一種釀酒酵母菌在白酒生產中的強化應用

何宏魁，李冬冬，劉國英，李曉歡，李 蘭，曹潤潔，李安軍

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州 236820；2.安徽省固態發酵工程技術研究中心，安徽亳州 236820）

釀酒微生物在白酒生產過程中起著極其重要的作用，從大曲的生產到窖池發酵，都有釀酒微生物的參與，其中酵母菌作為主要的釀酒微生物之一存在于大曲中[1]，在白酒釀酒過程中起著至關重要的作用。隨著現代生物工程技術的發展，功能性酵母菌逐漸被發現，如釀酒酵母(Saccharomyces)、假絲酵母(Candida)、接合酵母(Zygosaccaromyces)、伊薩酵母(Issatchonkia)、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和異常畢赤酵母（Pichia anomala）、檸檬形接合酵母(Zygosaccaromyces cidrci)、東方伊薩酵母(Issatchonkia orientalis)、畢赤酵母(Pich-ia burtonii)、漢遜酵母(Hanseniaspora)[2-6]等。這些酵母分別起著釀酒和生香的作用。

以從安徽古井貢酒桃花曲中分離出的1株釀酒酵母菌為研究對象，分析菌株生長代謝特征，探究在白酒發酵過程中添加強化此菌株對白酒生產帶來的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：從古井桃花曲中分離出的1株酵母菌。

試劑：酵母菌基因組DNA提取試劑盒（天根）、Taq酶（生工）。

儀器設備：SX-70高壓滅菌鍋，IMH400-S生化培養箱、MaxQ 485HP振蕩培養箱、PCR儀、WatersI-Class/Xevo TQD氣相色譜-質譜聯用儀（GCMS）、Agilent 6890A氣相色譜。

1.2 試驗用培養基

YPD培養基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母膏10 g，蒸餾水1000 mL，pH5.0～5.5，115 ℃滅菌20 min。

液態發酵培養基：糖度為12 Bx的高粱糖化液。

固態培養基：新鮮干燥的麩皮、玉米粉。孟加拉紅培養基（成品），121 ℃滅菌30 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 分子生物學鑒定

根據酵母菌分類學研究標準方法做分子鑒定。酵母核基因組的提取使用酵母基因組DNA提取試劑盒，按照說明書操作。

使用引物NL1和NL4進行26S rDNA D1/D2區的擴增。PCR反應體系（50 μL）：50 mg/L模板2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，dNTP 5 μL，buffer 5 μL，Taq酶0.5 μL，最后添加ddH2O定容50 μL。反應條件：94 ℃/3 min；94 ℃/1 min，55 ℃/1 min，72 ℃/1 min，30個循環；72 ℃/10 min。PCR產物北京擎科新業生物技術有限公司測序，測序結果在NCBI的Genbank數據庫中進行比對。

1.3.2 酵母發酵的制備

將菌株接種到孟加拉紅固體培養基上，28 ℃培養2～3 d活化；然后用接種環將活化后的菌株轉接到20 mL YPD培養基的三角瓶中，于28 ℃120 r/min培養24 h；取酵母菌種子液接種到裝有250 mL高粱發酵培養基的三角瓶中，裝液量10 mL，在120 r/min，28 ℃條件下搖床培養72 h。

1.3.3 發酵代謝產物分析

（1）氣相色譜分析條件

分流進樣，分流比60∶1，進樣口溫度：230 ℃；升溫程序：35 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min程序升溫至100 ℃，不保持，再以10 ℃/min升溫至195 ℃，保持18 min。

（2）氣相質譜聯用儀分析條件

進樣不分流，流速0.9 mL/min；進樣口溫度：230 ℃；升溫程序：35 ℃保持4 min；以2 ℃/min升溫到60 ℃不保持，以6 ℃/min升溫到180 ℃保持15 min。

1.3.4 酵母曲的制備及其理化分析

（1）酵母曲的制備

將試管中的酵母菌接種到裝有250 mL的YPD液體培養基中，28 ℃、120 r/min搖床培養48 h。然后將培養好的種子液轉接到3 L YPD液體培養基，28 ℃、120 r/min搖床培養48 h。最后轉接到固態培養基（麩皮與水1∶1，高壓滅菌處理），品溫控制在30 ℃，培養36 h。

（2）酵母曲理化分析

菌落數測定：根據國家標準GB 4789.2—2010。

發酵力測定：參考企業標準QJ/GJ 08.01—2017。

1.3.5 酵母曲強化發酵釀酒試驗

根據實際情況，制定釀酒試驗方案，實驗共20個窖池（實驗組10個，對照組10個）。

實驗一：實驗組大米查一加1 kg釀酒酵母曲強化發酵；對照班組按照正常工藝操作，不添加酵母曲。

實驗二：實驗組大米查一、大米查二各加1 kg釀酒酵母曲強化發酵；對照班組按照正常工藝操作，不添加酵母曲。

2 結果與分析

2.1 發酵代謝產物分析

將酵母菌發酵液代謝的揮發性產物采用頂空氣相色譜與質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）技術進行分析，其總離子流圖譜如圖1所示，代謝產物分析結果見表1。

