VD3與大豆分離蛋白相互作用的多重光譜分析與計算

陳 爽，王小丹，李 瑞，孫洪蕊，王喜波,，江連洲

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.吉林省農業科學院，吉林 長春 130000）

VD3是VD的一種重要形式[1]，可以發揮調節鈣磷代謝，促進骨骼的生長，預防佝僂病、甲亢、癌癥、心血管疾病和增強免疫力等作用[2-4]。VD3是疏水性成分，不溶于水，對多種環境因素很敏感，在光、熱和氧氣的作用下，可以很快發生異構化，化學結構和生理功發生改變，因此將其直接加入到液體食物或飲料中是不可行的[5]。封裝技術是提高其穩定性，保證其生物活性的理想方法[6]。近年來玉米醇溶蛋白、乳清分離蛋白、大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）及多糖等作為VD3的保護物質，被普遍用于封裝技術。Abbasi等[7]用超聲輔助乳清分離蛋白對VD3進行封裝，提高了VD3的水溶性和穩定性。Lee等[8]用pH值偏移和超聲結合制備了SPI納米顆粒并對VD3進行封裝，提高了其抵抗紫外線的能力。目前已經有很多學者通過蛋白與VD3進行相互作用，對VD3進行保護，并取得一定進展，然而鮮有VD3與SPI相互作用的報道。

熒光光譜是一種被廣泛用來探索蛋白質與外源小分子物質（藥物、食品添加劑、表面活性劑、染料和持久性有機污染物等）相互作用的方法[9]。本實驗運用熒光光譜詳細研究VD3與SPI相互作用的重要信息，包括猝滅類型、表觀結合常數、結合位點數、結合距離和作用力；運用同步熒光和紫外-可見光譜探究VD3對SPI結構中色氨酸殘基和酪氨酸殘基微觀環境的影響；運用傅里葉變換紅外光譜研究VD3對SPI二級結構的影響。本實驗進一步驗證VD3與SPI相互作用的存在，為提高VD3水溶性，制備出負載率高、穩定性強的SPI-VD3納米顆粒，擴大VD3應用范圍提供理論依據，也為開發新的大豆蛋白產品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

VD3（純度＞99%） 美國Sigma公司；低溫脫脂豆粕 山東禹王實業有限公司；乙醇 天津市外環化工有限公司；實驗中所用試劑均為分析純；所用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

粉碎機 中德中藥機械有限公司；N24120型電子天平 瑞士Ohaus公司；ALC-310.3型分析天平 德國ACCULAB公司；GL-21M型冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機 德國Christ公司；UV-240IPC型紫外分光光度計、FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司；79-1型磁力加熱攪拌器金壇市雙捷實驗儀器廠；HH-4型數顯攪拌水浴鍋 常州塞浦實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

根據Sorgentini等[10]描述的方法略作改動制備SPI。將脫脂豆粕粉碎過60 目篩得到脫脂豆粉。將脫脂豆粉經堿溶酸沉法制得SPI沉淀物。將沉淀物用去離子水復溶，洗滌兩次以除去殘留其中的鹽離子，然后用2 mol/L NaOH溶液將其pH值調至7.0。通過冷凍干燥機將其進行干燥獲得SPI粉末，將其貯存于-20 ℃冰箱中備用。測得其蛋白質量分數為90.12%。

1.3.2 VD3溶液的制備

為避免VD3降解，以下操作均在避光條件下進行。稱取一定VD3粉末溶于無水乙醇，磁力攪拌以保證其完全溶于乙醇，之后將其稀釋到不同濃度，置于棕色瓶中備用。每次實驗前需重新配制VD3溶液。

1.3.3 SPI-VD3溶液制備

將SPI粉末溶于磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）攪拌4 h配制成4 mg/mL的SPI溶液，備用。

1.3.4 熒光光譜分析

向10 mL SPI溶液（4 mg/mL）中逐漸滴加100 μL不同濃度的VD3溶液，使其中VD3終濃度分別為2.0×10-6、4.0×10-6、6.0×10-6、8.0×10-6、1.0×10-5mol/L，用漩渦振蕩器使其混合均勻，以制備SPI-VD3復合體系，并分別記為SPI-VD3-1～SPI-VD3-5。分別在293、298、306 K的水浴鍋中保溫10 min。設置激發波長為290 nm，發射波長范圍為300～460 nm，激發狹縫為5 nm，掃描速率為12 000 nm/min，電壓為700 mV，測定內源熒光。同步熒光光譜掃描中，室溫條件下，分別固定Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm（Δλ＝激發波長-發射波長）進行掃描。

