顆粒細胞凋亡調控機制及其在卵泡發育中的作用

付靖波， 張紅霞， 朱海英

海軍軍醫大學基礎部細胞生物學教研室，上海 200433

顆粒細胞(granulosa cells, GCs)是結構以及功能與卵細胞聯系最為密切的細胞，與卵細胞共同構成卵泡，并以卵泡為結構與功能單位，與卵細胞一同發育。顆粒細胞的形態以及數目是卵泡分期的重要依據。

卵泡發育是一個復雜而漫長的過程，整個過程受到多種細胞因子與激素的精細調控。這些因素影響卵細胞及顆粒細胞分化、增殖以及凋亡。從原始卵泡召集到最終排卵的整個過程中，約有99%的卵泡被淘汰而發生閉鎖[1]。卵泡的成熟或閉鎖取決于這些信號分子間不同時期的動態平衡，而顆粒細胞是這些信號分子影響卵泡發育的重要“中介”。

1 卵泡發育過程中顆粒細胞的凋亡及其意義

顆粒細胞以旁分泌的形式產生激素并作用于卵細胞，從而調控卵細胞的發育狀態；同時也以自分泌的方式調控自身的分化、增殖及凋亡。另一方面，顆粒細胞受各種細胞因子、激素及生長因子的調控，并通過與卵細胞的間隙連接將相應信號傳遞到卵細胞中調控其發育狀態。顆粒細胞在卵泡發育過程中，同時起產生信號、傳遞信號及接收信號的作用，即顆粒細胞的發育狀態決定了卵泡的命運。

作為細胞自主發生的一種死亡模式，凋亡在組織發育、疾病發生發展中扮演著重要的角色。在卵泡發育過程中，顆粒細胞凋亡通常被認為是卵泡閉鎖的“起因”[2]。有學者提出“卵泡波”(follicular wave)理論，認為卵泡并不是隨機生長，而是協調地按批次進行發育[3]。在排卵間隔期，共發生2～3次發育波，期間卵泡必須通過閉鎖有效地去除其他生長的卵泡，以適應隨后的卵泡生長波，此時卵泡分化成為優勢卵泡及從屬卵泡，只有優勢卵泡能進一步發育，為卵細胞的分裂及后續受精作準備。卵泡分化為從屬卵泡過程中，竇腔邊緣顆粒細胞逐漸凋亡，并引發后續一系列的顆粒細胞功能減退，最終導致卵泡閉鎖。

2 顆粒細胞凋亡調控

目前，對于顆粒細胞凋亡機制的研究，主要集中于凋亡相關的信號通路與凋亡相關的轉錄/轉錄后調控2個方面。

顆粒細胞的增殖和凋亡過程中，涉及以叉形頭轉錄因子O(forkhead box O, FOXO)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, BCL-2)及凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)為代表的生存因子，以及以Fas/FasL、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase) 及p53等為代表的凋亡誘導因子，兩類因子相互作用。相關細胞內信號通路受到卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、雌二醇、轉化生長因子α(transforming growth factor-α, TGF-α)以及干細胞因子(stem cell factor, SCF)等多種激素、細胞因子的調控[4]。激素及各種細胞因子主要通過結合顆粒細胞表面受體，開啟或關閉各種凋亡通路，實現對顆粒細胞凋亡的調控。

2.1 顆粒細胞的促凋亡調控 通常認為，在顆粒細胞凋亡過程中，起到最主要作用的是Fas/FasL通路。顆粒細胞表面Fas表達水平在促性腺激素水平下降時明顯升高，同時伴隨細胞周期阻滯及p53表達升高[5]。Fas被激活后激活其相關死亡結構域(fas-associating protein with a novel death domain, FADD)，誘導caspase-8、細胞色素C等介導的細胞凋亡[6]。此外，TNF-α也可促進顆粒細胞的凋亡。TNF-α相關細胞凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis induced ligand, TRAIL)可以誘導體外培養的顆粒細胞凋亡，且這一凋亡途徑可被caspase抑制劑阻斷，而TRAIL在人卵巢各時期卵泡的顆粒細胞中均有表達[7]，提示TRAIL可能參與TNF-α介導的顆粒細胞凋亡以及卵泡閉鎖。

