響應面法優化超聲輔助酶解制備藏系羊胎盤肽工藝及抗氧化能力分析

任海偉，石菊芬，蔡亞玲，范文廣，姜啟興，李志忠,*，裴佳雯，王彥蕊

（1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

生物活性肽是一類對人體功能具有積極作用，并可能最終影響健康的特殊蛋白質片段[1]。生物活性肽一般含有3～20 個氨基酸，不僅具有較高營養價值，還有促進礦物結合、免疫調節、抗菌、抗氧化、抗血栓、降膽固醇、降血壓和抗腫瘤等生物學功能[2]。因其發全性高、來源豐富、生理功效明顯和易于消化吸回等優點，生物活性肽一直是功能性食品的關注熱點，其中抗氧化活性肽的研究較為廣泛。研究表明，許多生物活性肽在母體蛋白中不一定有活性，但如果在體內或體外用適當生物學方法處理后，一些具有抗氧化活性的肽片段就會被釋放[3]，從而能夠保護身體免受活性氧（羥自由基、超氧陰離子自由基和H2O2等）和活性氮（NO、ONOO—、ONOOH）等自由基的攻擊，預防相關疾病的發生[4]。

目前，抗氧化肽的制備主要有酶解法、微生物發酵法和化學合成法等方法，其中酶解法條件溫和，水解程度易控制，能定位生產特定的肽，被視為一種常用的方法[5]。Cai Luyun等[6]使用堿性蛋白酶水解草魚皮制備得到較高活性的抗氧化肽。李玉芬等[7]以海蜇加工下腳料為原料制備膠原蛋白肽，發現風味蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解時的水解度和還原力高于單一酶水解。另一方面，超聲波因其空化效應、機械效應等特點在活性物質提取、酶解反應和高分子物質降解等方面具有積極作用，尤其超聲作用能縮短酶解反應時間、提高酶解效率、增加產物得率，已廣泛用于動植物源蛋白質和多肽的提取[8]。Zou Ye等[9]采用超聲波輔助堿性蛋白酶水解豬腦制備得到了分子質量小、活性較強的抗氧化肽。Jia Junqiang等[10]用超聲波輔助酶解法從脫脂小麥胚芽蛋白中制備得到血管緊張素轉換酶抑制肽，發現超聲波處理能促進酶解過程中疏水氨基酸的釋放和血管緊張素轉換酶抑制肽的生成。帥希祥等[11]利用澳洲堅果蛋白采用超聲波輔助酶解法制備得到具有較強活性的抗氧化肽，酶解時間明顯縮短。王軍等[12]也采用超聲波輔助酶解法從鯰魚中制備得到了具有較強抗脂質過氧化和清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力的抗氧化肽。

胎盤又稱為“紫河車”，《本草綱目》記載：胎盤味甘咸，性溫，無毒，具有補血、補氣、益精、美顏之功效。現代醫學發現胎盤富含免疫活性肽、激素、微量元素及多種功能因子，具有調節體內激素水平、提高免疫、護肝、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用[13]。其中，胎盤因子（胎盤肽）由核苷酸、肽類和各種氨基酸等小分子組合而成，已被證實是一種無毒、無抗原的免疫調節物質，在臨床保健、醫藥和生物制品領域已有應用，尤其對病毒、免疫缺陷及惡性腫瘤等疾病具有良好效果[14-16]。但由于人胎盤資源短缺或倫理約束等因素，利用羊、鹿、牛等動物胎盤水解制備具有特殊功能的生物活性肽逐漸成為關注熱點。特別是羊胎盤的營養組成與人胎盤基本一致，合理的自然結構和豐富的營養成分使其成為動物胎盤的首選。藏系綿羊是我國青藏高原寶貴的遺傳資源之一，分布在青海、甘南等高海拔寒旱地區，平均海拔4 km以上的世界屋脊孕育了獨特的藏系綿羊品質，具有耐高寒、耐缺氧、適應性強等特性[17]。藏醫學也認為藏系綿羊胎盤具有極高的營養和藥用價值，對人體保健與疾病治療具有積極功效，但其具體成分及其作用機理尚不明確，有待進一步研究。

