乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL對(duì)單增李斯特菌的抗菌活性及機(jī)制

吳學(xué)友，朱 悅，陳正行，鞠興榮,

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（簡(jiǎn)稱單增李斯特菌）是一種食源性病原菌，其廣泛存在于水、土壤、植物中[1]。該菌可污染牛奶[2]、肉制品[3]、蔬菜[4]等食品，在加工、運(yùn)輸和冷藏條件下均可生長(zhǎng)[5]。單增李斯特菌是人畜共患菌，可引起人和動(dòng)物腦膜炎、敗血癥、胃腸炎等疾病，威脅人類生命與健康[6-7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌可形成生物膜[8]，該結(jié)構(gòu)影響了化學(xué)防腐劑的抑菌效果，給食品加工帶來(lái)難題。此外，化學(xué)防腐劑的安全隱患以及抗生素耐藥菌的大量出現(xiàn)越來(lái)越受到人們重視。因此，尋找新型天然綠色安全的抑菌物質(zhì)已經(jīng)迫在眉睫。

乳酸菌是公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，尤其是乳制品行業(yè)。細(xì)菌素是由細(xì)菌核糖體合成并分泌至細(xì)胞外的一類具有抗菌活性的蛋白質(zhì)（多肽）[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)目標(biāo)菌的抑制具有濃度低、效價(jià)高等特點(diǎn)，且目標(biāo)菌不會(huì)產(chǎn)生耐藥性[11]。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素本身就存在于食品基質(zhì)中，其來(lái)源明確，安全可靠；應(yīng)用于食品防腐保鮮具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)以及極大潛力[12]。近年來(lái)，不同來(lái)源新型細(xì)菌素的研究與挖掘受到科研工作者的廣泛關(guān)注，眾多新型細(xì)菌素陸續(xù)見(jiàn)諸報(bào)道[13-16]。這些細(xì)菌素抑制目標(biāo)微生物的機(jī)理研究也有相關(guān)報(bào)道，如Nisin[17-18]、Pediocin Pa-1[17,19-20]、Plantaricin 163[21]等。Nisin是目前研究最為透徹的細(xì)菌素，自1957年首次商業(yè)應(yīng)用以來(lái)已有60余年且成效顯著[22]，開(kāi)展新型細(xì)菌素的發(fā)掘以及闡釋其抑制目標(biāo)菌相關(guān)機(jī)理具有重大的價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，腸球菌及其產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)單增李斯特菌具有良好的抑制作用[23-26]。乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL是由干酪制品中腸球菌產(chǎn)生的一種新型細(xì)菌素，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌素由43 個(gè)氨基酸組成，且N-端含有保守序列YYGNG[27]，具有良好的理化穩(wěn)定性，如經(jīng)吐溫、玻雷吉和十二烷基硫酸鈉等表面活性劑處理后其抑菌活性保持不變，且在pH 2～11范圍內(nèi)或經(jīng)100 ℃處理30 min仍保持活性[28]。此外，Durancin GL對(duì)單增李斯特菌具有較強(qiáng)的抑制作用，包括抗Nisin的L. monocytogenes NR30[29]。為了充分認(rèn)識(shí)該新型細(xì)菌素對(duì)單增李斯特菌抗菌活性、探索抑制單增李斯特菌相關(guān)機(jī)理，本研究通過(guò)最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）和殺菌動(dòng)力學(xué)考察Durancin GL對(duì)單增李斯特菌的抑制作用，結(jié)合監(jiān)測(cè)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏、菌體存活情況以及形態(tài)學(xué)分析探討Durancin GL對(duì)單增李斯特菌的抑制機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Durancin GL表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建[27]；pGEX-P-1載體 美國(guó)GE公司；單增李斯特菌L. monocytogenes Scott A 江蘇省疾病預(yù)防控制中心；表達(dá)菌株Escherichia coli Rosetta（DE3）、表達(dá)載體pGEX/his-durAB、細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基、腦心浸液（brian heart infusion，BHI）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；其他試劑均為分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；M2e酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；FE32 DDS-電導(dǎo)率儀 德國(guó)Meitele-Tuoliduo公司；UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；GeminiSEM 300掃描電子顯微鏡 德國(guó)Carl Zeiss公司；JEM-2100透射電子顯微鏡日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 Durancin GL的外源表達(dá)及制備

