聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)建立巴爾通體的檢測鑒定方法并用于診斷臨床疑似貓抓病合并雙側(cè)支氣管肺炎患者分析

賈鵬霞，程 江

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000）

巴爾通體實為一群氧化酶呈陰性，革蘭染色呈陰性，其不僅能誘發(fā)戰(zhàn)壕熱病，還能引起巴爾通體病（Carrion）、貓抓病（CSD）等[1-2]。本文構(gòu)建基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的巴爾通體感染檢測方法，對1例發(fā)熱肺炎患者的全血DNA進(jìn)行檢測，并從中將巴爾通體特異基因片段擴增出來，現(xiàn)對此分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者，男，48歲，在此次發(fā)病前，有典型的貓抓傷史；咳嗽、發(fā)熱、胸痛為其典型臨床表現(xiàn)；而經(jīng)查體得知，貓抓傷側(cè)的腋窩以及腹股溝淋巴結(jié)均存在腫大情況，且肝脾也存在腫大情況。

1.2 陽性對照菌株

本文所選用巴爾通體菌株TR222SM、RT221SM、RT225SM分離，都為鼠類動物血液，且均經(jīng)中國疾預(yù)防控制中心用PCR及測序技術(shù)明確為巴爾通體。

1.3 提取全血DNA

取600 μL血，加入到濃度為1%的SDS中，蛋白酶K（20 mg/mL）濃度0.2 mg/mL，RNase濃度為57 μg/mL，充分混勻，水浴（55℃），分別用氯仿、飽和酚進(jìn)行數(shù)次抽提，取上清液，離心處理（12000 r/min），將管中液體舍去，利用1 mL濃度為70%的乙醇對DNA進(jìn)行清洗，沉淀二次，再離心10分鐘，于-20℃保存。

1.4 引物

查找巴爾通體16S～23SrRNA基因間隔區(qū)（ITS）序列，借助DNAsis序列分析軟件，開展多序列比較，設(shè)計引物TIle.455p～TAla.885n擴增16S～23SrRNA ITSs當(dāng)中的tRNAIle與tRNAAla基因間隔區(qū)序列，擴增片段最小為300 bp，最大為500bp。

1.5 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測

在模板DNA中加入1μl的反應(yīng)體系，以及1.5 μL的Taq DNA聚合酶、1 μL的引物、2 μL的dNTP，另將適量離子水加入，使總量達(dá)25 μL，采用PCR基因擴增儀（Robocycler Gradient 40型）。取擴增產(chǎn)物5 μL，將電泳載樣液1 μL加入，另將瓊脂糖電泳（1%）加入，時間為40分鐘，紫外線燈照射，且進(jìn)行拍照。

2 結(jié) 果

2.1 PCR結(jié)果

將全血基因組D N A作為模板，三對引物都擴增出陽性產(chǎn)物，而對于陽性對照，都擴增出特異基因片段，另外，空白對照都沒有擴增帶。針對引物BhCS.781～bhCS.1137n，其擴增出gltA基因380 bp片段；而對于引物Bh.311p～Bh.452n而言，其擴增出16S～23SrRNA ITSN'末端163bp片段；在本次研究當(dāng)中，共擴增出片段451bp，與巴爾通體tRNAIle-tRNAAla基因間隔區(qū)預(yù)測帶的大小相符。

2.2 核苷酸測序結(jié)果

引物Tile.455p～TAla.885n PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果為，序列的長度為451bp，其中，針對1～75bp，其實為3'-端tRNAIle基因序列；而對于76～410bp，其則為tRNAIletRNAAla基因序列。通過開展序列分析得知，設(shè)計引物TIle.455p～TAla.885n擴增產(chǎn)物核昔酸序列一致于巴爾通體一分離株對應(yīng)位置，同源性達(dá)到100%。

3 討 論

巴爾通體屬布魯氏菌、根瘤菌目、α亞群及變形菌綱等高同源性。現(xiàn)階段，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)19種巴爾通體，其中，多達(dá)7種能夠引發(fā)人類疾病，如漢賽、五日熱、桿菌樣等[3]。伴隨當(dāng)今分子生物學(xué)及細(xì)菌分子遺傳學(xué)檢測方法的持續(xù)更新與完善，許多致病巴爾通體所造成的不良預(yù)后被發(fā)現(xiàn)且明確，人們對此種病原微生物所開展的研究日漸增多且深入。近年，伴隨序列測定技術(shù)及PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，以及其在病原體檢測中的不斷應(yīng)用，其為致病微生物鑒定，提供了一種實用且高效的手段。針對引物引物BhCS.781-bhCS.1137n而言，其能夠擴增各種巴爾通體片段，而且還能實現(xiàn)與巴爾通體之間有較高同源性的根癌土壤桿菌等無擴增產(chǎn)物的擴增，因而是一種水平特異性。從本文研究結(jié)果可知，在血液中采用PCR技術(shù)實施直接擴增特異基因片段，可以對巴爾通體感染進(jìn)行準(zhǔn)確且快速的檢測。