15 種黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺含量的影響

趙 磊，張會敏，李煜彬，郝 帥，陳艷麟，徐 杰，王成濤

（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京 100048）

燒烤是肉制品傳統的加工方式之一[1]。肉制品含有豐富的蛋白質，在烤制過程中易生成一類具有致癌、致突變作用的有機物——雜環胺[2-4]。雜環胺可分為氨基咪唑氮雜芳香烴（aminoimidazo azaarens，AIAs）和氨基咔啉（amino-carbolines）兩大類，其化學結構和產生機制也有所不同[5-6]。AIAs是由肌酸/肌酐、氨基酸和還原糖在300 ℃以下縮合聚合形成的，主要有2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉（2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，MeIQx）、2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4,5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine，PhIP）、2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉（2-amino-3-methylimidazo[4,5-f] quinoline，IQ）等；而氨基咔啉是氨基酸和蛋白質在300 ℃以上的高溫條件下熱裂解產生的[7-8]，主要有3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚（3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole，Trp-P-1）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚（3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole，Trp-P-2）、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole，AαC）、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole，MeAαC）、2-氨基-6-甲基吡啶[1,2-a:3'2'-d]咪唑（2-amino-6-methylpyridine并[1,2-a:3'2'-d]imidazole，Glu-P-1）、2-氨基-二吡啶并[1,2-a:3'2'-d]咪唑（2-amino-dipyrido[1,2-a:3'2'-d]imidazole，Glu-P-2）。也有一些氨基卡啉類雜環胺可在100 ℃生成，如β-咔啉類1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（Harman）、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（Norharman）等[9]。迄今為止，人類已經在食用肉制品中發現了30多種雜環胺[10-11]。隨著人們對于健康飲食的追求日趨強烈，有效抑制熱加工肉制品中雜環胺的生成成為當前研究的熱點。

黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，根據結構可主要分為黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、黃烷醇類和二氫黃酮類等[12-13]。研究表明一些黃酮類化合物如表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、木犀草素和槲皮素能夠有效抑制MeIQx、PhIP、IQ等雜環胺的形成[14-15]。傳統觀點認為自由基反應參與了雜環胺的生成，抗氧化劑及植物提取物抗氧化成分能夠清除美拉德反應中產生的吡啶和吡嗪等自由基，從而抑制雜環胺的生成[16-18]。Cheng等[19]在研究12 種酚類化合物對牛肉中PhIP含量的影響時發現，柚皮素、槲皮素等黃酮類化合物能夠與PhIP生成中間產物苯乙醛結合，生成特定的化合物，淬滅活性羰基，從而阻斷了苯乙醛與肌酸酐進一步反應，進而間接抑制PhIP的生成。然而，目前主要采用模擬體系研究黃酮類化合物對雜環胺形成的影響，模擬體系的理論在真實體系中是否適用尚有待考證，且在黃酮類化合物的選擇上也缺乏系統性。因此，系統地選擇不同類型的黃酮類化合物，探究其在實際烤肉體系中對雜環胺形成的影響，可為有效控制雜環胺生成、減少其對人類健康的危害提供理論參考。

本實驗以烤雞胸肉為對象，采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法[20-21]測定烤雞胸肉中雜環胺含量，研究不同類型的黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺形成的影響，并運用主成分分析法比較15 種黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺形成影響的差異性，以期為開發高效抑制雜環胺形成的天然添加物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞胸肉 北京永輝超市；槲皮素、槲皮苷、山柰酚、兒茶素、表兒茶素、EGCG（純度均為98%以上）成都瑞芬思生物科技有限公司；高良姜素、楊梅素、芹菜素、木犀草素、柚皮素、橙皮素、染料木素、大豆苷元、葛根素（純度均為98%以上） 北京百靈威科技有限公司；Norharman、Harman、PhIP、IQ、2-氨基-3,4-二甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹啉（2-amine-3,4-dimethyl-3H-imidazo[4,5-f]quinolin，MeIQ）、MeIQx、2-氨基-3,4,8-三甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹喔啉（2-amino-3,4,8-trimethy-3H-limidazo[4,5-f]quinoxaline 4,8-DiMeIQx）、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉（4,7,8-TriMeIQx）（純度99%以上） 加拿大TRC公司；甲醇、乙腈（均為色譜級） 美國Fisher Chemical公司；色譜級甲酸美國Mreda公司；Oasis MCX小柱（3cc/60 mg） 美國Waters公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

