響應面法優化楓楊葉多糖醇提取工藝及其抗氧化活性研究

謝朋飛， 劉靜， 蔡延渠， 王俊杰， 張遠芳

（1.郴州市第一人民醫院藥學部，湖南郴州 423000；2.廣東藥科大學新藥研發中心，廣東廣州 510006；3.湘南學院，湖南郴州 423000）

楓楊葉為胡桃科植物楓楊（Pterocarya stenoptera DC.）的葉，又名麻柳葉，分布于陜西、河南及長江流域以南地區。味苦，性溫，有小毒。具有止咳化痰、消炎解毒、殺蟲止癢的功效。主治慢性氣管炎、關節痛、瘡疽癤腫、疥癬風癢、皮炎濕疹、湯火傷等病癥[1-2]。現代研究[3-5]發現，其具有抗腫瘤、抗病毒、殺滅釘螺等作用，主要成分有維生素、鞣質、水楊酸、內酯及酚類等化合物，但關于多糖類物質則鮮少報道。因此，本研究采用加熱回流提取法，通過Box-Behnken響應面法優化楓楊葉多糖的乙醇提取工藝，同時評價其體外抗氧化活性，以期為楓楊葉多糖的進一步開發利用提供實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 藥品與試劑 楓楊葉樣品采自湖南郴州，經湘南學院王俊杰教授鑒定為胡桃科楓楊屬植物楓楊（Pterocarya stenoptera DC.）的葉。D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201707）；三羥甲基氨基甲烷（Thris）、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）、2，2'-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（上海麥克林生化科技有限公司）；鄰苯三酚、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸、過硫酸鉀、抗壞血酸（Vc）、鹽酸、無水乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、水楊酸、三氯乙酸、氯化鐵均為分析純；水為實驗室自制純水。

1.2 儀器 UV-1700雙光束紫外分光光度計（日本島津公司）；EPED-10TF純水器（南京益普易達科技發展有限公司）；FreeZone2.5冷凍干燥機（美國Labconco公司）；CP-225D電子天平（0.01 mg，德國賽多利斯公司）；ME-204電子天平（0.000 1 g，瑞士梅特勒—托利多公司）；JJ1000Y電子天平（美國雙杰集團有限公司）；RE-52旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；BHS-4數顯恒溫水浴鍋（江陰市保利科研器械有限公司）；pHS-3C pH計（上海精密科學儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 多糖含量測定[6]

2.1.1 楓楊葉多糖制備 將楓楊葉干燥，粉碎成粗粉，稱取30 g粉末，加入20倍量60%乙醇（體積分數，下同）加熱提取2次，1 h/次，藥液75℃減壓濃縮至適量，定容為1 g（生藥）/mL。

2.1.2 標準曲線繪制 精確稱取D-無水葡萄糖對照品9.96 mg，加水配制成0.099 6 mg/mL的標準品溶液，分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于試管中，加水至1.0 mL；再加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸，90℃水浴20 min后取出冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度（D）值。同時以水為參比溶液進行空白對照。D為縱坐標、D-無水葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線（見圖1），線性回歸得方程Y＝0.069 0X＋0.039 0，r＝0.999 5，表明在1.422 9～11.382 9μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線Figure 1 The standard curve of glucose

2.1.3 多糖含量測定 按“2.1.1”項下操作制備楓楊葉多糖樣品溶液，按“2.1.2”項下操作進行顯色反應后測定吸光度D值，代入回歸方程計算多糖含量，根據以下公式計算多糖得率。楓楊葉多糖得率（%）=多糖質量/楓楊葉質量×100%。

2.2 單因素實驗 采用加熱回流方法，分別考察乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間對楓楊葉多糖得率的影響。

2.2.1 乙醇濃度 考察40%、50%、60%、70%、80%等不同濃度乙醇溶液對楓楊葉多糖得率的影響。結果顯示：隨著乙醇濃度的升高，多糖得率逐漸提高；當乙醇濃度為60%時，多糖得率最高；隨后繼續提高乙醇濃度，多糖得率則隨著下降。推測可能是當溶液極性下降，水溶性多糖的溶出率降低。具體變化趨勢見圖2。

2.2.2 提取溫度 考察60、70、80、90、100℃等不同提取溫度對楓楊葉多糖得率的影響。結果顯示，楓楊葉多糖得率隨著溫度的升高而提高，當溫度為100℃時達到最高值。具體變化趨勢見圖3。

圖2 不同乙醇濃度對楓楊葉多糖得率的影響Figure 2 The effect of the different concentrations of ethanol on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

圖3 不同提取溫度對楓楊葉多糖得率的影響Figure 3 The effect of the different extraction temperatures on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