1.3.5 紫外-可見吸收光譜分析

以無水乙醇作空白，測定VD3及各樣品在200～500 nm波長范圍內的紫外-可見吸收光譜。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將SPI溶液和SPI與VD3混合溶液（SPI質量濃度為4 mg/mL，VD3質量濃度為0.8 mg/mL）冷凍干燥，將1 mg冷凍干燥后的樣品與150 mg KBr粉末混合研磨，然后在6～8 T壓力下將混合粉末壓制成固體薄片，以用于傅里葉變換紅外光譜測定。使用FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀進行全波段（4 000～400 cm-1）掃描，設置分辨率為4 cm-1，掃描次數為32 次。

1.4 數據統計與分析

每組數據均重復3 次，數據均用SPSS 17.0軟件通過方差分析進行差異顯著性分析，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 VD3對SPI內源熒光光譜的影響

蛋白質的內源熒光主要依賴于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）這3 種具有苯環結構或共軛雙鍵的氨基酸。在激發波長為290 nm時，主要反映了色氨酸和酪氨酸的熒光光譜，苯丙氨酸的作用很弱可以忽略[11]。如圖1所示，VD3的加入使SPI的熒光強度降低，且VD3添加量越多，熒光強度越低，這說明VD3對SPI產生了熒光猝滅，且VD3含量越高，猝滅效果越強。同時發現SPI的最大熒光發射波長從360.2 nm紅移至362.8 nm，紅移了2.6 nm。這可能是因為VD3的存在導致SPI空間結構發生改變，SPI的發色基團酪氨酸殘基和色氨酸殘基的微環境由疏水環境向親水環境轉變，蛋白分子解折疊使SPI分子的三級結構更加舒展，內部色氨酸殘基被遮蔽因而使SPI熒光發生猝滅[12]。

圖1 VD3對SPI內源熒光光譜的影響Fig. 1 Effect of VD3 on the fluorescence intensity of SPI

2.2 VD3-SPI復合物的結合常數、結合位點數

熒光猝滅有兩種作用機制，即動態猝滅和靜態猝滅[13]。若熒光猝滅是由猝滅劑與基態熒光通過弱的作用力形成復合物導致，即靜態猝滅。若熒光猝滅僅是由于猝滅劑與激發態熒光分子碰撞導致的，則為動態猝滅[14]。猝滅類型可以用Stern-Volmer方程[15]進行判斷，如公式（1）所示。

式中：F0為未加入猝滅劑VD3時SPI的熒光強度；F為加入猝滅劑VD3后SPI的熒光強度；Ksv為動態猝滅常數/（L/mol）；[Q]為VD3的濃度/（mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數/（L/（mol·s））；τ0為不添加猝滅劑時熒光體的壽命/s，蛋白的平均壽命約為10-8s

根據Stern-Volmer方程，以[Q]為自變量、F0/F為因變量作圖。VD3-SPI復合物的Ksv和Kq均可根據圖中擬合的直線斜率計算，結果見表1。對于動態猝滅，溫度升高會增加離子有效碰撞的數目，促進電子的轉移，使熒光物質的猝滅常數增大；而對于靜態猝滅，隨著溫度升高，熒光物質與小分子形成的復合物穩定性下降，使熒光物質的猝滅常數逐漸減小[16]。本實驗選擇293、298 K和306 K 3 個溫度，以確定猝滅常數隨溫度的變化趨勢，進而確定VD3對SPI的猝滅類型。

由圖2可知，本實驗中，VD3對SPI的Stern-Volmer曲線均呈現一定的線性關系，且直線的斜率隨溫度升高而減小，即猝滅常數隨溫度的升高而減小，因此VD3對SPI的猝滅為靜態猝滅。猝滅劑對于生物大分子最大猝滅速率常數一般為2×1010L/（mol·s）[17]，而VD3對SPI的猝滅常數數量級為1012（表1），遠遠高于1010，這進一步確定該猝滅是由VD3與SPI結合形成化合物產生的是靜態猝滅。

表1 SPI-VD3復合物的熒光猝滅常數及線性相關系數Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of SPI-VD3 complex

圖2 不同溫度條件下VD3猝滅SPI的Stern-Volmer圖Fig. 2 Stern-Volmer plots of SPI quenching by VD3 at different temperatures

對于靜態猝滅，結合常數KA和結合位點數n可由式（2）計算。

式中：F0為未加入猝滅劑VD3時SPI的熒光強度；F為加入VD3猝滅劑后SPI的熒光強度；KA為表觀結合常數；n為結合位點數；[Q]為猝滅劑的濃度/（mol/L）。

