人乳頭瘤病毒疫苗的應用及研究進展

尤淑文 葉菁 呂衛國

宮頸癌是目前唯一病因明確，可預防可篩查的腫瘤。基于一級預防策略，目前預防性人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）疫苗已逐漸普及，可有效預防大部分宮頸癌及生殖器疣。同時，隨著宮頸癌篩查技術的成熟及普及，越來越多的HPV感染狀態被發現，二級預防——治療性疫苗的研發也成為熱點。治療性疫苗可介導有效的細胞免疫，產生病毒特異的細胞毒T細胞，殺死HPV感染的細胞，逆轉HPV誘導的相關組織損傷，從而降低宮頸癌的發生率及病死率。本文現針對預防性及治療性HPV疫苗的機制、種類及目前存在的問題等研究進展作一綜述。

1 HPV預防性疫苗

1.1 疫苗應用效果 目前，中國食品及藥品管理局已批準上市了3種預防性HPV疫苗，分別是2價疫苗、4價疫苗和9價疫苗。這3種疫苗均覆蓋HPV16和18這兩種亞型，4價疫苗還可預防約90%與HPV6、11相關的肛門、生殖器疣。9價在4價疫苗的基礎上，增加了對31、33、45、52、58型 HPV 的預防，即 9價 HPV 疫苗可預防約90%的宮頸癌及90%的肛門、生殖器疣[1-2]。

有研究表明，接種9價HPV疫苗的人群5年后仍可檢測到持續性HPV抗體應答，并證明其抗體應答是持久的[3]。而接種4價疫苗6年后，14～19歲女性的4價疫苗相關HPV感染率下降了64%[4]。另一項研究發現，接種4價HPV疫苗的女性在10年的隨訪中均未檢查出與HPV 16、18型相關的高級別宮頸上皮內病變（cervical intraepithelial neoplasia 2/3，CIN 2/3），證明 4 價疫苗可持續提供至少10年的保護作用，其效力至少在10年內保持在90%以上[5]。一項長達9.4年的隨訪研究表明，接種2價疫苗3年后，接種人群中沒有發生HPV16、18感染及其相關的癌前病變及癌變，并且接種人群的HPV抗體滴度在9年后仍保持高水平狀態[6]。

1.2 疫苗接種實施方案 臨床研究提示，年齡＜15歲及年齡≥15歲的女性分別接受2劑及3劑HPV疫苗，其抗體滴度無顯著差異。因此世界衛生組織（World Health Organization，WHO）在 2015年對 HPV 疫苗（包括2、4、9價疫苗）劑量實施方案進行修訂，將＜15歲女性的3劑HPV疫苗方案改為2劑，但≥15歲女性仍推薦3劑方案[7]。使用上述疫苗實施方案可有效降低疫苗成本并提高覆蓋率[8]。

隨著疫苗研究不斷進展，9價疫苗已經被證實可預防的HPV范圍更廣，接種過2價或4價疫苗的個體可繼續接種9價疫苗鞏固、增強疫苗保護作用。注射4價或2價疫苗未滿3劑者，補注射9價疫苗至滿3劑，其抗體滴度水平以及新增加的亞型產生的抗體水平同樣具有保護效力。完成2價或4價疫苗的3劑接種計劃后再接種9價疫苗可以使抗體滴度達到一個較高并且穩定的水平[9]。

1.3 注射HPV預防性疫苗人群的宮頸癌篩查方案接種預防性HPV疫苗并不能取代常規宮頸癌篩查，因為現有的預防性疫苗并不能覆蓋所有HPV致癌型別。此外，不是所有人群都能在指定的年齡階段進行疫苗接種，故無法確認在接種疫苗前是否已接觸過高危型HPV[10]，且不是所有人均在規定時間內完成接種計劃[11]。故無論是否接種過HPV疫苗，均有進行定期篩查的必要性。2018年美國預防服務工作組（United States Preventive Services Task Force，USPSTF）仍推薦 21～29 歲女性每3年進行一次宮頸細胞學檢查，30～65歲女性每3年進行一次宮頸細胞學檢查，或每5年進行一次HPV檢查聯合宮頸細胞學檢查以篩查宮頸癌[12]。

