其中2-甲氧基苯酚、4-甲基-2-甲氧基苯酚、2-糠醛等14 種酚類和呋喃類物質(zhì)是主要?dú)馕痘钚曰衔铩５壳瓣P(guān)于多種材料混合熏制的研究較少，特別是糖熏對肉制品風(fēng)味物質(zhì)影響的研究鮮有報道。

本實(shí)驗(yàn)以白砂糖、果木屑、紅茶末作為煙熏材料熏制的雞腿為研究對象，通過固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀技術(shù)分離鑒定煙熏雞腿肉的風(fēng)味物質(zhì)，采用面積歸一化法，結(jié)合相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV），確定不同熏制材料的主體風(fēng)味活性物質(zhì)，為煙熏材料的選擇和優(yōu)化、熏雞的生產(chǎn)加工及風(fēng)味評價提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍雞腿（180～200 g，品種為AA雞）、蘋果木屑、紅茶末 市購；白砂糖 南京甘汁園糖業(yè)有限公司；食鹽 大連鹽化集團(tuán)有限公司。

C7～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 美國Supelco公司；乙醇（色譜純）、環(huán)己酮標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C型GC-MS聯(lián)用儀 美國發(fā)捷倫公司；SPME裝置、20 mL頂空鉗口樣品瓶、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司；PL203型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SY-1230型恒溫水浴槽 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；C-MAG HP10電熱板 德國IKA集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

以雞腿肉為原料，解凍清洗后，用5%食鹽水煮制30 min，瀝干湯汁后熏制。將不銹鋼桶放到電熱板上加熱，以白砂糖、蘋果木屑、紅茶末作為基礎(chǔ)熏制材料，按照完全隨機(jī)組合共分為7 組（木熏組、茶熏組、糖熏組、糖-木熏組、糖-茶熏組、木-茶熏組、糖-木-茶熏組），每組按等質(zhì)量比各稱取24 g，放入不銹鋼桶底。待熏制材料中心溫度達(dá)到270 ℃后，開始熏制樣品，熏制時間5 min。將得到的樣品冷卻后真空包裝，并置于-18 ℃貯藏備用，以未熏制的雞腿作為對照組。

1.3.2 風(fēng)味物質(zhì)分離

揮發(fā)性物質(zhì)富集：將冷凍熏雞樣品置于4 ℃條件下緩慢解凍12 h，稱取4 g樣品（雞皮與雞肉質(zhì)量比1∶3）轉(zhuǎn)移至20 mL頂空瓶中，快速用聚四氟乙烯隔墊迅速封口。將頂空瓶置于50 ℃水浴條件下預(yù)熱10 min，55 ℃水浴條件下用SPME萃取針（已活化）頂空萃取45 min后，將萃取針插入GC進(jìn)樣口進(jìn)行解吸，解吸溫度250 ℃、解吸時間4 min。

GC條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；前進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣（He）流速1.0 mL/min；不分流模式進(jìn)樣；程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至70 ℃，以5 ℃/min升至180 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。

MS條件：電子電離源；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～550。

1.3.3 風(fēng)味物質(zhì)鑒定

熏雞風(fēng)味物質(zhì)鑒定結(jié)果通過計算機(jī)譜庫（Nist/Wiley）進(jìn)行檢索，并配合手動檢索校對信息，正反匹配度均大于800（最大值為1 000）或有一個匹配度大于900的成分作為定性結(jié)果。采用與樣品分析相同的色譜條件，以C7～C30正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，計算揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)。各化合物峰面積由軟件系統(tǒng)計算。利用面積歸一化法計算各揮發(fā)性成分在熏雞揮發(fā)性氣味物質(zhì)中的相對含量。參考劉登勇等[9]的方法計算各成分的ROAV，并據(jù)此確定主體風(fēng)味成分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件和SPSS 19軟件中的單因素方差分析（ANOVA）法和Duncan多重比較法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，結(jié)果以表示，P＜0.05，差異顯著。并采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行GC-MS數(shù)據(jù)的主成分分析。每個實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME-GC-MS檢測結(jié)果及ROAV鑒定關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)

