玉屏風散干預變應性鼻炎的網(wǎng)絡藥理學機制

向鳳， 彭桂原， 黃小安， 李林蔓， 錢湃梓， 黃桂爛， 林潔玲

（廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510006）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是耳鼻咽喉頭頸外科臨床最常見的疾病之一，保守估計全球的變應性鼻炎患者超過5億[1]。相關文獻[2]表明，變應性鼻炎在我國大陸地區(qū)人口中的患病率為4%～38%，不同地區(qū)間差異較大。國內(nèi)外大量的流行病學調(diào)查顯示，近年來變應性鼻炎的患病率明顯上升，導致較大的疾病負擔[3]。目前，變應性鼻炎以抗組胺藥、激素治療為主，雖然具有緩解癥狀的功效，但是并未從根本上使其恢復，并且長期反復使用也存在一定的副作用。中藥復方具有多靶點、多功效的特點，在預防和治療變應性鼻炎中具有很大的潛力。

玉屏風散，最早出自于元代朱震亨的《丹溪心法》，由黃芪、白術和防風3味中藥組成，具有益氣固表止汗之功效[4]。據(jù)報道，該方常用于治療現(xiàn)代醫(yī)學的變應性鼻炎、哮喘、蕁麻疹等變態(tài)反應性疾病[5]?，F(xiàn)代研究[6]表明，該方通過抑制肥大細胞活化，從而改善變應性鼻炎的過敏性癥狀。玉屏風散中黃芪既可以在免疫低下時提高機體免疫力，又可以在炎癥持續(xù)時，降低促炎因子的產(chǎn)生發(fā)揮免疫抑制作用，具有雙向調(diào)節(jié)作用[7]。防風具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)的作用[8]。白術具有修復黏膜、抗炎的作用[9]。

網(wǎng)絡藥理學以多基因、多靶點、多通路的特點與復雜疾病的治療理念相吻合，通過成分—靶點—通路—疾病等可視化網(wǎng)絡模型的構建，可全面研究中藥復方在治療疾病時參與調(diào)控的多種信號通路，結合分子功能、生物學過程分析，對分子層面的作用機制進行解釋[10]。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法總結玉屏風散治療變應性鼻炎的藥效成分及靶點，并通過系統(tǒng)生物學分析，深入揭示玉屏風散成分—靶點—通路—疾病之間的協(xié)同作用，初步探索玉屏風散治療變應性鼻炎的作用機制，為后續(xù)研究提供新的思路，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥效成分收集篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）中以黃芪、白術、防風為關鍵詞查詢篩選化學成分。該數(shù)據(jù)庫中包含了約500種《中華人民共和國藥典》中收載的藥物，能夠提供成分的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）數(shù)據(jù)及靶標、疾病信息[11]?？诜锢枚龋∣B）和類藥性（DL）是評價一個化合物是否可發(fā)展成為一個藥物的重要指標[12-13]。參考相關文獻，本文將OB和DL分別設置為＞30%和＞0.18，將篩選得到的化合物作為候選成分。

1.2 藥效成分靶點預測 通過Pubchem檢索出每一個候選成分的簡化分子線性輸入規(guī)范（Simles）號，并將Simles號帶入swiss target prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）網(wǎng)站自動篩選出可能性（Probability，P）值靠前的基因作為候選靶基因，并以Excel形式整理備用。

1.3 疾病靶點預測 在預測人類基因的數(shù)據(jù)庫（GeneCards， http：//www.genecards.org/）搜 索“allergic rhinitis”，得到與變應性鼻炎相關的基因，作為疾病的候選靶點基因。

