DNA損傷修復相關基因致原發性卵巢功能不全的研究進展

顏圣和，柴雪晨，方舒雨，夏小雨

(上海交通大學醫學院臨床醫學系，上海 200025；2.上海交通大學醫學院組織胚胎學與遺傳發育學系，上海市生殖醫學重點實驗室，上海 200025)

近年來，原發性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)發病率逐漸上升，且呈年輕化趨勢。POI是一種病因復雜的異質性疾病，約有20%～25%的患者攜帶遺傳突變[1]，另外還可能與病毒感染、代謝異常、自身免疫、醫源性及環境等因素相關。通過遺傳學研究，已發現多種可能導致POI的染色體異常，例如，以Turner綜合征為代表的染色體數目異常，以及POF1區域缺失或POF2區域易位等染色體結構異常。已知與POI相關的候選基因涉及卵巢發育及卵子發生的各個環節，如參與原始生殖細胞遷移和增殖的基因(NANOS3)、調控細胞死亡的基因(PGRMC1和FMR1)、激素和受體(FSHR、AMH、AMHR2)、轉化生長因子β超家族(BMP15和GDF9)、染色質及聯會復合物結構蛋白(STAG3、SYCE1、SPIDR、NUP107)、轉錄因子(FIGLA、NOBOX、NR5A1、WT1、FOXL2)、調控線粒體功能的基因(MRPS22、POLG、TWNK、LARS2、HARS2、AARS2、CLPP、LRPPRC)等[2-9]。近年來，隨著基因組測序技術、尤其是全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)的飛速發展，更多的POI候選基因被發現，其中包含一系列DNA損傷修復相關基因，主要通過調控減數分裂中的同源重組(homologous recombination，HR)過程從而影響卵子發生。本文將介紹卵子發生中的DNA損傷修復機制，并對相關基因與POI發生的最新研究進展作一綜述。

一、卵子發生中的DNA損傷修復機制

在減數第一次分裂前期(meiosis prophase I)，同源染色體配對、建立聯會復合體(synaptonemal complex，SC)，在此基礎上，發生DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)并修復。DSB可引入同源染色體之間的遺傳物質交換，增加了基因組多樣性，對于物種的適應和進化非常重要。

在減數分裂同源重組過程中，DSB由SPO11蛋白催化形成。在人卵母細胞中，DSB修復持續時間超過四周，主要通過同源重組(HR)途徑。在HR途徑中，MCM8/MCM9蛋白復合體可以招募MRE11-RAD50-NBS1(簡稱MRN)復合體至斷裂位點，由后者切割形成單鏈DNA(single strand DNA，ssDNA)，并招募重組酶(recombinase)等下游蛋白。其中，RAD51和DMC1是同源重組途徑中重要的重組酶，其功能受許多因素調節，例如，MEIOB/SPATA22蛋白復合物可以穩定RAD51、DMC1與DNA的結合，MND1/PSMC3IP 蛋白復合物可以激發它們的酶活性。在同源重組過程中，重組中間體(recombination intermediates)需要被穩定以促進交叉(crossover)的形成，這個步驟需要例如HFM1和MSH4/MSH5二聚體這一類的解旋酶(helicase)。當交換完成后，同源重組的最后一步是重組交叉結構(double Holliday junctions)的解離，這一過程需要異二聚體MLH1/MLH3的調控與核酸外切酶EXO1的參與。

除同源重組外，非同源末端連接(Nonhomologous end-joining，NHEJ)是DSB修復的第二種機制。已有報道稱，參與調控NHEJ機制的基因XRCC4和LIG4的突變可以導致POI及其它一系列表型[10-11]。

另一個重要的DNA修復途徑，是Fanconi貧血癥(FANC)通路，存在于包括生殖系在內的眾多祖細胞中。這條通路涉及至少20種蛋白質，包括FANCA、FANCC、FANCG和FANCM基因的蛋白產物，上述基因的突變有可能導致POI。例如，在2019年，Yang等[12]在散發POI病例中檢測到了兩種FANCA基因的罕見雜合突變。