6460三重串聯四極桿液相色譜質譜聯用儀 美國Agilent公司；MS105DU分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；VORTEX-5漩渦振蕩器 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；APE-12固相萃取裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；GM-0.33A真空泵 天津市津騰實驗設備有限公司；CRTF-電烤箱 佛山市偉仕達電器實業有限公司；RS-JR09A絞肉機 合肥榮事達三洋電器股份有限公司；RV10旋蒸儀 德國IKA公司；NK200-1B氮吹儀 杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烤雞肉餅的制備

雞胸肉切小塊，用絞肉機絞碎，每個肉餅稱取40 g肉糜于小燒杯中，將0.05 mmol黃酮類化合物溶解在2 mL二甘醇中，倒入小燒杯與肉糜攪拌混合均勻，制成直徑6 cm、厚1 cm的圓形肉餅，置于直徑6 cm培養皿中[22-23]，置于4 ℃腌制12 h。將肉餅置于電烤箱中220 ℃烤制10 min，隨后翻面再烤制10 min。同時以不添加黃酮類化合物的烤雞肉餅作對照。烤制結束后立即冷卻，隨后將烤雞肉餅冷凍干燥，并用粉碎機粉碎成粉末，放置于冰箱中-20 ℃貯存。

1.3.2 雜環胺的提取與分析

稱取6 g烤肉粉末于錐形瓶中，加入25 mL 1 mol/L NaOH溶液，同時加入質量濃度為100 ng/mL的4,7,8-TriMeIQx的內標溶液，均質10 min，向均質后的膏狀液體中加入15 g硅藻土，攪拌使其充分混合，隨后加入50 mL乙酸乙酯，超聲抽提30 min，過濾收集提取液，重復超聲抽提一次，合并兩次提取液，分液后取乙酸乙酯層，減壓濃縮至10 mL。

將乙酸乙酯提取液上樣到Oasis MCX固相萃取柱中，固相萃取柱在使用前依次經6 mL甲醇、6 mL超純水以及6 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液潤洗預處理，待提取液全部通過固相萃取柱后，先后以6 mL 0.1 mol/L鹽酸和6 mL甲醇清洗固相萃取柱，最后用6 mL甲醇-氨水（95∶5，V/V）洗脫吸附在固相萃取小柱上的雜環胺[24-26]。將盛有洗脫液的試管用氮吹儀45 ℃下揮去溶劑，加入1 mL甲醇復溶，并采用0.22 μm尼龍針孔濾器過濾于進樣小瓶中，進行UPLC-MS/MS檢測，并按下式計算各黃酮類化合物處理組的雜環胺抑制率。

液相色譜條件：色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A相為體積分數0.1%甲酸溶液，B相為乙腈；梯度洗脫條件為0～10 min，10%～60% B；10～12 min，60%～90% B；12～13 min，90%～10% B；13～15 min，10% B。流速為0.2 mL/min；進樣量，1 μL；柱溫：25 ℃。

質譜條件：檢測技術為多反應監控模式；離子化方式為正離子模式電噴霧二級質譜；毛細管電壓額3.5 kV；碰撞能量為：IQ，31 eV；4,8-DiMeIQx，23 eV；Norharman，40 eV；Harman，39 eV；MeIQ、4,7,8-TriMeIQx，30 eV；MeIQx、PhIP，28 eV；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為350 ℃；干燥氣流速為10 L/min。

1.3.3 雜環胺測定的方法學考察

本研究對檢測方法線性范圍、最低檢測限（limits of detection，LODs）和最低定量限（limits of quantification，LOQs）、加標回收率、精密度等方法學參數進行測試分析。

線性范圍：以雜環胺標準品溶液與內標物（100 ng/mL 4,7,8-TriMeIQx）的質量濃度比為橫坐標，以相應的雜環胺標準品與內標物的二級質譜峰面積比為縱坐標，繪制標準線性曲線，并計算線性回歸方程和決定系數R2。

證明：由于ri(t)，ai(t)，b(t)，ci(t)，di(t)，ki(t)，αi(t)，βi(t)(i=1,2)為時標上的概周期函數，則存在序列{τn}，當n→∞時，有τn→∞，使得ri(t+τn)→ri(t)，ai(t+τn)→ai(t)，b(t+τn)→b(t)，di(t+τn)→di(t)，ki(t+τn)→ki(t)，αi(t+τn)→αi(t)，βi(t+τn)→βi(t)，i=1,2.