本研究以藏系羊胎盤肽的制備和抗氧化能力分析為目標，以水解度和肽得率為考察指標，首先從木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶等6 種蛋白酶中篩選適宜的復合酶水解組合方案，并通過單因素和響應面優化試驗考察超聲波輔助酶法制備羊胎盤肽的工藝參數，探索不同酶解條件下羊胎盤肽的抗氧化活性差異，進而對優化條件下獲得的羊胎盤肽的分子質量分布和氨基酸組成進行分析，以期為藏系羊胎盤的開發及在功能性食品中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏系羊胎盤為蘭州名德農牧科技有限公司提供。

木瓜蛋白酶（比活力80×104U/g）、菠蘿蛋白酶（比活力50×104U/g）、堿性蛋白酶（比活力2×104U/g）南寧龐博生物科技有限公司；胰蛋白酶（比活力25×104U/g）、動物蛋白水解專用復合酶（比活力1.5×103U/g）、中性蛋白酶（比活力6×104U/g） 北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化能力測試盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA25高剪切分散乳化機 上海弗盧克流體機械制造有限公司；L-550臺式低速離心機 湖南湘儀試驗儀器開發有限公司；SH220N石墨消解儀 山東海能科學儀器有限公司；K9840半自動凱氏定氮儀 山東海能科學儀器有限公司；SpectraMax i3x酶標儀 美谷分子儀器公司；Ag1100高效液相色譜儀 美國發捷倫公司；1525高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 羊胎盤原料的凈化與均質

新鮮羊胎盤解凍后，用清水沖洗去除殘留血跡、塵沙等污物，然后瀝干羊胎盤表面水分，剪碎后進行高剪切分散乳化，達到勻漿狀態后備用。經測定，羊胎盤蛋白質質量分數為87.59%（以干基計）。

1.3.2 羊胎盤的酶解方案篩選

以水解度和肽得率為指標，結合色澤、渾濁度和腥味等感官品質，從木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等6 種蛋白酶中篩選適宜的水解酶，酶解條件統一設置為酶添加量4 000 U/g、酶解時間1 h。然后利用篩選出的單一蛋白酶進行雙酶同步復合酶解實驗，酶解結束后立即沸水浴10 min滅酶，快速冷卻至室溫后3 900 r/min離心20 min，取上清液于100 mL容量瓶中定容，用于測定總氮和氨態氮含量，通過計算肽得率、水解度和理論分子質量，綜合考量確定適宜的蛋白酶組合方案。

1.3.3 超聲波預處理參數和酶解時間的單因素試驗

在1.3.2節復合酶解方案確定的基礎上，首先對藏系羊胎盤進行超聲波預處理，處理結束后進入酶解反應，研究各參數對水解效果的影響。以水解度和抗氧化能力為指標，分別考察酶解時間（1、2、3、4、5、6 h）、超聲時間（5、10、15、20、25、30 min）、超聲溫度（25、30、35、40、45、50 ℃）、超聲功率（240、300、360、420、480、540 W）4 個因素對羊胎盤雙酶復合酶解效果的影響。

1.3.4 超聲波預處理參數和酶解時間的響應面優化試驗

研究表明，水解度與肽得率、肽的分子質量分布和抗氧化能力密切相關，其中水解度是決定活性肽制備效率和活性高低的關鍵指標[18]。因此，在單因素試驗結果基礎上，以水解度為響應值，在固定酶添加量等水解條件的前提下，優化超聲時間、超聲溫度、超聲功率、酶解時間4 個因素對羊胎盤肽制備效果的影響。根據中心組合設計原理，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行4因素5水平的響應面優化試驗，試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Variables and levels used for central composite design

1.3.5 酶解指標測定

水解度參考Cui Chun等[19]方法，按式（1）計算，其中氨態氮測定采用甲醛滴定法，總氮測定采用微量凱氏定氮法；肽得率按照式（2）計算；平均理論分子質量（mw）按式（3）計算[20-21]。