二、已知與POI有關的DNA損傷修復相關基因

在POI病例中檢出的已知基因突變涉及減數分裂中DNA損傷修復的各個環節，包括DNA單鏈末端處理、交叉形成、交叉解離等。現將相關基因及突變介紹如下。

1.MCM8和MCM9基因：微小染色體維持復合物組分8(Minichromosome Maintenance Complex Component 8，MCM8)基因位于染色體20p12.3，微小染色體維持復合物組分9(Minichromosome Maintenance Complex Component 9，MCM9)基因位于6q22.31。在體細胞中，MCM蛋白復合體調控DNA復制的起始。而在卵母細胞中，MCM8和MCM9蛋白形成功能復合體，促進同源重組DSB修復的發生。MCM8/MCM9基因突變可能導致配子發生異常和基因組不穩定性。Mcm8敲除雌鼠不育，并易伴發卵巢腫瘤，Mcm9敲除雌鼠同樣不育[13]。

已有多項研究報道，在原發性閉經的患者家系中檢出了MCM8/9基因的純合突變[14-17]，患者并伴有高促性腺激素、小卵巢和幼稚子宮、第二性征發育延遲、身材矮小等癥狀，而雜合突變攜帶者無表型。該基因的純合突變同樣可對男性性腺發育造成影響，表現為睪丸功能或發育不全、少精癥或無精癥[18]。

2.DMC1基因：DNA減數分裂重組酶1(DNA meiotic recombinase 1，DMC1)基因位于染色體22q13.1。DMC1蛋白是減數分裂特異性重組酶。在Dmc1缺失雌鼠中，卵子發生在胚胎期卵巢內中止，成熟小鼠卵巢中生殖細胞消失[19]。

Mandon-Pépin等[20]報道，在一例POI女性中發現了DMC1基因的純合突變。He等[21]報道，在一個中國家系中，在患有POI的女性成員和患有非梗阻性無精癥的男性成員中發現了DMC1基因的純合錯義突變。

3.MEIOB基因：MEIOB(meiosis specific with OB-fold)基因位于染色體16p13.3。MEIOB蛋白可結合單鏈DNA并具有3’-5’核酸外切酶活性。在同源重組過程中，MEIOB與SPATA22蛋白形成復合物，從而穩定重組酶RAD51/DMC1與DSB位點的結合。Meiob敲除的雌、雄兩性小鼠均不育[22]。

近期，Caburet等[23]在一對患POI的姐妹中檢測出MEIOB基因的純合突變，突變造成的截斷MEIOB蛋白無法與SPATA22蛋白及DSB位點結合。這是第一例有關“單鏈DNA結合蛋白突變參與POI發生”的報道。

4.MND1基因：減數分裂核分裂蛋白1(meiotic nuclear division 1，MND1)基因位于染色體4q.31.3，其蛋白產物與PSMC3IP蛋白(見下節)形成穩定的異二聚體，通過與PSMC3/TBP1蛋白復合體的相互作用來激活RAD51和DMC1的重組酶活性，在同源重組過程中發揮不可或缺的作用。

Jolly等[24]對42例POI患者進行外顯子測序，其中一對姐妹確診為高促性腺素性功能減退癥，在她們的基因組中檢測到了MND1基因的純合缺失突變。

5.PSMC3IP基因：蛋白酶體26S亞基ATP酶3相互作用蛋白(PSMC3 interacting protein，PSMC3IP)基因，又稱為HOP2，位于染色體17q21.2。PSMC3IP蛋白與MND1蛋白組成復合體，參與對同源重組的調控。Psmc3ip基因突變雌鼠的卵巢明顯縮小，卵泡缺乏[25]。

Zangen等[26]在一個巴勒斯坦家系中鑒定出了PSMC3IP基因的純合突變，該突變可造成雌激素信號通路的失活。Al-Agha等[27]報道了一個也門的近親婚配家系，該家庭的4個女兒均患有POI、1個兒子表現為無精癥，測序顯示這5名患者都存在PSMC3IP基因的純合突變。上述結果提示PSMC3IP蛋白在生殖細胞發育中發揮重要作用。