采用SPME結(jié)合GC-MS提取熏雞腿肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。如表1可知，熏雞腿中共鑒定出92 種化合物，包括烴類22 種、醇類7 種、醛類13 種、酮類6 種、酚類8 種、呋喃類15 種、含氮/硫化合物13 種、醚類4 種、酯類3 種、酸類1 種。不同煙熏組中檢測到的揮發(fā)性化合物存在顯著差異（P＜0.05），對照組中相對含量最高的為烴類化合物（43.44%）；茶熏組中相對含量較高的為含氮/硫類化合物（13.36%），是其他煙熏組相對含量的4.9～111 倍；木熏組中相對含量較高的物質(zhì)有愈創(chuàng)木酚（12.75%）、2-呋喃甲醛（40.45%）、5-甲基-2-呋喃甲醛（11.43%），其中，愈創(chuàng)木酚的相對含量是其他煙熏組的2.6～45.6 倍；糖熏組中相對含量較高的物質(zhì)為2-呋喃甲醛（75.30%）、5-甲基-2-呋喃甲醛（11.01%）。化合物相對含量的高低并不能說明其對風(fēng)味的貢獻(xiàn)度大小[10]，還需結(jié)合各揮發(fā)性成分香味閾值，進(jìn)行ROAV分析。通過查詢，共找到47 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的香味閾值[11-13]（表2），因此，本實(shí)驗(yàn)只對查到閾值的化合物進(jìn)行分析。其中，飽和烷烴類物質(zhì)由于感覺閾值很高，幾乎不產(chǎn)生明顯嗅感；16 個碳原子以上的醇類、醛類、羧酸類和酯類等物質(zhì)在食品中正常的濃度范圍內(nèi)也幾乎沒有氣味[14]。這些化合物雖然相對含量很高，但本研究目的是確定關(guān)鍵風(fēng)味化合物，故此處不作詳細(xì)分析。

烴類（除萜烯類化合物）主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂。如表2所示，ROAV大于1的烴類化合物只有1 種，Shahidi等[15]認(rèn)為無論飽和烴還是不飽和烴在食品風(fēng)味形成過程中發(fā)揮的作用均較小。D-檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣[16]，是茶熏組和木-茶熏組烴類物質(zhì)中的主要風(fēng)味成分（ROAV≥1），對其他煙熏組和對照組的風(fēng)味也有一定的修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。

表1 熏雞腿中揮發(fā)性物質(zhì)相對含量及種類Table 1 Relative contents and types of volatile compounds in smoked chicken thighs

續(xù)表1

飽和脂肪醇的閾值較高，對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)相對較小，而不飽和醇的閾值相對較低，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[17]。由表2可知，ROAV不小于1的醇類只有1-辛烯-3-醇，且ROAV在8.24～57.72范圍內(nèi)，是對照組和煙熏組主要的風(fēng)味成分，對樣品整體風(fēng)味具有較大貢獻(xiàn)。1-辛烯-3-醇是由亞油酸或其他多不飽和脂肪酸自動氧化形成[18]，主要呈現(xiàn)蘑菇味、泥土味和柑橘、玫瑰氣味[19-20]，還可增強(qiáng)肉中的脂肪香味。

醛類物質(zhì)具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，濃度高且閾值較低，是熟肉中重要的風(fēng)味化合物。有研究報道己醛、辛醛、壬醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛等醛類物質(zhì)是煮雞肉中主要的氣味化合物[21]。由表2可知，ROAV不小于1的醛類有己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛等低碳原子直鏈飽和脂肪醛以及(E)-2-辛烯醛等烯醛，表明它們在對照組和煙熏組雞腿肉香氣中起重要作用。前期研究表明，醛類主要來源于脂質(zhì)氧化[22]。例如，己醛和庚醛主要由亞油酸和花生四烯酸的氧化產(chǎn)生[23]，而辛醛和壬醛則由油酸氧化產(chǎn)生[24]。己醛對木-茶-糖熏組的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，具有草本風(fēng)味[25]，癸醛的嗅覺閾值較低，僅為0.1 ng/g，在樣品風(fēng)味中起重要作用（ROAV在14.12～100范圍內(nèi)）。辛醛和壬醛在茶-糖熏組中ROAV分別達(dá)到63.66和100，說明對該組的風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)。庚醛具有強(qiáng)烈而不愉快、粗糙刺鼻的氣味，在茶熏組中ROAV為12.97，貢獻(xiàn)較大。與對照組相比，茶熏組、木-茶-糖熏組中醛類風(fēng)味物質(zhì)（ROAV≥1）中的戊醛貢獻(xiàn)較大，具有果香和面包香[26]。除直鏈飽和脂肪醛，烯醛也是雞肉脂肪受熱時的特征香氣呈味物。(E)-2-辛烯醛對7 組樣品風(fēng)味均有貢獻(xiàn)。木-茶組和木-茶-糖組的醛類風(fēng)味物質(zhì)（ROAV≥1）中的(E)-2-壬烯醛貢獻(xiàn)較大，其屬于不飽和烯醛，賦予雞腿肉脂肪香氣。