2.2 顆粒細胞的抗凋亡調控 PI3K/AKT信號通路在顆粒細胞抗凋亡中發揮關鍵的作用，其主要受到以FSH和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factors -1, IGF-1) 為代表的多種激素及生長因子的調控。PI3K/AKT信號通路通過影響FOXO1蛋白質的磷酸化，調節細胞周期蛋白D2(cyclin D2, CCND2) 及抑制素α(inhibin-α, INHA)等基因的表達，促進顆粒細胞增殖、分化及生存[8]；而通過影響FOXO3磷酸化，阻止其對下游的Fas配體(FAS ligand, FASLG)及BCL-2樣蛋白11(BCL-2-like protein 11, BCL2L11)的轉錄激活作用[9]，進而避免顆粒細胞的凋亡。

FSH作為一種重要的內分泌激素，與顆粒細胞上相應受體結合，促進優勢卵泡的存活和生長。FSH主要通過刺激顆粒細胞的增殖、雌二醇分泌和上調細胞內抗凋亡蛋白[如X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)和FLICE樣抑制蛋白(FLICE-like inhibitory protein, FLIP)]的表達來抑制細胞凋亡。XIAP通過抑制caspase-3、caspase-7 及caspase-9而直接抑制顆粒細胞凋亡的發生[10]。FLIP主要通過抑制caspase-8的活性，直接從上游阻斷經Fas及TNF-α介導的凋亡途徑[11]。促性腺激素也可以上調顆粒細胞中XIAP及人凋亡抑制蛋白-2(human inhibitor of apoptosis protein-2, HIAP-2)的水平，從而發揮與FSH類似的抗顆粒細胞凋亡、阻止卵泡閉鎖的作用[12]。

雌二醇作為性腺軸中的關鍵激素，由顆粒細胞分泌且可以作用于顆粒細胞自身。雌二醇在促性腺激素受體表達及卵泡生長的同時，也可以抑制顆粒細胞的凋亡。通常認為，雌二醇與其受體結合形成胞內復合物，作用于DNA上的雌激素反應元件，通過募集參與轉錄調控的其他因子，抑制p53及BCL-2相關蛋白X(BCL2-associated X, BAX)表達，阻止顆粒細胞的凋亡[13]。同時，雌二醇可以刺激TGF-α表達，而TGF-α通過促進XIAP的表達來促進顆粒細胞增殖并抑制其凋亡[14]。

此外，SCF在原始卵泡發育中起到至關重要的作用。SCF與膜受體c-kit結合，通過PI3K/AKT等信號途徑，激活BCL-2家族成員，從而抑制顆粒細胞自噬及凋亡[15]。AKT的激活及FOXO的磷酸化有助于恢復環磷酰胺導致的顆粒細胞損傷，從而起到對環磷酰胺生殖毒性的緩解作用[16]。

總之，顆粒細胞凋亡的發生主要與促性腺激素以及FSH等激素水平的降低有關。這些激素缺乏會導致Fas激活及TNF-α等細胞因子介導的TRAIL表達增加，從而引起細胞內以caspase為主要途徑的細胞凋亡。而雌激素、FSH及抑制素等可以發揮抑制顆粒細胞凋亡及促進顆粒細胞增殖的作用。雌激素、FSH等一方面通過激活PI3K/AKT信號通路，影響下游FOXO蛋白的磷酸化，間接抑制凋亡，另一方面通過抑制p53及BAX等基因的表達而直接抑制顆粒細胞凋亡。

3 顆粒細胞凋亡的轉錄后調控

近幾十年來對于轉錄后調控的研究，尤其是miRNA研究的快速發展，為生殖系統疾病研究帶來了新的切入點。miRNAs 是一類內源性的短非編碼單鏈RNA，一般長度為18～24個核苷酸[17]。大多數mRNA轉錄物的成熟序列包含miRNA反應元件(miRNA response elements, MRE)，這提示miRNA在機體發育及生理病理過程中都起著關鍵作用[17]。目前證明，在哺乳動物卵泡形成和閉鎖過程中，內源以及外源miRNA通過廣泛參與轉錄后mRNA水平調控，在卵泡和黃體發育、卵巢功能[18]及卵巢疾病發生中[19]發揮關鍵作用。

其中，miR-1275最早被發現在癌癥中能調控胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白(insulin-like growth factor-2 mRNA-binding proteins, IGF2BP)的表達，最近研究證明miR-1275可通過靶向肝受體同源物1(liver receptor homologue-1, LRH1)影響雌二醇合成并導致GCs凋亡[20]。