1.4 網(wǎng)絡構建與分析 將查找篩選的玉屏風散藥效成分及預測的相關靶點以Excel導入Cytoscape 3.3.0軟件，得到玉屏風散成分—靶點網(wǎng)絡圖。將預測整理的疾病靶點導入在線蛋白質(zhì)互作（String）數(shù)據(jù)庫，將物種（Organizm）設置為人類（Homo sapiens），分析獲得疾病靶點蛋白互相作用（PPI）圖，將疾病靶點相互作用關系導入Cytoscape 3.3.0軟件得到疾病—靶點網(wǎng)絡圖。采用該軟件混合（Merge）功能將2個互作圖合并得到成分—靶點—疾病網(wǎng)絡圖。通過在線String數(shù)據(jù)庫對篩選得到的玉屏風散干預變應性鼻炎潛在靶點基因進行基因本體論（GO）功能富集分析，采用Cytoscape 3.3.0軟件中的Clue GO插件對輸入的潛在靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集注釋分析，將富集得到靶點—通路網(wǎng)絡與成分—靶點—疾病網(wǎng)絡合并，得到成分—靶點—通路—疾病相互作用網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 篩選預測結果 根據(jù)OB＞30%和DL＞0.18原則，共篩選得到35種候選藥效成分，其中防風16個、白術4個、黃芪15個，詳細信息如表1所示。其中實驗已明確證實歐前胡素（ammidin）能夠顯著改善哮喘小鼠氣道炎癥細胞浸潤、減輕黏液分泌及杯狀細胞增生，抑制氣道膠原沉積，同時通過調(diào)節(jié)白細胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13、干擾素γ（IFN-γ）等細胞因子調(diào)節(jié)哮喘小鼠的T細胞（Th）1/Th2失衡，其機制可能與p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）/核因子κB（NF-κB）有關，表明歐前胡素是一種潛在的抗炎藥[14]。肖煒明等[15]總結漢黃芩素（wogonin）可通過增加免疫細胞的浸潤、調(diào)節(jié)免疫細胞的表型以及促進相關細胞因子的分泌來增強免疫功能。在Otuki等[16]建立的炎癥模型中，NF-κB途徑顯示α-香樹素（α-amyrin）的局部治療可保護人NF-κB抑制蛋白α（IκBα）降解，p65/Rel A磷酸化作用和NF-κB活化，降低前列腺素E2（PGE2）。周運江等[17]發(fā)現(xiàn)山柰酚（kaempferol）能夠降低卵清蛋白誘導的過敏性鼻炎豚鼠模型血清中組胺、免疫球蛋白IgE、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和IL-4的水平，抑制鼻黏膜組織中TNF-α、IL-4的表達水平，減少鼻黏膜組織中嗜酸性粒細胞的浸潤，從而改善過敏性鼻炎的癥狀。彭煒等[18]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素（quercetin）可顯著抑制變應性鼻炎大鼠鼻黏膜嗜酸性細胞浸潤，顯著改善鼻黏膜水腫、血管擴張、腺體增生，并且槲皮素能顯著提高IL-2、IFN-γ，抑制IL-4、IL-5水平，調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子平衡，從而對變應性鼻炎大鼠產(chǎn)生保護作用。

通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫自動篩選P值靠前的基因作為候選靶基因，得到對應的靶點基因名稱。共得到玉屏風散化學成分—候選靶點關系480對，用Excel 2019表格整理。GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索變應性鼻炎，共得到981個與變應性鼻炎相關的基因，作為疾病候選靶點基因。2.2 網(wǎng)絡構建結果

2.2.1 成分—靶點網(wǎng)絡構建 將得到的玉屏風散成分—靶點關系以Excel格式導入Cytoscope 3.3.0軟件中，得到玉屏風散成分—靶點網(wǎng)絡，如圖1所示。該網(wǎng)絡共包含212個節(jié)點，480條邊，其中35個節(jié)點代表藥效成分，177個節(jié)點代表與藥效成分相關的靶點基因。網(wǎng)絡平均鄰節(jié)點數(shù)為4.52。

2.2.2 疾病靶點相互作用網(wǎng)絡構建 將變應性鼻炎相關的靶點基因?qū)朐诰€String數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點PPI圖，將疾病靶點相互作用關系導入Cytoscape 3.3.0建立疾病靶點相互作用網(wǎng)絡圖，如圖2所示。該網(wǎng)絡共有736個節(jié)點和23 010條邊，網(wǎng)絡平均鄰節(jié)點數(shù)為62.527。

2.2.3 成分—靶點—通路—疾病相網(wǎng)絡構建 利用Cytoscape 3.3.0中的Merge功能將成分—靶點網(wǎng)絡和疾病靶點相互作用網(wǎng)絡合并，得到成分—靶點—疾病網(wǎng)絡圖（見圖3），合并成分—靶點—疾病網(wǎng)絡圖和靶點—KEGG通路網(wǎng)絡圖得到成分—靶點—KEGG通路—疾病網(wǎng)絡圖（見圖4）。通過對網(wǎng)絡的拓撲結構分析得到藥效成分節(jié)點數(shù)如表1所示。網(wǎng)絡中共有81個節(jié)點和305條邊，其中35個節(jié)點代表藥效成分，27個節(jié)點代表與變應性鼻炎相關的疾病靶點，19個節(jié)點代表與疾病靶點相關的通路。網(wǎng)絡平均鄰節(jié)點數(shù)為7.531。表2為玉屏風散干預變應性鼻炎的預測靶點。