2.2.3 料液比 考察1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50[（m/g）∶（V/mL），下同]等不同料液比對楓楊葉多糖得率的影響。結果顯示，楓楊葉多糖得率隨著溶劑用量的增加而提高，當料液比為1∶40時接近最高值，隨后增加溶劑量，得率略微提高。具體變化趨勢見圖4。

圖4 不同料液比對楓楊葉多糖得率的影響Figure 4 The effect of the different solid-liquid ratios on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

2.2.4 提取時間 考察0.5、1、2、3、4 h等提取時間對楓楊葉多糖得率的影響。結果顯示，在1～3 h內，隨著提取時間的延長，多糖得率較為明顯地提高；4 h后，變化趨勢變緩，得率略微提高。其原因可能是溶液中多糖含量接近飽和，因此即使增加提取時間，多糖的溶解也較少。具體變化趨勢見圖5。

圖5 不同提取時間對楓楊葉多糖得率的影響Figure 5 The effect of the different extraction time on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

2.3 Box-Behnken響應面法[7-8]以多糖得率為響應值指標，選擇乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為影響因素進行三因素三水平的響應面試驗設計。因素水平見表1，結果見表2。

采用Design Expert 8.0軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到楓楊葉多糖得率（Y）對三因素的回歸方程：Y=12.28-0.20A+0.27B+0.61C+0.01AB+0.010AC-0.14BC-1.18A2-0.59B2-0.53C2。

2.3.1 模型建立與方差分析 由表3結果可知，模型F值為78.35，P＜0.000 1，表明該模型具有顯著性。同時模型失擬項值為0.638 6（P＞0.05），表明模型擬合度良好。相關系數R2為0.990 2及失擬項系數R2Adj為0.775，均表明模型預測值與實測值的相關性良好。由F值可知，因素A、B、C對楓楊葉多糖得率有顯著影響（P＜0.001），順序依次為C＞B＞A，三者間的交互項影響不顯著（P＞0.05），表明楓楊葉多糖與各個因子之間不單單是線性關系。二次項A2、B2、C2亦影響顯著（均P＜0.001）。

表1 響應面因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface methodology

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 The design and results of response surface methodology test

2.3.2 響應面圖分析 由模型繪制各因素的等高線與響應面，可以分析在最佳條件下不同變量的取值和各變量之間產生交互作用的顯著程度。由結果可知，乙醇濃度與提取時間的響應面較為陡峭、等高線較為趨于橢圓形，表明因素間交互作用較為顯著，而其他因素間的交互作用則不顯著。具體見圖6。

2.3.3 驗證試驗 通過軟件Design Expert 8.0分析所得楓楊葉多糖提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度59.39%、料液比1∶40.67，提取時間3.60 h、提取2次，預測多糖得率為12.47%。結合實際，調整最優條件為乙醇濃度60%、料液比1∶40，提取時間3.5 h、提取2次。按此工藝進行3組驗證試驗，測得多糖得率為（12.12±0.08）%，與預測值接近，表明模型具有良好的預測性，且響應面法優化所得工藝條件準確、可靠。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 The variance analysis results of regression model

2.4 楓楊葉多糖抗氧化能力測定[9-10]稱取楓楊葉粗粉100 g，按照最佳工藝條件進行提取，藥液80℃減壓濃縮至適量，冷凍干燥至恒質量（7.52 g），研磨成粉，過100目篩，即得楓楊葉多糖。稱取適量楓楊葉多糖和Vc（陽性對照），分別用純水配成系列質量濃度溶液，進行不同抗氧化活性檢測。

2.4.1 清除DPPH·自由基能力測定 分別吸取1 mL的不同質量濃度樣品溶液和0.5 mL的DPPH儲備液（質量濃度為0.35 mg/mL）于試管中，室溫下避光反應30 min，于517 nm處測定吸光度D1值；吸取0.5 mL DPPH儲備液、1 mL純水，同法操作，測定吸光度D0值；吸取0.5 mL無水乙醇、1 mL樣品溶液，同法操作，測定吸光度D2值。根據下式計算清除率：清除率=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

通過繪制標準曲線，得到線性回歸方程：楓楊葉多糖，Y=0.062 3X+0.304 3（R2=0.985 4）；Vc，Y=0.029 6X+0.345 5（R2=0.990 5）。計算IC50：楓楊葉多糖，3.141 3 mg/mL；Vc，5.219 6 mg/mL。結果見圖7。

2.4.2 清除ABTS+·自由基能力測定先將7 mmol/L的ABTS溶液和7.35 mmol/L的過硫酸鉀溶液按體積比2∶1混合，室溫下避光反應16 h，即為ABTS儲備液；用前以純水稀釋，使其在波長734 nm處的吸光度值D0為0.70±0.20。分別吸取1 mL不同質量濃度樣品溶液和2 mL ABTS稀釋液于試管中，超聲30 s，室溫下暗處反應8 min，于波長734 nm處測定吸光度值D1。根據下式計算清除率：清除率=[（D0-D1）/D0]×100%。