酮類物質(zhì)可通過脂肪氧化降解生成，也可能來自美拉德反應(yīng)[27]。如表2所示，2-壬酮在對照組風(fēng)味中具有重要的修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。2,5-辛二酮的ROAV較高，在3.36～43.03范圍內(nèi)，對煙熏雞腿的風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)。酮類物質(zhì)主要是在雞腿肉高溫煮制過程中產(chǎn)生，而在煙熏階段，酮類物質(zhì)可作為中間產(chǎn)物通過氧化降解形成其他物質(zhì)[28]。由于酮類在熏雞腿中種類較少、相對含量低且閾值比部分醛類高，因此，對熏雞腿風(fēng)味貢獻(xiàn)不突出。

酚類物質(zhì)被描述為煙熏香、焦香味，是煙熏肉制品特殊的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要由煙熏材料中的木質(zhì)素分解生成[29]。煙熏過程中，木質(zhì)素首先分解為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，近而形成愈創(chuàng)木酚的同系物，如4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚等，這些化合物是肉制品傳統(tǒng)煙熏風(fēng)味的主要來源[30-31]。由表2可知，含有蘋果木或紅茶末的煙熏組中均檢測到愈創(chuàng)木酚，愈創(chuàng)木酚是木熏組中貢獻(xiàn)最大的風(fēng)味物質(zhì)（ROAV=100），這也可在木-茶、木-糖、木-茶-糖熏組中得到驗(yàn)證（ROAV分別為74.55、11.67、5.47），說明愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是木熏最主要的風(fēng)味物質(zhì)，這與Kosowska等[7]研究的酚類物質(zhì)是木熏過程產(chǎn)生的典型風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果一致。愈創(chuàng)木酚也是茶熏組中貢獻(xiàn)較大的風(fēng)味物質(zhì)（ROAV＝11.02），這可在木-茶、茶-糖、木-茶-糖熏組中得到驗(yàn)證（ROAV在5.47～74.55范圍內(nèi)），說明愈創(chuàng)木酚也是茶熏主要的風(fēng)味物質(zhì)，同時4-甲基愈創(chuàng)木酚對茶熏組風(fēng)味有一定的修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。而對照組和糖熏組中未檢測到酚類物質(zhì)，進(jìn)一步說明酚類物質(zhì)是木熏和茶熏產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)，與煙熏材料中是否存在木質(zhì)素有關(guān)。

呋喃類物質(zhì)是糖裂解反應(yīng)和美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，是熏雞風(fēng)味中重要的雜環(huán)化合物。如表2所示，2-戊基呋喃對8 組樣品風(fēng)味均有較大貢獻(xiàn)（ROAV≥1），2-戊基呋喃是一種衍生自亞油酸和其他n-6脂肪酸的非羧基化合物，具有相對較低的閾值，呈植物芳香味[32]，是雞肉加熱過程中產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)[33]。所有含木屑或白砂糖的煙熏組中均檢測到2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛（ROAV≥1），對照組和茶熏組中未檢測到。2-呋喃甲醛是糖熏組中貢獻(xiàn)最大的風(fēng)味物質(zhì)（ROAV=100），在含有白砂糖的煙熏組中，如木-糖熏組、茶-糖熏組、木-茶-糖熏組中貢獻(xiàn)較大（ROAV分別為61.56、98.2、100），5-甲基-2-呋喃甲醛對熏雞腿整體風(fēng)味貢獻(xiàn)趨勢與2-呋喃甲醛相似，說明2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛是糖熏產(chǎn)生的最主要風(fēng)味物質(zhì)。2-呋喃甲醛可能是由熏制過程中蔗糖熱解產(chǎn)生[34]，通過煙氣吸附滲透到熏雞中，賦予雞肉焦糖香氣，與劉君等[35]利用糖熏工藝熏制雞肉的結(jié)果一致。2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛在木熏組中貢獻(xiàn)也較大（ROAV分別為23.79、5.38），可在木-茶熏組中得到驗(yàn)證（ROAV為53.11、8.17），說明2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛也是木熏產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)。同時，2-乙酰基呋喃呈現(xiàn)甜香以及青香味，在熏雞腿風(fēng)味中起著一定的協(xié)調(diào)、平衡的作用。綜上2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛等糠醛類是糖熏風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者，對木熏風(fēng)味構(gòu)成也有一定貢獻(xiàn)。