表1 候選藥效成分篩選結果表Table 1 The information of the candidate medical constitutes screened out

圖1 成分—靶點網(wǎng)絡圖Figure 1 The constitute-target network

圖2 疾病靶點相互作用網(wǎng)絡Figure 2 The disease targets interaction network

2.3 網(wǎng)絡分析結果 通過String數(shù)據(jù)庫對玉屏風散成分靶點與變應性鼻炎基因靶點映射的共有基因進行GO分析，排名前10的分子功能類別和生物學過程類別見表3、4。發(fā)現(xiàn)玉屏風散可通過信號受體活動、氧化還原酶、一氧化氮合酶活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等分子功能及有機物的應答、調(diào)節(jié)刺激的應答、多細胞生物的過程等生物學過程調(diào)控變應性鼻炎。

圖3 成分—靶點—疾病網(wǎng)絡圖Figure 3 The constitute-target-disease network

圖4 成分—靶點—KEGG通路—疾病網(wǎng)絡圖Figure 4 The constitute-target-KEGG pathwaydisease network

將27個共有基因?qū)隒lue GO插件進行通路富集注釋分析，得到24條P＜0.05的顯著富集信號通路，見圖5。通過閱讀文獻從排名前19的KEGG代謝通路中選出可能與變應性鼻炎相關的通路，并將其與玉屏風散的活性成分、共有靶點構建“成分—靶點—KEGG通路—疾病”的多維網(wǎng)絡圖。結果表明，玉屏風散能通過鈣離子（Ca2+）、缺氧誘導因子1（HIF-1）、IL-17、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子受體（ErbB）等信號通路調(diào)節(jié)變應性鼻炎的進程。表明玉屏風散抗變應性鼻炎與Ca2+流通、細胞低氧應答、炎癥因子、血管內(nèi)皮生長因子分泌等相關。

表2 玉屏風散干預二型糖尿病過敏性鼻炎的靶點預測結果Table 2 The information of the predicted targets of Yupingfeng Powder for the intervention of allergic rhinitis

表3 共有基因的GO分子功能分類Table 3 GO molecule function classification of the common genes

表4 共有基因的GO生物學過程分類Table 4 GO molecule biological process of the common genes

圖5 玉屏風散治療過敏性鼻炎的潛在靶點KEGG通路富集分析Figure 5 The KEGG pathway analysis of the predicted targets of Yupingfeng Powder for the intervention of allergic rhinitis

3 討論

玉屏風散的臨床應用極為廣泛，主治中醫(yī)學的各種汗證、虛證，以及治療現(xiàn)代醫(yī)學的皮膚系統(tǒng)、腎臟系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病等多科疾病[19]。特別指出的是玉屏風散在呼吸系統(tǒng)疾病中取得明顯的治療效果，尤其在變應性鼻炎上。大量文獻表明，無論玉屏風散加味還是玉屏風散加味結合西醫(yī)療法都既能迅速緩解變應性鼻炎的臨床癥狀，又能鞏固療效，其近期和遠期療效均優(yōu)于單純西醫(yī)治療[20]。中醫(yī)學認為，本病病機為本虛標實，內(nèi)虛為本，外感為標，同時本病的發(fā)生、發(fā)展及病情轉(zhuǎn)歸與肺的功能狀態(tài)關系密切。肺氣虧虛，衛(wèi)表不固，則外感邪氣乘虛而入，發(fā)為此病。臨床上，玉屏風散以補氣固表藥為主，配合小量祛風解表之品，使補中寓散?，F(xiàn)代研究表明，玉屏風散對細胞因子及機體免疫具有調(diào)節(jié)功能[19]，在某一程度上改善變應性鼻炎的癥狀及發(fā)展。中藥方劑成分復雜、靶點廣泛、作用途徑多樣、功能豐富，玉屏風散治療變應性鼻炎的具體作用機制尚未完全闡明。