2 HPV治療性疫苗的研究進展

治療性疫苗不同于預防性疫苗，其可誘導產生細胞免疫應答，并對HPV感染誘導的宮頸損傷及癌癥產生治療作用。

2.1 治療性疫苗的臨床意義 首先，預防性疫苗的普及受到一定的限制。至2016年末，雖有70個國家已將預防性疫苗列入國家免疫規劃[13]，但預防性疫苗的應用主要集中在發達國家，欠發達國家的應用率僅8%[14]，而欠發達國家才是宮頸癌，肛門、生殖器疣高發地區。其次，預防性疫苗無法消除已經存在的感染及已經形成的損傷，故預防性疫苗沒有治療效果。目前清除已感染細胞的有效途徑為治療性疫苗誘導的細胞免疫[6，15]。

目前臨床中對宮頸病變的主要治療方法為物理方法切除，但切除術對機體損傷大且易復發。故研發HPV治療性疫苗迫在眉睫，以干預HPV感染所致的低級別病變的進展、誘導現有病變的消退、預防治療后復發。

2.2 治療性疫苗的作用機制 病原體穿透機體上皮或黏膜屏障時，病毒衣殼中的病原體相關分子（pathogen associated molecular pattern,PAMPs）被病原體識別受體（pathogen recognition receptor,PRRs）識別。PRRs的激活促使抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APCs）流入感染部位并吞噬抗原，其后攜帶抗原遷移到淋巴結，進一步激活T細胞，啟動適應性免疫應答。激活的T細胞增殖分化為效應T細胞，可直接消滅病毒感染的細胞。同時，IL-10等細胞因子促進B細胞的增殖與分化，產生抗體，以應對細胞外病原體。

HPV 基因組編碼的 7 個早期蛋白（E1、E2、E4、E5、E6、E7、E8）和 2 個晚期蛋白（L1、L2），均可成為疫苗的抗原靶點。其中，L1、L2編碼病毒衣殼蛋白，于早期感染基底層上皮細胞時起作用；E1、E2參與HPV病毒在宿主細胞內復制增殖。由于該4種蛋白發生于病毒生命周期早期，故可成為疾病早期的治療靶點[16-17]。E6、E7可調控宿主細胞周期，促進腫瘤的發生，兩者僅存在于HPV誘導的癌前病變及癌變的組織中，故可成為HPV誘導的癌前病變及癌變的免疫治療的理想靶點。

2.3 治療性疫苗的種類 將靶點抗原的相關遺傳物質呈遞至APCs，并誘導細胞免疫反應，從而清除損傷及增殖異常的細胞組織是治療性疫苗的主要研究方向。尋找有效的抗原呈遞載體是治療性疫苗治療效果的關鍵。

2.3.1 以核酸為載體的治療性疫苗 DNA載體疫苗是將攜帶抗原相關DNA的質粒轉染至宿主組織細胞中，使其表達抗原相關蛋白，誘導細胞免疫反應，從而起到治療疾病的目的。DNA作為載體的優勢在于構造簡單、成本低，熱穩定性較強，因缺乏抗載體免疫反應，故其可重復給藥，同時誘導體液免疫及細胞免疫，具有良好的安全性及耐受性[18]。目前包含HPV16、18的E6、E7基因片段的DNA載體疫苗VGX-3100，已于2015年進入Ⅱ期臨床試驗，聯合化療應用于167位宮頸癌患者，顯示出較好的治療效果，Ⅲ期臨床試驗正在進行中[19]。