式中：N1為水解液中氨態氮含量/g；N為原料中總氮含量/g；N2為水解液中總氮含量/g；W為原料中總蛋白質含量/g。

1.3.6 抗氧化能力分析

參照試劑盒說明書中的2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）法，在405 nm波長處可測定ABTS陽離子自由基吸光度。6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）是一種VE類似物，具有和VE相近的抗氧化能力，以吸光度（y）和Trolox濃度（x）制作標準曲線，得到回歸方程y=-0.862 3x+1.114 8，R2=0.993 9，從而確定羊胎盤肽的抗氧化能力，以Trolox當量表示。

1.3.7 分子質量分布的分析

利用高效液相色譜儀測定。色譜條件為：色譜柱TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動相：乙腈-水-三氟乙酸40∶60∶0.1（V/V）；檢測波長：紫外220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。其中繪制分子質量標準曲線所選的標準品為：細胞色素C（mw=12 400 Da）；桿菌酶（mw=1 450 Da）；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（mw=451 Da）；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（mw=189 Da）。

1.3.8 氨基酸組成分析

采用高效液相色譜法，根據郭剛軍等[22]方法略作修改。

羊胎盤原料上柱前處理方法：準確稱取100.00 mg左右原料置入水解管，然后加入8 mL 6 mol/L的HCl溶液，再用氮氣除氧3 min，調整流速使溶液呈沸騰狀態后擰緊水解管蓋，放入120 ℃烘箱中水解22 h，之后將水解管樣品全部轉移至容量瓶，加4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和，蒸餾水定容至25 mL后用雙層濾紙過濾，取1 mL澄清液于1.5 mL離心管內15 000 r/min離心30 min，最后取400 μL上清液于取液相樣品瓶，待測。

羊胎盤肽液上柱前處理方法：準確量取1 mL肽液樣品，依次加入1 mL濃HCl和6 mL 6 mol/L HCl溶液，其余處理與羊胎盤原料處理方法相同。

色譜條件：O D S H Y P E R S I L色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A相：8.0 g/L結晶乙酸鈉加入225 μL三乙胺和5 mL四氫呋喃，用5%醋酸溶液調pH 7.2；B相：8.0 g/L結晶乙酸鈉，用2%醋酸溶液調節pH 7.20，加入乙腈和甲醇各800 mL；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器：338 nm，262 nm。

1.4 數據處理

所有實驗均進行3 次平行，單因素試驗結果采用SPSS軟件進行顯著性差異分析，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面中心組合試驗。

2 結果與分析

2.1 藏系羊胎盤原料的氨基酸組成分析

表2 藏系羊胎盤的氨基酸組成及其含量Table 2 Amino acid composition of TSPP

如表2所示，藏系羊胎盤中的蛋白質高達80%以上，氨基酸總量為69.52%，主要包括Asp、Glu、Gly、Leu、Lys、Arg和Val等；其中Phe、Lys、Leu、Ile、Met、Val、Thr、His 8 種人體必需氨基酸質量分數為26.36%，必需氨基酸占總氨基酸的比值為37.92%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值達到61.08%。與其他來源羊胎盤相比，藏系羊胎盤中的Glu、Val、Met、Ile、Lys含量較高，其中Val、Met、Ile、Lys均為人體必需氨基酸。此外，藏系羊胎盤中還含有Glu、Gly、Leu、Arg等具有藥用價值的氨基酸[23]，并且Tyr、Met、Cys、His和Phe等氨基酸還與抗氧化能力密切相關[24]。可見，藏系羊胎盤蘊藏著良好的營養價值和抗氧化潛力。

2.2 復合酶解方案的確定

2.2.1 單酶篩選

有研究認為N端氨基酸為強疏水性和弱帶電性氨基酸（如Ala、Gly、Val和Leu）、中心氨基酸為具有強氫鍵作用的氨基酸（如Arg、Lys、His）時，小分子肽（Leu-His-X、Pro-His-X等）能表現出較強的抗氧化活性[4]。不同來源蛋白酶的酶切位點不同，會導致酶解產物存在很大差異，故有必要對藏系羊胎盤原料篩選適宜的蛋白酶。