LODs和LOQs：將7 種雜環胺的混合標準品溶液逐級稀釋，然后進行測定，分別記下當雜環胺色譜峰達到3 倍信噪比（RS/N）和10 倍RS/N時的雜環胺標準品質量濃度，即為儀器對各種雜環胺的LODs和LOQs，單位為ng/mL。

加標回收率：向空白烤雞胸肉樣品中加入3 種不同劑量（10、50、100 ng/g）的雜環胺混合標準品溶液后，采用上述前處理方法對雜環胺進行提取和凈化，最后測定雜環胺的含量。測得的雜環胺的含量與加入雜環胺標準品含量的比值，即為方法的回收率。

精密度：向空白烤雞胸肉樣品中加入雜環胺混合標準品工作液后，制成待測樣品。記錄連續5 d內對相同的加標樣品測定所得的雜環胺含量的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），即為精密度。

1.4 數據處理與分析

實驗結果以平均值±標準偏差表示，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，多重比較采用Duncan法，P＜0.05為差異顯著。采用SPSS 19.0軟件進行主成分分析（principle component analysis，PCA），比較不同黃酮類化合物對雜環胺形成影響的差異。

2 結果與分析

2.1 雜環胺檢測的方法學考察

采用1.3.2節方法對烤雞胸肉中雜環胺進行處理和含量分析，所得的方法學數據如表1所示。結果顯示，該方法的R2均大于0.999 2，對IQ、MeIQ、MeIQx和4,8-DiMeIQx的線性范圍為0.5～100 ng/mL，對Harman和Norharman的線性范圍為5～500 ng/mL，對PhIP的線性范圍為1～200 ng/mL。按RS/N為10確定定量限，樣品加標后測得該方法的LOQs范圍為0.039～0.249 ng/mL，滿足對于痕量雜環胺進行檢測的要求。選擇空白烤雞胸肉進行3 個水平的加標回收實驗，測得回收率可達60.27%～83.22%。精密度實驗結果表明，該方法的日間RSD均在5.42%以下，說明該方法結果穩定、重現性良好。

表1 雜環胺檢測的方法學數據Table 1 Methodological data for heterocyclic amines detection

2.2 15 種黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺含量的影響

由表2可知，黃酮類化合物對Norharman的抑制作用由高到低依次為：染料木素＞EGCG＞木犀草素＞葛根素≈大豆苷元≈柚皮素≈橙皮素＞兒茶素≈表兒茶素＞槲皮素≈槲皮苷＞高良姜素。其中，染料木素對Norharman形成的抑制率最高，為29.22%；EGCG效果次之，抑制率可達22.27%。而芹菜素、山柰酚、高良姜素和楊梅素均對Norharman的形成有促進作用。黃酮類化合物對Harman的抑制作用由高到低依次為：染料木素≈木犀草素＞EGCG。染料木素和木犀草素對Harman的抑制率最高，分別為30.92%和28.95%。而芹菜素、高良姜素、柚皮素、槲皮苷、槲皮素、大豆苷元、兒茶素、表兒茶素、葛根素、山柰酚、楊梅素和橙皮素對Harman的形成有促進作用。黃酮類化合物對PhIP的抑制作用由高到低依次為：EGCG≈柚皮素＞木犀草素＞染料木素＞高良姜素≈葛根素≈表兒茶素。其中EGCG對PhIP的抑制率最高，為57.29%；其次為柚皮素和木犀草素，對PhIP的抑制率均在45%以上。而兒茶素、槲皮素、橙皮素、芹菜素、山柰酚、大豆苷元、楊梅素和槲皮苷對PhIP的形成有促進作用。黃酮類化合物對MeIQx的抑制作用由高到低依次為：染料木素＞柚皮素＞木犀草素＞高良姜素＞山柰酚≈大豆苷元≈芹菜素＞EGCG＞葛根素≈表兒茶素＞橙皮素＞槲皮素。其中染料木素對MeIQx的抑制率最高，為71.57%；柚皮素和木犀草素對MeIQx的抑制率均在55%以上。而槲皮苷、兒茶素和楊梅素對MeIQx的形成有促進作用。黃酮類化合物對4,8-DiMeIQx的抑制作用由高到低依次為：柚皮素＞高良姜素≈山柰酚≈染料木素＞木犀草素＞EGCG＞葛根素≈橙皮素＞大豆苷元≈槲皮素＞楊梅素。其中柚皮素對4,8-DiMeIQx的抑制率最高，為64.09%；柚皮素、高良姜素、染料木素和山柰酚對4,8-DiMeIQx的抑制率均在45%以上。而芹菜素、表兒茶素、槲皮苷和兒茶素對4,8-DiMeIQx的形成有促進作用。部分黃酮類化合物對雜環胺的形成有促進作用，尚不清楚是何原因導致，需要進一步研究。15 種黃酮類化合物中僅EGCG、染料木素、木犀草素和柚皮素對烤雞胸肉中雜環胺總量顯示出明顯的抑制作用，抑制率可達27%以上。