含氮化合物一般有烤香香氣特征，主要來源于美拉德反應(yīng)，含硫化合物對肉的基礎(chǔ)香味有重要貢獻(xiàn)[36]。由表2可知，二甲基二硫醚只在對照組風(fēng)味中有較大貢獻(xiàn)（ROAV≥1），對肉香味形成具有重要作用，而實(shí)驗(yàn)組中未檢測到二甲基二硫醚，可能是被煙熏產(chǎn)生的酚類、呋喃類等化合物的濃烈煙熏味所湮沒。與其他樣品組相比，茶熏組中新增了含氮化合物2,6-二乙基吡嗪，占茶熏組總揮發(fā)性物質(zhì)含量的13.36%。2,6-二乙基吡嗪的香味特征主要為堅果、泥土和類似土豆風(fēng)味[37]，且只對茶熏組的風(fēng)味有貢獻(xiàn)（ROAV≥1），說明2,6-二乙基吡嗪是茶熏的主體風(fēng)味物質(zhì)。

此外本實(shí)驗(yàn)還檢出一定含量的醚類、酸類、酯類化合物，對熏雞腿風(fēng)味的形成具有一定的影響。1-甲氧基-4-甲基-苯對木熏組雞腿風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)（0.1≤ROAV＜1）。乙酸感覺閾值高達(dá)22 000 ng/g，還可與醇類物質(zhì)反應(yīng)生成酯類，因此對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。乙酸乙酯和乙酸己酯在對照組中主要起到輔助修飾作用（0.1≤ROAV＜1），呈現(xiàn)甜香、清香香氣[38]。以上這些物質(zhì)主要對熏雞腿風(fēng)味起到協(xié)調(diào)、平衡的作用。

2.2 關(guān)鍵揮發(fā)性化合物主成分分析

為進(jìn)一步研究不同熏制材料對熏雞腿特征風(fēng)味的影響，選取對熏雞腿揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)進(jìn)行主成分分析。醛類、醇類和酮類等化合物對熏雞風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，它們主要是由肉本身在加熱過程中發(fā)生脂肪氧化降解等反應(yīng)形成[39]，故此處不做分析。由表2可知，愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在含有木屑、紅茶末的煙熏組中ROAV均較高，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，故選取這4 種酚類物質(zhì)。呋喃類物質(zhì)中，2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛、2-戊基呋喃在含有白砂糖、木屑的煙熏組中ROAV較大，故選取這3 種呋喃類物質(zhì)，而2,6-二乙基吡嗪只在茶熏組中ROAV較大，對茶熏組風(fēng)味貢獻(xiàn)最大。這些揮發(fā)性化合物以不同的比例分別形成了熏雞腿獨(dú)特風(fēng)味，因此，選取以上8 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析。

圖1 主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和樣品主成分分析圖Fig. 1 Principal component analysis plot for selected volatile fl avor compounds of smoked chicken thighs

如圖1所示，根據(jù)特征值大于1的原則，共提取到2 個主成分，反映了原始數(shù)據(jù)提供信息總量的80.7%。木熏組、木-茶熏組等熏材中含有木屑的煙熏組中，愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚等酚類化合物貢獻(xiàn)較大，5-甲基-2-呋喃甲醛等呋喃類物質(zhì)也有貢獻(xiàn)；糖熏組、木-糖熏組等熏材中含有白砂糖的煙熏組，主要貢獻(xiàn)物質(zhì)為2-呋喃甲醛和5-甲基-2-呋喃甲醛等呋喃類化合物；2-戊基呋喃是對照組雞肉產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物，2,6-二乙基吡嗪在茶熏組中貢獻(xiàn)較大。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用SPME結(jié)合GC-MS聯(lián)用儀，并通過計算“ROAV”的方法，對果木屑、紅茶末、白砂糖熏制的雞腿進(jìn)行測定。結(jié)果表明，從熏雞腿中共鑒定出92 種揮發(fā)性物質(zhì)。根據(jù)ROAV結(jié)果并借助主成分分析法發(fā)現(xiàn)，2-呋喃甲醛和5-甲基-2-呋喃甲醛等糠醛類化合物是糖熏最主要的風(fēng)味物質(zhì)；愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)是木熏最主要的風(fēng)味物質(zhì)，2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛等糠醛類物質(zhì)也有較大貢獻(xiàn)；2,6-二乙基吡嗪等含氮化合物和愈創(chuàng)木酚類化合物是茶熏主要的風(fēng)味物質(zhì)。研究結(jié)果為后續(xù)深入研究煙熏肉制品風(fēng)味形成機(jī)理、指導(dǎo)風(fēng)味品質(zhì)精準(zhǔn)調(diào)控等提供依據(jù)。