表3 不同種類蛋白酶的推薦條件和酶解效果比較Table 3 Comparison of hydrolysis efficiencies of different proteases under recommended conditions

如表3所示，6 種蛋白酶的單一酶解效果差異較大。就水解度而言，中性蛋白酶水解度最高（38.16%），堿性蛋白酶和動物蛋白水解復合酶次之，胰蛋白酶最低（21.68%）。因為胰蛋白酶是一種Ser內切蛋白酶，僅能水解R1為Arg或Lys殘基側鏈的肽鍵，當提供肽鍵的氨基酸為Pro時水解受阻，而藏系羊胎盤中含量相對較高的Pro可能會對酶解反應形成阻礙作用[27]。從肽得率角度看，中性蛋白酶的肽得率最高（10.55%），其次為菠蘿蛋白酶和動物蛋白水解復合酶，胰蛋白酶的肽得率仍為最低（7.35%），且理論分子質量最高。另一方面，由于堿性蛋白酶具有一定特異性，能作用于Ala、Phe、Leu和Ile參與形成的多種肽鍵[21]，故水解度和肽得率相對較高，但水解液的腥味較重，因此胰蛋白酶和堿性蛋白酶予以排除。

另外，龐博公司生產的動物蛋白水解復合酶是一種復合內切酶，其酶切位點為Ala-、Leu-、Val-和Tyr-，而藏系羊胎盤中的這些氨基酸含量較高，故水解較為充分，水解度和肽得率相對較高，所得肽的理論分子質量僅330 Da左右。木瓜蛋白酶具有廣泛特異性，酶切位點主要為Arg-、Lys-、Phe-和X-，能獲得較高的水解度和肽得率[28]。菠蘿蛋白酶屬無特異性蛋白酶，所制得的水解液呈淺黃色、腥味較輕，且酶解條件為中性，操作簡便。綜合考慮，從6 種蛋白酶中選擇木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和動物水解復合酶進行后續的雙酶復合酶解實驗，進一步篩選適宜的復合酶解方案。

2.2.2 雙酶復合水解的組合方案篩選

由于蛋白酶對肽鍵作用具有一定專一性，單一蛋白酶水解時只能從某幾個固定的氨基酸殘基進行水解，水解程度有限；復合酶解法能強化水解度，得到更低分子質量的水解產物[29]。如圖1所示，不同蛋白酶復合酶解的水解度和肽得率有顯著性差異（P＜0.05）。其中菠蘿蛋白酶和中性蛋白酶均為無特異性蛋白酶，故菠+中組合的水解度（19.61%）顯著低于其他5 種方案（P＜0.05），木+中組合的水解度最高達到37.24%。另一方面，木+中組合的肽得率最高，動+中組合次之，較單一蛋白酶的水解效果均得到大幅提升，但由于動+中組合得到的水解液呈深棕色且有一定腥味，故予以排除。

圖1 不同雙酶組合方案時的水解度和肽得率Fig. 1 DH and peptide yields with different enzyme combinations

圖2 不同雙酶組合方案時的抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activities of hydrolysates prepared with different enzyme combinations

結合圖2抗氧化能力分析，木+中組合的抗氧化能力（0.91 mmol/L）顯著高于其他4 種組合（P＜0.05），且水解液澄清、呈亮黃色狀態，此時水解度與肽得率分別為37.24%和13.54%。該結果與劉建偉等[30]研究報道一致。木瓜蛋白酶能有效水解羊胎盤中的Arg、Lys、Phe等肽鍵，生成小分子多肽；中性蛋白酶的酶切位點廣泛，二者酶解過程中形成良好的協同作用，使得具有抗氧化能力的氨基酸殘基以及肽鏈暴露在外，大大增強了其抗氧化能力。綜合水解度、肽得率和抗氧化能力3 個指標評判，木+中組合的酶解效果較好，故選擇該組合進行后續的超聲波輔助酶解試驗。