根據公式（2），以lg[Q]為自變量、lg（（F0－F））/F）為因變量作圖，將散點圖進行線性擬合得到圖3，3 個不同溫度下VD3與SPI相互作用的結合位點數n和表觀結合常數KA均可根據直線的斜率和截距計算得出（表2）。從表2可以看出，VD3與SPI間的表觀結合常KA數量級為104，這表明VD3與SPI在293、298、306 K這3 個溫度點都發生了緊密的結合。當溫度由293 K升高到306 K時，結合位點數由0.973 3升高到1.094 2，均接近1，其受溫度影響不明顯。

圖3 不同溫度條件下VD3猝滅SPI的雙對數曲線Fig. 3 Double logarithmic curves of SPI quenching by VD3 at different temperatures

表2 SPI-VD3復合物的結合位點數、表觀結合常數及線性相關系數Table 2 Apparent binding constants, binding site numbers and correlation coefficients of SPI-VD3 complex

2.3 VD3與SPI相互作用的熱力學參數及作用力

通常小分子與蛋白質之間的相互作用力有4 種，即氫鍵、靜電作用、范德華力和疏水作用力。Ross等[18]提出藥物小分子與蛋白質之間的主要作用力類型可根據反應前后體系的熱力學參數焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小進行判斷。當ΔH＞0、ΔS＜0時，分子間作用力主要是靜電引力和疏水作用力；當ΔH＞0、ΔS＞0時，分子間的主要作用力為疏水作用力；當ΔH＜0、ΔS＜0時，分子間作用力主要是范德華力、氫鍵或質子化等作用；當ΔH＜0、ΔS＞0時，分子間作用力主要是靜電引力[19]。本實驗中溫度相差不大，因此焓變可視為常數[20]?？捎蒝an't Hoff方程計算出焓變ΔH、熵變ΔS和吉布斯自由能ΔG的數值并判定VD3與SPI之間的作用力類型。

式中：K為在相應溫度下體系的結合常數；R為理想氣體常數8.314 J/（mol·K）；ΔG為吉布斯自由能/（kJ/mol）；ΔH為焓變/（kJ/mol）；ΔS為熵變/（J/（mol·K））。

通過計算得大豆蛋白與VD3相互作用的焓變ΔH、熵變ΔS和吉布斯自由能ΔG，如表3所示。

表3 VD3與SPI結合的相關熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters for interaction between VD3 and SPI

由表3可知，ΔG＜0、ΔH＞0，表明VD3與SPI之間的相互作用為自發進行的吸熱反應，溫度升高，將有利于反應的進行，該結果與結合常數KA隨著溫度升高而增大的變化趨勢相一致，進一步確定VD3與SPI是一個吸熱過程。由ΔH＞0和ΔS＜0可說明靜電引力和疏水相互作用是使VD3與SPI形成復合物的主要作用力。

2.4 VD3與SPI的結合距離

對于藥物小分子物質與蛋白形成的復合物，結合位置與蛋白質分子中熒光基團之間的距離可根據F?rster[21]理論計算得出。結合位置與蛋白質分子中熒光基團距離越近，蛋白質越容易儲存與運輸藥物小分子，藥物小分子則能更好地發揮其藥理作用[22]。由圖4可發現，SPI的熒光光譜與VD3的紫外吸收光譜發生了重疊，此時SPI與VD3之間發生非輻射能量轉移。各物理量符合式（6）、（7）關系。

圖4 SPI的熒光光譜與VD3的紫外吸收光譜的重疊光譜Fig. 4 Overlap of fluorescence spectrum of SPI with absorption spectrum of VD3

式中：E為能量轉移效率；R0為E為50%時臨界距離（福斯特距離）/nm；r為供體與受體的結合距離/nm。

式中：K為供體和受體各項隨機分布的取向因子，本實驗中取K2為2/3；n為介質折射指數，取水和有機物平均值1.336；ΦD為給體的熒光量子產率，取值0.15；J為供體的發射光譜與受體的紫外吸收光譜二者重疊積分（式（8））。

式中：FD（）為供體在 至+d波數間隔內的校正熒光強度，熒光總強度歸一化為1；εA（）為受體在波數 的摩爾吸光系數/（L/（mol·cm））。

能量轉移效率E可用公式（9）計算。

根據圖4的光譜圖求出積分J，并確定E、K2和n，則R0和r均可被求出。

圖4為SPI的熒光光譜和VD3的紫外吸收光譜，先將熒光總強度歸一化為1，然后將光譜重疊部分分割成極小的矩形，通過式（8）求得重疊積分J（ν）＝8.84×10-15。

