妊娠期糖尿病患者血漿中miR-144和miR-451的表達(dá)及臨床價(jià)值

梁小娟 周 蕓 羅仕琴

廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科 518020

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期婦女常見疾病，嚴(yán)重威脅著母嬰的健康。其發(fā)病機(jī)制涉及許多因素。微小RNA(microRNA，miRNA)是具有18～22個(gè)核苷酸的小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究證實(shí)miRNA在組織中的表達(dá)異常與先兆子癇和妊娠期糖尿病密切相關(guān)。miR-144與miR-451已經(jīng)被證明參與了胰腺β細(xì)胞的增殖與凋亡，并與2型糖尿病胰島素抵抗相關(guān)，但miR-144與miR-451在妊娠期糖尿病血漿中的表達(dá)及作用尚不清楚。

1 資料與方法

1.1 資料收集 收集我院2016年9月—2017年9月就診的妊娠期糖尿病孕婦35名，并按年齡匹配的方法收集同期就診的正常孕婦35名。妊娠期糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：于妊娠24周進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)，禁食8h，檢查空腹?fàn)顟B(tài)下的血糖指標(biāo)，隨后再口服75g的葡萄糖。診斷要點(diǎn)：(1)空腹血糖≥5.0mmol/L；(2)餐后1h血糖≥10mmol/L；(3)餐后2h血糖≥8.5mmol/L；(4)使用75g OGTT實(shí)驗(yàn)測(cè)量血糖。1h≥8.6mmol/L，2h≥6.7mmol/L，3h≥5.8mmol/L。只要其中一點(diǎn)滿足要求就可診斷為妊娠期糖尿病。排除標(biāo)準(zhǔn)主要包括：(1)妊娠前存在糖尿病或有糖尿病家族史；(2)年齡<18歲；(3)有異常妊娠家族史；(4)有胎兒染色體或重大畸形家族史；(5)嚴(yán)重的全身性疾病。所有參與者均簽署了知情同意書，實(shí)驗(yàn)方法得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，該研究得到了深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科健康與人類研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得了參與者的書面知情同意書。

1.2 樣本采集 采集24周正常孕婦及確診為妊娠期糖尿病孕婦外周血2ml，并在28周、32周再次留取確診的妊娠期糖尿病孕婦外周血2ml；同時(shí)計(jì)算24周時(shí)確診妊娠期糖尿病孕婦的體重指數(shù)(BMI)、胰島素抵抗指數(shù)以及血清糖化血紅蛋白含量。穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵指數(shù)(HOMA-IR)計(jì)算如下：(空腹血糖×空腹胰島素)/22.5；體重指數(shù) BMI = 體重(kg)/身高2(m)。

1.3 miRNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR 將血液樣品收集到含有EDTA的采血管中，4℃ 3 000g離心5min分離血漿。使用RNeasy plus mini試劑盒(Qiagen)從200μl血漿中分離總RNA。NanoVue plus(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)測(cè)量總RNA濃度和純度。按照GeneCopoeia公司“All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit”操作說明，取1～3μg RNA建立20μg逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。GeneCopoeia公司的“miRNA qPCR Kit”試劑盒和ABI7500 Fast Real-time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光擴(kuò)增。U6作為內(nèi)參，采用ΔCt(Ct目的-Ct內(nèi)參)法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以2-ΔΔCt作為目的RNA的相對(duì)表達(dá)量。miR-144、miR-451及U6上游引物購自廣州富能公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，計(jì)量資料均經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用LSD-t檢驗(yàn)分析兩組之間均數(shù)的統(tǒng)計(jì)；Spearman的相關(guān)分析用于評(píng)估m(xù)icroRNA和風(fēng)險(xiǎn)因素之間的相關(guān)性。P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 35名GDM孕婦及35名非GDM孕婦的臨床特點(diǎn)如表1所示，GDM孕婦在24周時(shí)HbA1c、HOMA-IR及BMI均高于正常孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組臨床特點(diǎn)比較

2.2 miR-144及miR-451在GDM孕婦血漿中表達(dá)增高 qPR-PCR方法檢測(cè)24周GDM孕婦與正常孕婦血漿中miR-144與miR-451的表達(dá)，如圖1與圖2所示，miR-144及miR-451在GDM孕婦中較正常孕婦明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 miR-144及miR 451在GDM孕婦血漿中的表達(dá)進(jìn)行性升高 qPR-PCR方法檢測(cè)24周、28周及32周GDM孕婦血漿中miR-144與miR-451的表達(dá)，如圖3與圖4所示，miR-144及miR-451表達(dá)隨妊娠時(shí)間的延長進(jìn)行性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 GDM孕婦miR-144表達(dá)Spearman相關(guān)性分析 分析妊娠24周時(shí)妊娠期糖尿病孕婦血漿中miR-144表達(dá)量與BMI、HbA1c及HOMA-IR的相關(guān)性。結(jié)果如表2及圖5、圖6所示，miR-144血漿中的表達(dá)量與HOMA-IR和HbA1c正相關(guān)，而與BMI無明顯相關(guān)性。

表2 miRNA與妊娠期糖尿病高危因素相關(guān)性分析(R/P)