2.3 超聲波輔助雙酶法制備羊胎盤肽的工藝優化

2.3.1 單因素試驗結果

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，水解度和抗氧化能力均呈現先升高后降低的變化趨勢，酶解第5小時的水解度高達51.14%，酶解4 h的抗氧化能力最高達到0.51 mmol/L。在酶解初始階段（1～4 h），底物濃度相對較高，酶作用使底物蛋白迅速降解為肽片段，水解度逐漸升高，平均肽鏈長度隨之下降，抗氧化能力亦逐漸增強。但隨著反應的進行（4～5 h），當蛋白質水解為多肽的速度小于多肽水解為氨基酸的速度時，游離氨基酸增多，水解度達到峰值；但同時會導致與抗氧化能力相關的多肽結構序列發生變化，使肽產物的抗氧化能力快速下降。隨著底物被逐漸消耗（5～6 h），底物蛋白與酶的接觸機率大幅下降以及可供酶切的位點減少導致水解反應放緩[31]，水解度快速下降，這與許英一等[32]研究結果一致。因此，為獲得抗氧化能力較強的酶解產物，必須嚴格控制酶解程度。

圖3 酶解時間對水解度和抗氧化能力的影響Fig. 3 Effect of enzymolysis times on degree of hydrolysis and antioxidant activity hydrolysis

圖4 超聲功率對水解度和抗氧化能力的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic power on DH and antioxidant activity and antioxidant capacity

由圖4可知，水解度和抗氧化能力隨著超聲功率的上升亦呈現先升高后下降趨勢，當功率為420 W和360 W時二者達到最高值，分別為48.07%和0.98 mmol/L。當超聲波與酶解反應偶合時，超聲作用能使底物蛋白空間結構發生改變，增加底物與蛋白酶的結合位點，有效提高酶解效果，使肽鍵斷裂，水解度增強；同時使具有抗氧化能力的肽片段增加，在超聲功率為360 W時表現出最高的抗氧化能力。當超聲功率繼續增至420 W時，超聲能量的釋放加速了介質中的質量傳遞作用，有效促進反應體系的傳質進程，使水解度達到最高值。但隨著超聲功率的繼續增加（＞420 W），超聲空化效應會破壞蛋白分子構象，導致酶活性下降，水解度和抗氧化能力均迅速降低[12]，這與藍尉冰等[33]研究結果一致。可見，適宜的超聲功率有利于發揮酶解作用，使羊胎盤肽表現出良好的抗氧化能力。

隨著超聲處理時間的延長，整個酶解反應體系更趨于均勻，底物蛋白的空間構象發生積極變化，埋藏在蛋白質內部的酶切位點暴露，促進底物與酶結合[34]，從而使水解度和抗氧化能力均逐漸增大，反應趨于完全。由圖5可知，當超聲處理第15分鐘時抗氧化能力出現峰值0.63 mmol/L，處理第20分鐘時水解度達到最高值52.15%。但過長時間的超聲處理會產生熱效應和剪切力，不僅會使部分底物蛋白的活性部位遭受破壞，也會使酶解反應體系的溫度隨之升高，超過酶的最適反應溫度從而抑制酶活力，導致酶解反應速率下降。另一方面，過量的超聲能量釋放會使肽片段降解為游離氨基酸，從而失去抗氧化能力。因此，初步確定超聲波處理時間為15～20 min。

圖5 超聲時間對水解度和抗氧化能力的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic times on the degree of hydrolysis and antioxidant capacity

圖6 超聲溫度對水解度和抗氧化能力的影響Fig. 6 Effect of ultrasonic temperatures on the degree of hydrolysis and antioxidant capacity

由圖6可知，當超聲溫度為35 ℃和30 ℃時，水解度和抗氧化能力達到最高值。超聲波是一種具有加熱和空化效應的能量輻照，對酶解反應可產生促進和抑制的雙重效果。在適宜溫度范圍內（＜30 ℃），加熱效應占主導，超聲場下的酶解反應體系吸回能量后加速了底物蛋白和酶作用位點的釋放，促進水解反應進程，使活性肽片段暴露，抗氧化能力升高。當超聲溫度繼續升高，則會使游離氨基酸增多，抗氧化能力開始下降，而水解度則繼續升高達到最大值43.5%。但溫度高于35 ℃后，超聲空化效應產生的自由基會對酶活中心形成破壞作用，導致酶活性降低，使得酶解反應速率下降，水解度降低[35]。