在上述實驗條件下，將K2＝2/3、n＝1.336、ΦD＝0.15和J（ν）＝8.84×10-15代入式（7），求得臨界距離R0＝2.50 nm。再將F＝844、F0＝606帶入式（9）計算得到能量轉移效率E＝0.282。經式（6）求得VD3距色氨酸殘基的最短距離r＝2.92 nm。已知臨界距離最大范圍是5～10 nm，給體和受體間結合最大距離范圍是7～10 nm[23]，R0＜5 nm，r＜7 nm說明VD3與SPI足夠靠近，其結合是通過非輻射能力轉移而促使蛋白質的熒光猝滅。

2.5 VD3與SPI相互作用的同步熒光光譜分析結果

由于同步熒光光譜的最大發射波長的紅移或藍移可以反映氨基酸殘基周圍微環境的極性變化，其常被用于研究蛋白質與藥物分子之間相互作用[24]。分別固定激發和發射單色器的波長差Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，進行同步熒光光譜掃描，可得到反映酪氨酸殘基和色氨酸殘基微觀環境變化的熒光特征光譜[25]。

圖5 SPI-VD3體系的同步熒光光譜Fig. 5 Synchronous fluorescence spectra of SPI-VD3 at room temperature

由圖5可知，隨著VD3含量的增加，兩個同步熒光光譜圖的熒光強度均降低，且其最大吸收波長均有紅移。酪氨酸殘基（Δλ＝15 nm）的最大吸收波長由300 nm紅移至301 nm，紅移1 nm，色氨酸殘基（Δλ＝60 nm）最大吸收波長由294 nm紅移至294.6 nm，紅移0.6 nm。該結果說明VD3與SPI相互作用使酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍的疏水環境減弱，導致SPI構象發生改變且酪氨酸殘基的紅移距離比色氨酸的大，VD3與SPI的結合位點更接近酪氨酸殘基[26]。

2.6 VD3與SPI相互作用的紫外-可見光譜分析結果

紫外-可見吸收光譜法是用于表征蛋白質結構變化及蛋白質-小分子復合物相互作用的常用方法之一。一般來說，峰強度變化大小與兩者相互作用強弱有關，而峰位的改變通常是因為小分子與蛋白質相互作用使生色團周圍微環境改變[27]。圖6顯示了不同濃度VD3對SPI紫外-可見吸收光譜的影響，隨著VD3濃度的增加，SPI的紫外-可見光吸收光譜吸光度逐漸增強，最大吸收峰波長由259 nm紅移至262 nm，紅移了3.0 nm。說明VD3與SPI發生了相互作用，使SPI芳香族氨基酸所處的微環境發生了變化，VD3誘導SPI肽鏈伸展，造成了SPI構象發生改變，進而增強了吸光度。

圖6 VD3對SPI紫外-可見吸收光譜的影響Fig. 6 Effect of VD3 on the UV-Vis absorption spectrum of SPI

2.7 VD3與SPI相互作用的傅里葉變換紅外光譜分析結果

圖7 VD3對SPI傅里葉變換紅外光譜的影響Fig. 7 Effect of VD3 on the Fourier transform infrared spectrum of SPI

傅里葉變換紅外光譜法是一種研究蛋白質二級結構構象變化的常用技術[28]。其中在酰胺I區（1 700～1 600 cm-1，主要是C＝O伸縮）和酰胺II區（1 600～1 500 cm-1，C—N伸縮振動和N—H彎曲振動）范圍內紅外吸收峰的變化可以反映蛋白質二級結構的變化[29]。由圖7可知，VD3加入后降低了酰胺I區和酰胺II區的透光率，且均使酰胺I區和酰胺II區發生了不同程度的紅移。VD3的加入引起SPI酰胺I區從1 632.93 cm-1藍移至1 631.96 cm-1，酰胺II區從1 531.28 cm-1紅移至1 533.13 cm-1，說明VD3使SPI的二級結構發生了變化。

3 結 論

本實驗通過熒光光譜法研究了VD3與SPI之間的相互作用，發現VD3會與SPI結合產生復合物而造成靜態猝滅，在3 個溫度下均形成了結合位點接近1的復合物，VD3與SPI之間有較強的結合作用，結合時通過非輻射能力轉移而促使蛋白質的熒光猝滅。二者之間的反應為自發的吸熱反應，作用力主要為靜電相互作用和疏水相互作用。VD3的加入使熒光光譜、同步熒光光譜和紫外-可見光譜中樣品的最大吸收波長均發生紅移，表明SPI中芳香族氨基酸色氨酸殘基和賴氨酸殘基所處的微觀環境發生改變，使SPI的分子構象發生改變，SPI肽鏈更加延展。傅里葉變換紅外光譜表明VD3引起SPI的二級結構發生改變。