濃香型白酒窖泥中一株產己酸功能菌的研究

張 超，李俊薇，劉占奇，孫 琳，董孝元，李 瑞

（1.黃鶴樓酒業有限公司，湖北武漢 430050；2.武漢雅仕博科技有限公司，湖北武漢 430050）

白酒中的有機酸可以調節白酒口味使酒體醇和爽口，不同的有機酸與醇在各種微生物酶的催化作用下生成不同的酯。其中己酸乙酯作為濃香型白酒的主體香是判定濃香型白酒質量等級的關鍵指標[1]。濃香型白酒采用全泥窖發酵模式，因而窖泥的質量也就成為影響濃香型白酒質量的關鍵因素之一，而窖泥中微生物的種類與數量又決定著窖泥的質量，環環相扣密不可分[2]。窖泥中的微生物以細菌為主，尤其以芽孢桿菌為多，生長繁殖需嚴格厭氧環境且生長速度緩慢[3]。現階段借助于一代測序技術，可以從16S rDNA序列分析入手對微生物進行種屬的鑒定，對微生物的研究更加深入。因此，開展對產己酸微生物的選育、培養及應用研究，對于提高濃香型白酒質量有著非常重要的現實意義。

本研究從黃鶴樓酒業濃香型白酒窖泥著手，篩選關鍵功能微生物，進行單菌株發酵鑒定，并對發酵液的己酸等有機酸定量分析，為濃香型白酒生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：窖泥，樣本取自黃鶴樓酒業濃香窖池。

富集培養基（巴氏合成培養基）：醋酸鈉0.5%，硫酸鎂0.02 %，硫酸銨0.05 %，酵母浸粉0.1 %，磷酸氫二鉀0.04%，pH5.8～7.0,121 ℃滅菌20 min，接種前加入無水乙醇2%。

分離培養基：在富集培養基中加入瓊脂2 %，碳酸鈣2%。

儀器設備：DZF-6050B真空培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；顯微鏡EclipseE100；DYY-6D型電泳儀，北京市六一儀器廠；TC-96/GPCR擴增儀；ChampGel5000凝膠成像儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 富集培養[4]

樣品預處理：稱取1 g優質窖泥，加入裝有100 mL無菌水的三角瓶中，以180 r/min振蕩30 min后在80 ℃恒溫水浴鍋中處理10 min以消除非芽孢菌體，在預熱過程中不斷晃動三角瓶避免局部受熱[5]。冷卻至30～40 ℃，無菌條件下吸取1 mL樣品液于20 mL富集培養基，加入2 %（體積分數）無水乙醇進行試管培養，用500 μL液體石蠟封住培養基液面以隔絕外部空氣[6]，用膠塞封口，置于真空干燥箱中，抽真空0.08 MPa左右，充入N2以此循環2次，在34 ℃下恒溫培養10 d，觀察試管內菌液產氣情況。

1.2.2 分離純化

將富集培養后的菌液再進行80 ℃水浴熱處理10 min。在無菌室中用無菌吸管吸取菌液1 mL，放入盛有9 mL無菌水的吸管中，依次稀釋到10-3，取10-1、10-2、10-33個稀釋度的稀釋液與50 ℃分離培養基混合倒板、搖勻，34 ℃培養3～5 d。

將不同形態的單菌落分別接種于20 mL巴氏液態培養基中培養15 d，觀察產氣情況以及對培養液定性分析確定有己酸。反復進行3次單菌純化工作，確認為純種后可進行保藏[7]。

1.2.3 定性鑒定及鏡檢

吸取2 mL混合均勻的己酸培養液，加入2%硫酸銅溶液2 mL，然后再加1 mL乙醚后充分振蕩混合均勻，靜置分層后觀察乙醚層顏色。如果乙醚層呈藍綠色，則證明菌液中含有己酸，且顏色越深己酸含量越高[8]。

1.2.4 分子生物學鑒定

DNA提取[9]：使用上海生工單菌株基因組試劑盒提取DNA。

PCR擴增[10-11]：采用引物27F/1492R對Z-1進行16S rDNA擴增。

引物序列：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')。

1492R：(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')。

PCR反應體系（20 μL）：dH2O 3.5 μL；Primer（2 μM）5 μL，2× Direct PCR Mix 10 μL；基因組DNA 1 μL；Taq酶0.5 μL。

PCR擴增條件：

取5 μL反應液進行1 %瓊脂糖凝膠（120 V，25 min）電泳，使用Marker DL2000。

1.2.5 己酸測定

1.2.5.1 定性分析

方法同1.2.3。

1.2.5.2 定量分析[12]

GC檢測條件：檢測器：氫離子火焰檢測器；色譜柱：DB-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

溫度程序：50 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至230 ℃保持2 min；檢測器溫度230 ℃；載氣He，流速1 mL/min。

液體樣品處理：吸取3 mL發酵液樣品在10000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，通過濾膜過濾后吸取1 mL濾液到含有100 μL 2-乙基丁酸（1.010 g/L）的10 mL容量瓶中，并用體積分數為1%的甲酸定容至刻度，混合均勻后吸取1 μL進行氣相色譜測定。

2 結果與分析

2.1 產己酸菌分離結果

通過多次分離純化，共分離得到2株產己酸菌，分別記為Z-1、Z-2，菌株特征見表1和圖1所示，均為革蘭氏陽性微生物；兩株微生物的定性顯色反應如圖2所示；從圖1可以看出，菌株Z-1產己酸量高于Z-2，在試驗中優選Z-1做理想菌株保存。

表1 菌落形態及顯微形態

圖1 鏡檢圖(10×100）

圖2 定性顯色圖

2.2 菌種分子生物學鑒定

提取菌株Z-1基因組DNA，然后以基因組DNA為模板對16S rDNA進行擴增，其瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示，為單一條帶、明亮條帶，1.4 kb左右。

圖3 菌種基因組DNA PCR產物電泳圖

將菌株Z-1的16S rDNA（1464bp）序列輸入美國國家生物技術信息中心(NCBI) 數據庫中做BLAST分析，與GenBank數據庫中同源性最高的已知分類菌株序列進行比較，菌株Z-1與Aneurinibacillus migulanus同源性最高為99%，因此可以鑒定菌株Z-1為Aneurinibacillus migulanus[13]，測序結果見表2。

2.3 己酸測定分析

2.3.1 定性測定

微生物產己酸定性顯色反應結果如圖4，經3次轉接后Z-1顯色效果良好。

2.3.2 定量測定（圖5）

從圖5可以得出，利用氣相色譜法可以一次性測出發酵液中的己酸、丁酸等有機酸含量。Z-1發酵液樣品中檢測出己酸含量為3.5 g/L，丁酸含量1.12 g/L。

表2 Z-1測序結果

圖4 定性顯色圖

圖5 Z-1發酵液色譜圖

3 討論

本試驗通過對黃鶴樓酒業濃香型白酒窖泥進行微生物分離純化，鑒定出1株高產己酸的硫胺素芽孢桿菌，并利用氣相色譜對單菌株發酵液進行己酸定量測定，其產己酸量達3.5 g/L。

但關于硫胺素芽孢桿菌[14-15]的生長規律方面還有待進一步研究，根據菌株的生長規律可有針對性的應用于實際生產中。在后期應用于窖池養護與窖泥制作過程中，要注意其生長階段的選取，這樣可以有效縮短發酵期。