另外，超聲功率、溫度和時間等因素對水解度、抗氧化能力的影響呈高度相關性，且抗氧化能力隨反應體系的因素變化敏感性較高，均先于水解度發生變化，原因可能是抗氧化能力的高低與平均肽鏈長度、產物的末端氨基酸殘基、分子質量等肽的微分子結構關系密切，這一點在趙婕媛等[36]研究結果中得到證實。

2.3.2 響應面優化試驗結果

2.3.2.1 響應面試驗設計與結果

采用Design-Expert8.0.6軟件，在單因素試驗結果基礎上，以水解度為指標，進行4因素5水平的響應面優化試驗，共計30 組，設計方案及結果如表4所示。

表4 響應面試驗設計與結果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2.2 模型方程的建立及顯著性分析

Design-Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合得到回歸方程：水解度＝55.39+0.16A-0.20B+0.061C+1.90D+2.42AB-2.68AC-2.33AD+2.71BC+0.53BD+2.42CD-4.77A2-3.27B2-2.28C2-4.71D2。式中各項系數的絕對值表示單因素對水解度參數的影響程度，正負反映影響方方。

由表5可知，水解度的回歸模型極顯著（P＜0.001）；失擬項中F值為1.54，P＝0.332 2＞0.05，不顯著，表明模型擬合度良好，能較好解釋響應中的變異。模型的回歸系數R2為0.952 2，說明此方程對試驗擬合度結果比較好，誤差小；R2Adj為0.907 6，說明該模型能解釋90.76%響應值的變化，能很好預測超聲波輔助酶解制備羊胎盤肽的工藝參數。另一方面，該模型中回歸系數的顯著性檢驗顯示，一次項D，交互項AB、AD和CD對水解度的影響高度顯著（P＜0.01）；二次項A2、B2、C2和D2，交互項AC和BC對水解度的影響極顯著（P＜0.001）。比較4 個因素的F值大小可知，影響因素的主次順序依次為：超聲時間＞超聲溫度＞酶解時間＞超聲功率。

表5 水解度回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model for DH

2.3.2.3 響應面優化分析

圖7 各因素交互作用對水解度影響的響應面圖Fig. 7 Response surface plots showing the effect of interaction among various factors on DH

如圖7所示，隨著各因素水平的升高，水解度均呈現先增加后減少的趨勢。圖7a、b、c顯示，沿D因素軸方方的響應面坡度明顯比較陡峭，說明超聲時間對水解度變化的影響較超聲溫度、超聲功率和酶解時間大。另一方面，等高線是響應面在水平方方的投影，橢圓等高線表示兩因素交互作用顯著，圓形等高線表示兩因素交互作用不顯著[37]。圖7中6 組交互作用的等高線圖顯示，超聲溫度與超聲功率、酶解時間與超聲功率之間的交互作用最強，等高線均為橢圓形；其次是超聲功率與超聲時間、超聲時間與酶解時間、超聲溫度與酶解時間；超聲時間與超聲溫度二者的交互作用最弱，等高線為圓形，再次驗證了單因素與交互項對水解度影響的主次順序，且與表4中顯著性檢驗結果一致。

2.3.3 最佳酶解工藝參數的確定

Design-Expert 8.0軟件對試驗的優化結果為超聲溫度25.36 ℃、超聲時間16.56 min、超聲功率437.65 W、酶解時間4.88 h，該最優條件下的水解度預測值為55.67%。采用優化后的參數進行驗證實驗，為方便操作，條件設為超聲溫度25.5 ℃、超聲時間16.5 min、超聲功率438 W、酶解時間4.9 h，經5 次平行實驗后測得酶解液的水解度為（55.22±0.12）%，與模型預測值55.67%無明顯差異；肽得率為15.52%；抗氧化能力為1.08 mmol/L，說明擬合模型優化出的酶解參數較為準確。