Let-7(lethal-7)家族是最早發現的miRNAs之一，其功能包括促進細胞增殖、分化，組織發育和腫瘤抑制。最近發現，let-7家族成員在豬卵泡閉鎖過程中差異表達。let-7a、let-7b、let-7c和let-7i的表達水平在早期卵泡和進行性閉鎖卵泡中表達明顯低于正常發育的卵泡，而let7-g在卵泡閉鎖過程中高水平表達[21]。這表明let-7 miRNA家族組成了顆粒細胞凋亡的雙向調節網絡。與健康女性相比，早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)患者的let-7c下調[22]。

此外，miR-23a和miR-27a通過靶向SMAD5(drosophila mothers against decapentaplegic protein-5)促進人類顆粒細胞凋亡，而miR-92a、miR-181b和miR-182通過直接與SMAD7結合拮抗TGF-β而抑制細胞凋亡[17]。在POI患者中，miR-23a和miR-27a上調[22]。也有研究[23]表明，miR-23a和miR-27a直接靶向SMAD5后，通過Fas/FasL途徑促進顆粒細胞凋亡。

4 顆粒細胞凋亡與女性生殖功能下降的關系

目前普遍認為，大量顆粒細胞凋亡是卵細胞數目、受精能力下降的重要原因，凋亡顆粒細胞的比例也與體外受精的成功率負相關[24]。而大多數引起女性生殖功能異常的疾病，如脆性X染色體綜合征(fragile-X premutation，FXPM)、POI、子宮內膜異位癥及多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)等，均與顆粒細胞損傷有密切關系。在FXPM小鼠模型中，顆粒細胞因線粒體數目減少而功能異常，是造成雌性小鼠排卵數目減少及胚胎發育異常的重要原因[25]。

POI是指40歲之前卵巢功能停止，其發生受到自身免疫、遺傳及化療藥物等多種因素的影響[26]。而POI與顆粒細胞的功能下降有關，主要表現為患者血清中抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)的水平下降[27]。而暴露于已知會引起氧化應激(OS)的環境，或應用γ輻射、化療藥物或多環芳烴(如環磷酰胺、二甲基苯)等藥物，能激活顆粒細胞促凋亡信號，導致原始卵泡快速喪失，導致POI[28]。PCOS患者顆粒細胞的凋亡比例也明顯升高，且凋亡的顆粒細胞中8-羥基-2-脫氧鳥苷明顯升高，提示OS是誘導PCOS患者顆粒細胞凋亡的重要原因[29]。此外，OS可能是子宮內膜異位患者生殖能力下降的因素之一。

顆粒細胞凋亡是OS影響卵細胞功能及胚胎發育的關鍵因素，在多種生殖功能障礙中扮演重要角色。其中，谷胱甘肽的消耗是導致體內竇卵泡閉鎖和體外培養的竇卵泡中顆粒細胞凋亡的重要原因[28]。

5 小結與展望

隨著對激素作用、細胞內信號通路、轉錄及轉錄后調控的研究，目前人們對顆粒細胞在卵泡發育中的重要作用、顆粒細胞狀態對卵細胞功能及胚胎發育影響的認識正在不斷深入，逐漸由宏觀的病理組胚層面向更加精細的基因表達調控層面發展。對于相關激素在顆粒細胞凋亡中的作用，可以結合信號通路及miRNA等轉錄后調控進行分析，這有助于全新的生殖細胞發育調控圖譜的發現。然而，如何通過干預信號通路來治療疾病，仍需深入研究。例如，目前發現的POI相關的大量miRNA為該疾病的早期診斷提供了更多元的選擇，但這些標志物的靈敏度以及特異度仍需要大量臨床實驗驗證。

隨著卵泡波理論的提出，對卵泡發育過程的整體化和連續化的認識也日益深入。然而，目前對優勢卵泡選擇所涉及的信號通路及轉錄后調控機制的認識仍不足。同時，顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖的因果關系仍有爭議。此外，顆粒細胞及卵細胞之間的跨區投影(transzonal projections, TZPs)起結構連接、物質傳遞及信號交流的作用，是形成卵泡最基本和最重要的結構基礎及功能單位，而TZPs是否在顆粒細胞凋亡中發揮作用也無定論。雖然目前依靠相應動物模型，對顆粒細胞凋亡機制認識不斷加深，但仍需結合臨床，探究人卵巢顆粒細胞凋亡與疾病發生的關系，從而為臨床上卵細胞功能評價、胚胎發育預測及生殖障礙相關疾病的治療提供全新的方法與思路。