圖5miR-144表達(dá)量與HOMA-IR的相關(guān)性分析

2.5 妊娠期糖尿病孕婦miR-451表達(dá)Spearman 相關(guān)性分析 分析妊娠期糖尿病孕婦在妊娠24周時(shí)miR-145表達(dá)量與BMI、HbA1c及HOMA-IR的相關(guān)性。結(jié)果如表2及圖7所示，妊娠期糖尿病孕婦血漿中miR-451在表達(dá)量與HOMA-IR正相關(guān)，而與BMI及HbA1c無明顯相關(guān)性。

3 討論

妊娠期糖尿病是指妊娠前糖代謝正常或者可能存在潛在的葡萄糖耐量降低，而在懷孕期間首次確診為糖尿病，是婦產(chǎn)科常見疾病之一，嚴(yán)重威脅母嬰健康[1]。對(duì)于孕婦而言，主要風(fēng)險(xiǎn)是剖宮產(chǎn)、先兆子癇以及增加2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]；對(duì)于胎兒而言，巨大兒、低血糖、難產(chǎn)、呼吸窘迫綜合征和胎兒死亡嚴(yán)重威脅胎兒及嬰兒健康[3]。目前妊娠期糖尿病主要治療方法是運(yùn)動(dòng)療法、飲食控制和胰島素替代治療，以減少糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，改善孕婦預(yù)后[4]。目前臨床上妊娠期糖尿病診斷依據(jù)依賴于美國糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)和糖尿病和妊娠研究組(IADPSG)標(biāo)準(zhǔn)診斷[5]。診斷通常在懷孕24～28周進(jìn)行，有時(shí)可延遲至32周。因此，迫切需要精確和迅速的預(yù)測(cè)和診斷妊娠期糖尿病的方法，提早對(duì)妊娠期糖尿病孕婦進(jìn)行干預(yù)，以改善孕婦的預(yù)后。

許多研究尋找可能預(yù)測(cè)妊娠期糖尿病的潛在的生物學(xué)標(biāo)記，包括早期妊娠中期基因表達(dá)變化，表觀遺傳學(xué)修飾及非編碼RNA的改變[6]。然而，這些生物標(biāo)志物存在一些局限性。微小RNA是具有18～22個(gè)核苷酸的小的非編碼RNA，通過與靶基因的3’UTR相結(jié)合，抑制靶基因的翻譯或者促進(jìn)靶基因mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)[7]。且相關(guān)研究證實(shí)，外周血中的微小RNA與組織中的微小RNA相似[8]。又由于miRNAs在外周血中很穩(wěn)定，易于收集，因此miRNAs已被作為診斷與預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志在多種疾病上得到應(yīng)用，包括腫瘤、心血管疾病及糖尿病[9-11]。然而，當(dāng)妊娠24～28周診斷出GDM時(shí)，血漿microRNAs是否可用作GDM的診斷生物標(biāo)志物尚不清楚。

Zhao等證實(shí)，miR-29a、miR-132、miR-222在早期診斷等妊娠期糖尿病患者外周血中表達(dá)下降[12]；Cao也發(fā)現(xiàn)，在24～28周妊娠期糖尿病患者的外周血中miRNA-16-5p、miR-17-5p及miR-20a-5p表達(dá)明顯升高，并可能與妊娠期糖尿病的高危因素相關(guān)[13]。本次研究發(fā)現(xiàn)，與正常孕婦相比，妊娠24周時(shí)GDM孕婦血漿miR-144以及miR-451表達(dá)明顯上調(diào)，且隨著妊娠時(shí)間進(jìn)展，兩種miRNA表達(dá)進(jìn)行升高。提示著miR-144與miR-451可能在妊娠期糖尿病疾病發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

一些研究表明，患有GDM的孕婦比健康孕婦具有更高的體重指數(shù)，糖化血紅蛋白含量和胰島素抵抗，并將這些指標(biāo)確定為妊娠期糖尿病的危險(xiǎn)因素[14-15]。因此，在本研究中，筆者進(jìn)一步分析血漿miR-144和miR-451是否與妊娠期糖尿病危險(xiǎn)因素相關(guān)。結(jié)果顯示miR-144與miR-451均與HOMA-IR呈正相關(guān)。miR-451及mi144是一種參與多種生物過程的miRNA，它通過靶向不同基因在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的作用，調(diào)控的腫瘤等增值及凋亡；此外，miR-451能夠通過抑制CD4+T細(xì)胞增殖在炎癥中發(fā)揮作用。重要的是， 有研究證實(shí)miR-451在懷孕大鼠的胰島中上調(diào)，體外過表達(dá)miR-451保護(hù)β細(xì)胞免受細(xì)胞因子和棕櫚酸誘導(dǎo)的大鼠胰島細(xì)胞凋亡。另外miR-144也證實(shí)參與胰腺β細(xì)胞抗凋亡作用[16-18]。因此推測(cè)miR-144與miR-451可能參與了妊娠期糖尿病抵抗。但其在妊娠期糖尿病中的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，與正常妊娠孕婦相比，妊娠期糖尿病孕不同時(shí)間血漿miR-144及miR-451表達(dá)明顯增加，并且與胰島素抵抗呈正相關(guān)，miR-144及miR-451可能作為診斷妊娠期糖尿病等生物學(xué)標(biāo)志。