表2 15 種黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺的抑制率Table 2 Inhibition rates of 15 flavonoids on the contents of heterocyclic amines in roast chicken breast%

秦川[27]研究了8 種黃酮類化合物對烤牛肉中雜環胺PhIP含量的影響，研究結果顯示根皮苷、EGCG、槲皮素和柚皮素對PhIP的抑制效果最佳，與本研究中EGCG和柚皮素對PhIP的抑制效果較好相一致；而本研究中槲皮素對PhIP生成有促進作用，且槲皮素的添加量（0.125 mmol/100 g雞肉糜）低于秦川[27]研究中槲皮素的添加量（0.5 mmol/100 g碎牛肉），推測可能是由于原料肉的種類、肉前處理的方式以及槲皮素所選劑量等的差異導致。Puangsombat等[28]研究5 種香料對煎牛肉餅中雜環胺MeIQx和PhIP的抑制作用時發現，高良姜素對煎牛肉中MeIQx和PhIP也有一定的抑制作用，與本研究結果一致。

2.3 基于主成分分析的15 種黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺形成的影響

圖1 15 種黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺的PCA得分圖Fig. 1 PCA score scattering plot for the inhibitory effects of 15 flavonoids on the contents of heterocyclic amines in roast chicken breast

為研究15 種黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺譜的影響，通過主成分分析的方法研究15 種黃酮對烤雞胸肉中5 種雜環胺的抑制作用之間的差異性。如圖1所示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的貢獻率分別為62.92%和20.19%，累計貢獻率達83.11%，能較好地反映雜環胺譜的信息。表兒茶素、槲皮素、橙皮素、葛根素、大豆苷元和芹菜素聚集在一起，說明這6 種黃酮類化合物對雜環胺形成的影響彼此間差異較小；兒茶素和槲皮苷聚集在一起，說明二者對于雜環胺形成的影響差異較小，二者均對Norharman的形成有抑制作用，對Harman、PhIP、MeIQx和4,8-DiMeIQx的形成有促進作用；EGCG、木犀草素和染料木素聚為一類，分布在第一主成分軸的右邊和第二主成分軸的上邊，在PC1和PC2上得分均較高，說明這3 種黃酮對于雜環胺形成的影響差異較小，對5 種雜環胺（Norharman、Harman、PhIP、MeIQx和4,8-DiMeIQx）均有較強的抑制作用；柚皮素分布在第一主成分軸的右邊，且在PC1上得分較高，其對Norharman、PhIP、MeIQx和4,8-DiMeIQx這4 種雜環胺均有較強的抑制作用。此外，楊梅素、山柰酚和高良姜素分布比較分散，與其他黃酮類化合物之間沒有明顯的分組現象，同時說明這3 種黃酮類化合物與其他黃酮類化合物之間對于雜環胺的影響差異較大。