在本研究中，我們應用OB、DL等指標、藥物的多種成分、網(wǎng)絡分析等預測玉屏風散與變應性鼻炎相關的活性成分和靶標，分析其治療作用可能存在的通路。其中相關性高的靶標有基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、一氧化氮合成酶1（NOS1）、白三烯B4（LTB4）、表皮生長因子受體1（ErbB1）等。有文獻[21]報道，MMP-2、MMP-9在過敏性鼻黏膜中表達增加，MMP-9和肥大細胞之間具有強相關性，提示MMPs可能有助于炎癥細胞（如肥大細胞）向變應性鼻炎患者鼻黏膜的遷移，表明MMPs在變應性鼻炎形成中的積極作用。有研究[22]表明，NOS1內(nèi)含子20的AAT多態(tài)性可能導致變應性鼻炎的易感性。LTB4是一種對中性粒細胞和嗜酸性粒細胞都有活性的天然發(fā)生的非常強效的趨化因子[23]。有文獻[24]證明，在鼻子局部的過敏反應中也產(chǎn)生了有效的化學反應因子LTB4。ErbB1、2屬于ErbB受體家族，也稱為I型受體酪氨酸激酶，研究[25]表明ErbBs在上、下氣道炎癥病理過程中可能發(fā)揮作用。一個特殊的膜域緊密連接最頂端的極化上皮細胞和內(nèi)皮細胞以維持細胞極性（屏障功能）[26]。細胞生物學研究[27]表明，ErbB的調(diào)控和激活與膜域完整性有關，而膜域完整性與上皮發(fā)育、損傷和腫瘤發(fā)生密切相關[28]。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1信號通路、IL-17信號通路、VEGF信號通路、Ca2+信號通路、ErbB信號通路為變應性鼻炎發(fā)病機制中重要的通路。有文獻報道，缺氧在變應性鼻炎的發(fā)病機制中起重要作用，其可以使鼻黏膜中的IL-17A水平升高，而IL-17A主要由分化的輔助性Th17產(chǎn)生，Th17細胞在多種炎癥以及自身免疫性疾病中起著重要的作用，其分泌的IL-17能在缺氧環(huán)境中通過介導細胞內(nèi)的NF-κB以及P13K/AKT途徑，激活下游的HIF-1α以及VEGF等信號分子?；罨腍IF-1α能夠通過調(diào)控其他生長因子的表達，直接參與血管生成并加重變應性氣道炎性反應[29]；HIF-1α高表達能夠促進VEGF的表達，VEGF也是炎性反應、氣道重塑和生理失調(diào)的強有力刺激劑[30]。Ca2+作為第二信使，在脂多糖（LPS）的活化過程中，具有重要的信號傳導作用。Ca2+能夠傳遞外界刺激的信號，啟動基因轉(zhuǎn)錄，促使細胞分泌大量的炎性細胞因子[31]。玉屏風散對變應性鼻炎的干預作用可能是通過以上關鍵基因及重要通路發(fā)揮作用。

網(wǎng)絡藥理學整合了大量的生物信息學方法，在探討中藥的藥理學和尋找新藥或藥物組合方案等方面具有非常廣闊的前景[32]。通過對玉屏風散進行網(wǎng)絡藥理學分析，我們得到玉屏風散的35個化學成分，這些成分可通過與MMP-2、MMP-9、NOS1、LTB4、ErbB1等關鍵靶點，調(diào)控Ca+、HIF-1、IL-17、VEGF、ErbB等信號通路，從調(diào)節(jié)Ca2+流通、細胞低氧應答、控制炎癥因子釋放等多環(huán)節(jié)發(fā)揮治療作用。本項研究基于多成分、多靶點、多通路理論探討玉屏風散治療變應性鼻炎的干預機制，對藥效成分、作用靶點和藥理機制深入闡明，對提升中藥的認可度和接受度大有裨益。但是，由于數(shù)據(jù)庫信息不全面，化合物篩選的主觀性，且只關注藥物的組成成分，忽略了其成分的含量、化合物之間的相互作用以及藥物體內(nèi)代謝過程等的影響，故本研究預測的結果具有一定的片面性和局限性。本研究尚處于理論上預測探討玉屏風散治療變應性鼻炎作用機制的階段，下一步將以臨床研究和實驗研究進行相關驗證工作，以明確網(wǎng)絡藥理學研究結果的可靠性。