6.HFM1基因：減數分裂解旋酶1(helicase family member 1，HFM1)位于染色體lp22.2區域，在睪丸和卵巢中特異性高表達。在減數分裂同源重組過程中，HFM1參與維持重組中間體的穩定，以促進交換的形成。Hfm1敲除雌鼠不育，卵巢小，卵泡減少[28]。

Wang等[29]在兩名患POI的姐妹中發現HFM1基因的復合雜合突變(compound heterozygous mutations)，其父母則為表型正常的雜合突變攜帶者，說明該基因可通過隱性遺傳方式致病。此外，在多組對中國散發性POI患者的研究中也發現了HFM1基因的雜合突變[30-31]，進一步提示HFM1基因突變與POI發生之間的關系。

7.MSH4和MSH5基因：DNA錯配修復蛋白同源物4(MutS homolog 4，MSH4)基因位于染色體1p31.1，DNA錯配修復蛋白同源物5(MutS homolog 5，MSH5)基因位于染色體6p21.33。與HFM1蛋白類似，MSH4/MSH 5異二聚體維持同源重組中間體的穩定。Msh4或Msh5敲除小鼠不育[32-33]。

Carlosama等[34]在一個哥倫比亞POI家系中檢測到了MSH4基因的純合突變。Guo等[35]在一個中國POI家系中檢測到了MSH5基因的純合突變，并在200例散發POI患者中檢測到了3種MSH5基因的雜合突變。

8.ERCC6-PGBD3融合基因：切除修復交叉互補基因6(excision repair cross-complementation group 6，ERCC6)與相鄰的PGBD3(piggyBac transposable element derived 3)基因位于染色體10q11.23。ERCC6基因又稱為科凱恩氏綜合征互補組B(Cockayne syndrome complementation group B，CSB)，編碼的CSB蛋白可與DNA結合、參與轉錄偶聯的DNA損傷修復，該基因的突變可導致科凱恩氏綜合征[36]。PGBD3蛋白功能不明確，可能具有轉錄調節活性。PGBD3基因可轉座插入ERCC6基因，形成ERCC6-PGBD3融合基因，其表達產物ERCC6-PGBD3融合蛋白在卵母細胞核中特異性高表達，可與RNA聚合酶II相互作用，參與轉錄偶聯的DNA損傷修復[37]。

Qin等[37]在432個散發性POI病例和1個包含有4名POI患者的中國家系中，檢測到ERCC6-PGBD3融合基因的3種新突變。這3種雜合突變會造成DNA損傷修復機制的招募延遲或缺失，最終導致POI癥狀，證明CSB-PGBD3融合蛋白在卵子發生中發揮重要作用。

三、結語與展望

POI患者不僅罹受閉經、不孕不育等生殖障礙，而且發生骨質疏松、心血管疾病、抑郁焦慮綜合征、自我認知障礙等疾患的風險同樣增高，POI患者平均壽命較正常絕經女性縮短，POI嚴重影響了女性身心健康。目前，尚無公認有效的方法恢復或改善POI患者的卵巢功能，因此，對POI患者的早期發現、早期干預尤為重要，其中，遺傳學病因研究是實現高危人群篩查和POI早期診治的關鍵之一。

隨著以全外顯子組測序(WES)為代表的下一代測序技術的快速發展，更多的POI候選基因突變將會被發現。然而，許多研究表明，許多POI患者攜帶多基因的復合雜合突變；即使在同一家系、相同基因位點的同一突變類型，POI的臨床表型也可以因人而異。這些現象說明，候選突變的功能效應與致病機制需經過審慎研究。

在未來有關POI致病突變的研究中，應當納入更多不同種族、地域的大樣本。此外，已經確認的POI突變致病基因、尤其是那些在卵子發生早期發揮作用的基因，是否也與男性生精障礙相關？在確診相關致病變異/基因后，是否可以利用基因編輯技術改進卵巢機能？綜上所述，對POI遺傳學發病機制的研究可以深入解析配子發生、生殖功能及不孕不育的分子基礎，在為POI患者提供遺傳咨詢和生育指導方面也同樣至關重要。