在因子載荷圖上，每一個變量都體現出其對樣品在得分圖上分布的貢獻，載荷圖中距離原點越遠說明此因子對樣品分類的貢獻系數越大。通過分析圖2可知，在PC1方向上距離中心點最遠的雜環胺分別為PhIP和MeIQx，說明這兩種雜環胺是不同黃酮類化合物處理后的雜環胺譜在PC1上分離的關鍵雜環胺，其形成受到黃酮類化合物的影響較大。第二主成分PC2主要與Norharman和4,8-DiMeIQx有關。結合圖1、2可以得出，EGCG、木犀草素和染料木素處理組對應的雜環胺為Norharman、Harman和PhIP，可見EGCG、木犀草素和染料木素能夠較好地抑制烤雞胸肉中Norharman、Harman和PhIP的形成；而高良姜素和柚皮素處理組對應的雜環胺為MeIQx和4,8-DiMeIQx，說明高良姜素和柚皮素能夠較好地抑制烤雞胸肉中喹喔啉類雜環胺MeIQx和4,8-DiMeIQx的形成。

圖2 15 種黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺的PCA載荷圖Fig. 2 PCA loading plot for the inhibitory effects of 15 flavonoids on the contents of heterocyclic amines in roast chicken breast

如表3所示，對烤雞胸肉中雜環胺抑制作用效果較好的黃酮類化合物分別是木犀草素、染料木素、柚皮素以及EGCG，這4 種黃酮類化合物的化學結構式如圖3所示。通過分析15 種黃酮類化合物的結構特征發現：1）異黃酮類中大豆苷元和葛根素對雜環胺的抑制效果相對較差，經比較這兩種化合物的結構中A環僅含有7-羥基，而其他黃酮類化合物均同時存在5-和7-羥基，由此推測，黃酮母核中同時存在的5-和7-羥基可能對黃酮類化合物有效抑制雜環胺的形成起到重要作用；2）槲皮素、山柰酚等黃酮醇類以及兒茶素和表兒茶素對雜環胺形成的抑制作用相對較差，推測可能由于黃酮母核C環的3-羥基對其抑制雜環胺形成有相反的作用；3）二氫黃酮類化合物中，柚皮素較橙皮素對雜環胺形成有更好的抑制作用，可能與黃酮母核B環中的4'-羥基有關。劉莉華等[29]研究表明，黃酮類中B環的4'-羥基的存在可以延長黃酮體的共軛體系，使整個分子的電子云分布離域，有助于黃酮類化合物形成相對穩定的自由基中間體。同時，4'-羥基供氫后易與3'位的氧共享3'-羥基的氫而形成分子內氫鍵，從而進一步提高3',4'-鄰二羥基黃酮自由基的穩定性。由此推斷芹菜素和木犀草素對雜環胺形成的抑制作用，可能與其抗氧化作用有關。綜上，推測黃酮母核結構中A環同時存在5-和7-羥基，以及B環的4'-羥基對黃酮類化合物有效抑制烤雞胸肉中雜環胺的形成具有重要的作用，而C環中3-羥基的存在會降低黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺形成的抑制作用。此外，EGCG對雜環胺的強抑制作用可能與其結構中具有6 個鄰位酚羥基有關。黃酮類化合物的各活性部位和重要官能團在抑制雜環胺形成中的作用還有待進一步研究。

表3 15 種黃酮類化合物的化學結構示意圖Table 3 Chemical structures of 15 flavonoids

圖3 木犀草素（A）、EGCG（B）、染料木素（C）和柚皮素（D）的化學結構式Fig. 3 Chemical structural formulae of luteolin (A), EGCG (B),genistein (C) and naringenin (D)

3 結 論

本研究采用UPLC-MS/MS法對雜環胺含量進行測定，并采用主成分分析法考察15 種黃酮類化合物對烤雞胸肉中雜環胺形成影響的差異性。結果表明，15 種黃酮類化合物中木犀草素、EGCG、染料木素和柚皮素對烤雞胸肉中雜環胺的形成具有明顯的抑制作用。黃酮母核中A環同時存在5-和7-羥基，以及B環的4'-羥基對黃酮類化合物抑制雜環胺的形成可能具有重要作用，而C環的3-羥基會降低其對雜環胺形成的抑制作用。黃酮類化合物廣泛存在于各種蔬菜、水果及藥用植物中，具有諸多生物活性及保健作用。本研究有助于推動天然黃酮類化合物在熱加工肉制品中的應用，降低人類雜環胺的暴露量，提高食品安全性，保障消費者身體健康，具有重要的理論和實踐意義。