圖1 酵母液態發酵產物HS-SPME-GC-MS分析總離子流圖

表1 酵母菌液態發酵產物HS-SPME-GC-MS分析結果

由表1可以看出，該釀酒菌株發酵產物中，主要代謝產物是乙醇，代謝比例占40.24%，是白酒的主體成分。其次代謝19.89 %的3-甲基丁醇和15.33%的苯乙醇。3-甲基丁醇和苯乙醇均是白酒中重要的風味成分。其中3-甲基丁醇具有果香，可以增加酒體的醇甜感，讓酒體更豐滿[7]；苯乙醇是米香型白酒的主體香味成分之一[8]。該酵母菌株還代謝出其他揮發性香味物質，如辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸等，這些香氣成分，在白酒香氣形成中扮演著重要角色。在濃香型白酒的主體香味成分中，辛酸乙酯的絕對含量并不高，但其香氣強度貢獻值比傳統觀點認為的四大酯中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯均要大，僅次于己酸乙酯，呈現較強的果香味。

2.2 分子生物學鑒定結果

測序得到的26S rDNA基因序列，保留其可靠的587 bp序列進行系統發育分析。序列如下：

通過NCBI的BLAST比對，該菌株的序列與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的序列相似性為100%。

2.3 酵母曲理化分析

該酵母菌株制備的酵母曲，每1 g絕干功能曲中，酵母菌數量為8.1×108～11.6×108cfu。同時對釀酒功能曲進行發酵力檢測，將其曲浸出液稀釋1000倍后，發酵力依然為213.6 g/100 g·72 h。

2.4 酵母曲強化發酵釀酒試驗

根據實驗方案，對實驗組和對照組窖池升溫情況進行測量對比，結果如圖2所示。

圖2 釀酒實驗組和對照組窖池溫度變化

由圖2可以看出，從窖池溫度變化曲線來看，符合濃香型白酒發酵溫度變化規律。實驗組較對照組相比，實驗組升溫較快，頂溫高出1～2 ℃，且中挺時間長2 d左右，到緩落時期，實驗組溫度下降相對較慢。

根據試驗方案，對實驗組和對照組對應窖池出酒率進行統計和分析，結果如圖3所示。

圖3 實驗組與對照組出酒率、名酒率對比

由圖3可以看出，實驗一組與對照一組相比較，出酒率提高了1.67%，名酒率提高了0.89%；實驗二組與對照二組相比較，出酒率提高了2.31 %，名酒率提高了0.62 %；實驗二組與實驗一組相比較，其出酒率較實驗一略高，名酒率無差異。

對酒樣進行氣相分析，統計結果如圖4所示。

圖4 實驗組與對照酒樣成分含量

由圖4可知，實驗組的酒樣中己酸乙酯、乙縮醛、己酸、總酸含量均高于對照組，而乙酸乙酯、乳酸乙酯含量低于對照組，尤其是乳酸乙酯降低明顯，兩個實驗組的乳酸乙酯分別降低了19.3 %、21.4 %；各組實驗之間相比較，實驗二總酯含量最高為832.5 mg/100 mL。

取本次實驗混合酒樣進行專業品評，結果如表2所示。

表2 釀酒實驗混合酒樣品評結果

由表2可知，添加優良釀酒酵母曲的實驗方案一和方案二的酒樣較對照組酒樣，酒質更優，且實驗方案二的酒樣優于實驗方案一酒樣。

3 討論

利用分子鑒定技術對古井桃花曲中1株酵母菌進行鑒定，該菌株為釀酒酵母(Saccharomyces)。對其發酵代謝產物進行分析結果表明，該酵母菌發酵產生多種揮發性風味物質，本次共檢測出49種揮發性風味物質，主要包括醇類、酯類、酚類、酸類等。其中醇類物質含有10種，相對含量高達76.51%，尤其是乙醇、3-甲基丁醇、苯乙醇，相對含量為75.46%。將釀酒酵母制備成曲后，發酵力明顯強于大曲，并且具有一定的酯化力。將此酵母曲與大曲共同混合組配，用于釀酒生產，發現添加釀酒曲后，窖池的升溫較快，并且頂溫要比對照組高出1～2 ℃，且整個發酵過程中試驗組的酒醅升溫都略高于對照組。試驗組的出酒率也高于對照組2 %左右。實驗組的酒樣中己酸乙酯、乙縮醛、己酸、總酸含量均高于對照組；乙縮醛是濃香型白酒老熟和質量的重要標志之一，也是有別于低檔酒的指標之一[9]；而乙酸乙酯、乳酸乙酯含量低于對照組，尤其是乳酸乙酯降低明顯；各組實驗之間相比較，實驗二總酯含量最高。可見，添加了本株功能釀酒酵母菌株可以起到“增己降乳”的作用，使酒體酯類比例更協調，進一步提高了基酒的品質。