圖6 不同因素對楓楊葉多糖得率影響的響應面值（1）（3）（5）與等高線圖（2）（4）（6）Figure 6 The response surface diagrams（1）（3）（5）and contour line plots（2）（4）（6）for the effects of the different factors on the yield rate of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves

圖7 不同質量濃度樣品對DPPH·自由基清除能力的變化（1）（2）Figure 7 The changes of DPPH· radical-scavenging activities of the samples at different concentrations（1）（2）

通過繪制標準曲線，得到線性回歸方程：楓楊葉多糖，Y=0.287 0X+0.310 7（R2=0.993 3）；Vc，Y=17.384 1X+0.320 9（R2=0.994 0）。計算IC50得：楓楊葉多糖，0.659 6 mg/mL；Vc，0.010 30 mg/mL。結果見圖8。

圖8 不同質量濃度樣品對ABTS+·自由基清除能力的變化（1）（2）Figure 8 The changes of ABTS+· radical-scavenging activities of the samples at different concentrations（1）（2）

2.4.3 清除·OH自由基能力測定 分別吸取2 mL不同質量濃度樣品溶液、2 mL的6 mmol/L FeSO4溶液及2 mL的6 mmol/L H2O2溶液于試管中，靜置10 min后再加入2 mL的6 mmol/L水楊酸溶液，靜置30 min，于波長510 nm處測定吸光度D1值；以純水代替水楊酸，同法測定吸光度D2值；另以純水為空白對照，測定吸光度D0值。根據下式計算清除率：清除率 =[1-（D1-D2）/D0]× 100%。

通過繪制標準曲線，得到線性回歸方程：楓楊葉多糖，Y=0.020 4X+0.271 4（R2=0.980 6）；Vc，Y=1.002 7X+0.204 8（R2=0.985 3），計算IC50得：楓楊葉多糖，11.205 9 mg/mL；Vc，0.294 4 mg/mL。結果見圖9。

圖9 不同質量濃度樣品對·OH自由基清除能力的變化（1）（2）Figure 9 The changes of·OH radical-scavenging activities of the samples at different concentrations（1）（2）

通過繪制標準曲線，得到線性回歸方程：楓楊葉多糖，Y=0.934 9X+0.098 7（R2=0.980 5）；Vc，Y=31.931 0X+0.190 4（R2=0.983 0）。計算IC50得：楓楊葉多糖，0.429 2 mg/mL；Vc，0.009 314 mg/mL。結果見圖10。

圖10 不同質量濃度樣品對O-2自由基清除能力的變化（1）（2）Figure 10 The changes of O-2 radical-scavenging activities of the samples at different concentrations（1）（2）

2.4.5 還原力測定 分別吸取1 mL不同質量濃度樣品溶液于試管中，依次加入1%鐵氰化鉀溶液與磷酸緩沖液（pH=6.6）各2.5 mL，混勻，50℃水浴20 min，取出冰水冷卻至室溫。再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，3 000 r/min離心10 min；取上清液2.5 mL，加入0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液和2.5 mL的蒸餾水，混勻20 min后于波長700 nm處測其吸光度。同時以水為空白溶劑、Vc為陽性對照。由圖11可知，楓楊葉多糖與Vc的還原力均隨質量濃度的增大而較為緩慢提高。二者相比，Vc的還原力更強。

圖11 不同樣品的還原能力Figure 11 The reducing power of the different samples

3 討論

本研究通過響應面法篩選出楓楊葉多糖的最優提取工藝為：乙醇60%、料液比1∶40、100℃加熱回流提取3.5 h、提取2次。驗證結果顯示多糖得率為12.12%。表明所建立的模型具有良好的預測性。同時分析因素間的交互效應發現，乙醇濃度、料液比、提取時間的相互影響較為明顯。

抗氧化活性結果表明，楓楊葉多糖對DPPH·、ABTS+·、·OH和等自由基的清除能力較強，還原力與抗氧化能力表現出正相關性，且均呈現出良好的量效關系，其中對DPPH·的IC50（3.141 3 mg/mL）明顯低于Vc的IC50（5.219 6 mg/mL）。提示楓楊葉多糖具有較好的抗氧化作用，可用于醫藥保健食品、美容護膚品等產品的開發應用。由于所得楓楊葉多糖仍為粗品，純度較低，我們將在下一步工作中對其進行分離、純化，制備出純度更高的多糖物質，同時將會進一步進行動物體內的抗氧化試驗，以更好地確證其抗氧化功能。