2.3.2 以病毒為載體的治療性疫苗 由于病毒具有將自己遺傳物質轉至宿主細胞并進行復制的能力，故將病毒非重要基因轉換成目標抗原基因，可將抗原基因轉染至宿主細胞，轉錄并翻譯成免疫原性蛋白，從而誘導特異性免疫反應的發生，起到治療目的。目前研究較為廣泛的是腺病毒、腺相關病毒及痘病毒。痘病毒相比于腺病毒，其遺傳物質更多、更穩定，故可攜帶、支持并表達更多的轉入基因[20]。36例CIN1-CIN3患者進行包含HPV E2基因的痘病毒疫苗Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗后，34例痊愈，2例CIN3轉歸至CIN1[21]。進一步對1 176例女性患者及180例男性患者進行Ⅲ期臨床試驗，89.3%的女性患者及55.5%的男性患者痊愈[22]。

2.3.3 以細菌為載體的治療性疫苗 減毒活菌載體疫苗可有效誘導黏膜、體液、細胞免疫反應，疫苗注射后，即被APCs吞噬并有效誘導體液及細胞免疫[23]。最常用減毒活菌為單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm），Lm被吞噬細胞吞噬后，分泌膜活性毒力因子LLO和磷脂酶C，降解囊泡，進入吞噬細胞細胞質中并轉錄、翻譯目標蛋白，并通過內源性抗原處理途徑激活CD4+及CD8+T細胞，從而誘導特異性免疫反應[24]。酵母菌相關疫苗同樣為研究熱點，重組HPV-16 L1酵母株可產生食用型HPV疫苗，在小鼠身上已得到較好應用效果。將編碼優化的HPV-16 L1基因克隆至酵母細胞中，采用層析法純化酵母提取物中的L1蛋白，免疫電子顯微鏡顯示，合成的蛋白含有天然構象表位，具有巨大潛力[25]。以細菌及真菌為載體的治療性疫苗的優勢在于制備成本低，安全性較高，應用后一旦出現不良反應，可立即通過使用抗生素等藥物對其進行清除。

2.3.4 以多肽為載體的治療性疫苗 哺乳動物針對HPV的細胞免疫是由攜帶E6或E7起始表位的肽段誘導產生[26]，以多肽為載體的治療性疫苗的優勢在于安全、穩定、可大批量生產[27]。合成長肽（＞20個氨基酸）被用于載體，其經過APCs加工及呈遞后，可誘導特異性免疫反應。多肽疫苗免疫原性較低，聯合應用PepCan等免疫佐劑可有效提高其免疫原性。多肽疫苗ISA101的Ⅰ期臨床試驗中，47%患者病變部位組織學恢復正常，Ⅱ期臨床試驗中30%患者痊愈，且2年內無復發[28]。

2.4 治療性疫苗研發中存在的問題 治療性疫苗雖然具有較好的應用前景，但目前大多仍處于臨床前及臨床研究階段。幾種取得進展的疫苗也存在較明顯的缺陷。比如DNA載體疫苗注射后，體細胞對DNA的攝取率較低，導致大部分DNA滯留在細胞外[29]。以及疫苗肌肉注射后，質粒進入并轉染肌細胞，然而肌細胞不屬于APCs，無法形成較強的特異性免疫反應，導致效果不佳。病毒載體疫苗的主要問題在于所應用的病毒多為常見病毒，如60%的成年人體內含有高滴度腺病毒抗體[30]，導致腺病毒載體無法進入靶細胞，從而無法達到預期的治療效果。

3 展望

目前應用于臨床的預防性HPV疫苗已取得較好應用效果，9價HPV疫苗對宮頸癌的預防達到90%，各個國家也在努力提高疫苗接種率。相比較而言，治療性疫苗目前還處于研究階段，存在疫苗中抗原攝取率低、誘導細胞免疫原性低等問題。研究人員正在嘗試通過改變局部免疫調節、改變載體密碼子、檢查點阻斷、局部組織細胞膜電穿孔以及聯合應用化療藥物等方法改善缺陷。我們相信治療性疫苗將會更廣泛應用于臨床，預防性疫苗聯合治療性疫苗，可更加全面保護患者免受HPV誘導的宮頸癌等疾病的困擾。