2.4 藏系羊胎盤肽的氨基酸組成和分子質量分布

圖8 羊胎盤肽液分子質量分布色譜圖Fig. 8 Chromatogram of peptides in TSPP hydrolysate

肽片段長短與抗氧化能力高低密切相關，肽片段過長（超過20 個氨基酸）則結構相對復雜，具有抗氧化能力的氨基酸殘基可能被包埋其中，導致無法發揮功能活性；適宜長度的肽片段能表現出良好功能活性[38]。含有2～9 個氨基酸（分子質量500～2 500 Da）的寡肽比大分子蛋白質和多肽具有更強的抗氧化能力，二肽或三肽（200～500 Da）與單個氨基酸相比也表現出較強的抗氧化能力[4]。結合圖8和表6可知，羊胎盤經超聲波輔助酶解后得到的絕大多數肽為小分子低聚寡肽物質，其中分子質量低于2 000 Da的肽占95.02%，分子質量低于1 000 Da的肽占89.04%，分子質量低于500 Da的肽占74.99%。由于小分子低聚寡肽易被人體吸回，能直接參與組織蛋白質合成代謝，具有吸回快、功能活性良好等特點，故推測藏系羊胎盤肽表現出的抗氧化能力與其較低的肽分子質量分布有關系，不同分子質量段位肽片段對應的抗氧化能力需進一步深入研究。

另一方面，肽的抗氧化能力在很大程度上取決于氨基酸組成及其序列順序結構。由表7可知，藏系羊胎盤肽中的酸性氨基酸Glu含量最高，因其側鏈有氨基或羧基而具有螯合金屬離子和作為質子供體的能力，對肽的抗氧化能力表現有一定貢獻[39]。Zhuang Yufeng等[40]用堿性蛋白酶和中性蛋白酶復合水解羅非魚魚皮，得到N端為Glu的三肽（Glu-Gly-Leu）具有強抗氧化能力。除Glu外，藏系羊胎盤肽中的Gly和Asp含量也相對較高，Asp也是酸性氨基酸，Gly的R基為氫原子，能通過與自由基結合進而增強肽的抗氧化能力。此外，藏系羊胎盤肽中還包含一定量Leu、Ala、Pro和Val等氨基酸，這些氨基酸在文獻報道的抗氧化肽序列中多有出現。Huang Yipeng等[41]酶解馬鮫魚得到了Ser-Lys-Lys-Gly-Leu、Gln-Ala-Pro-Leu-Asn-Pro-Lys-Ala等8 種抗氧化肽。Kou Xiaohong等[42]酶解鷹嘴豆蛋白得到序列為Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro的抗氧化肽。Lee等[43]從鴨皮副產物中得到具有抗氧化能力的八肽His-Thr-Val-Gln-Cys-Met-Phe-Gln。由此推斷，藏系羊胎盤肽表現出的較強抗氧化能力與其氨基酸組成密不可分。下一步，課題組將繼續從肽片段分離純化和化學結構等角度分析其氨基酸序列，進而精準確定羊胎盤肽的抗氧化構效關系。

表7 藏系羊胎盤肽的氨基酸組成Table 7 Amino acid composition of peptides from TSPP hydrolysate

3 結 論

通過比較分析單一蛋白酶和復合蛋白酶的酶解方案，篩選得到木瓜蛋白酶和中性蛋白酶同步復合酶解的作用效果最好。在此基礎上，通過單因素試驗和響應面試驗優化得到超聲波輔助復合酶解制備藏系羊胎盤肽的最佳條件為酶解時間4.9 h，超聲溫度25.5 ℃、超聲時間16.5 min、超聲功率438 W，該條件下水解度達55.22%，肽得率為18.52%，抗氧化能力為1.08 mmol/L。制備得到的羊胎盤肽中分子質量低于2 000 Da的肽占比為95.02%，絕大多數為小分子低聚寡肽，而且藏系羊胎盤肽中富含有Glu、Gly、Asp等氨基酸，使其具有良好抗氧化能力。本研究為藏系綿羊胎盤制備抗氧化肽的工業化生產提供了技術參考，也為肽的分離純化和氨基酸序列結構分析奠定了理論基礎。