將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX/his-durAB轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E. coli Rosetta（DE3）中，參考Ju Xingrong等[29]的方法，在5 L Jupiter生物反應(yīng)器中制備Durancin GL，生物反應(yīng)器運(yùn)行參數(shù)為：裝液量為2.5 L，溫度37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，無(wú)菌空氣流速為0.5 L/min。每隔一段時(shí)間檢測(cè)生物反應(yīng)器中菌體質(zhì)量濃度、pH值、上清液以及細(xì)胞破碎液中細(xì)菌素的效價(jià)。參考文獻(xiàn)[30]將制備的細(xì)菌素經(jīng)梯度稀釋，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)其對(duì)單增李斯特菌的抑菌效果，以抑菌圈直徑不小于2 mm為具有抑菌效果，用有抑菌效果的最高稀釋倍數(shù)表示細(xì)菌素的效價(jià)。發(fā)酵結(jié)束后，菌液于4 ℃下10 000×g離心15 min，棄上清液，反復(fù)洗滌菌體沉淀后采用液氮冷凍，經(jīng)細(xì)胞破碎儀處理，再次于4 ℃下10 000×g離心15 min，取上清液，利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，借助親和層析柱GE GSTrap 4B分離純化細(xì)菌素，再經(jīng)腸激酶切除標(biāo)簽，再次重復(fù)這一步驟去除標(biāo)簽蛋白后，經(jīng)冷凍干燥即制得乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL凍干粉，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MIC的測(cè)定

MIC定義為抗菌劑可以抑制經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)的微生物出現(xiàn)可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度[31]。將制備的細(xì)菌素配制系列梯度溶液，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)其對(duì)單增李斯特菌的抑菌效果，以抑菌圈直徑不小于2 mm為具有抑菌效果，以有抑菌效果的最低細(xì)菌素溶液質(zhì)量濃度作為外源表達(dá)細(xì)菌素對(duì)單增李斯特菌的MIC，單位為mg/L。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。

1.3.3 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線、OD值和pH值的影響

以體積分?jǐn)?shù)1%向經(jīng)121 ℃、15 min滅菌處理過(guò)的BHI液體培養(yǎng)基中接種單增李斯特菌，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)。每隔一定時(shí)間檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況（以600 nm波長(zhǎng)處菌液的OD值表示），在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL（終濃度為50 AU/mL），繪制單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線，以加入等量無(wú)菌水的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)照。菌液OD值和pH值分別采用分光光度計(jì)和pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.4 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌電導(dǎo)率、OD260nm和OD280nm的影響

單增李斯特菌的培養(yǎng)方法同1.3.3節(jié)，OD600nm＝0.6時(shí)，經(jīng)4 ℃下8 000×g離心15 min收集菌體沉淀，用50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）洗滌細(xì)胞3 次，菌體沉淀重懸于200 μL 50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0），使其OD600nm＝0.4，加入乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL（終濃度為50 AU/mL），每隔一段時(shí)間取樣一次，4 ℃、8 000×g離心15 min，用電導(dǎo)儀測(cè)定上清液的電導(dǎo)率。用分光光度計(jì)測(cè)定上清液OD260nm、OD280nm。以添加等量50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）處理組為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.6 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌存活率的影響

參考文獻(xiàn)[32]的方法并略修改，具體操作如下。當(dāng)監(jiān)測(cè)到單增李斯特菌已處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期時(shí)，向體系內(nèi)加乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL（終濃度為50 AU/mL），繼續(xù)培養(yǎng)5 min，經(jīng)4 ℃、10 000×g離心15 min收集菌體沉淀，取適量沉淀重懸于20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl溶液中，孵育1 h，每隔15 min混勻溶液1 次，經(jīng)4 ℃下10 000×g離心15 min收集菌體沉淀，再次重懸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl溶液中制備單增李斯特菌菌懸液（OD670nm＝0.03～0.30）。取1 μL該菌懸液加入3 μL試劑盒中組分A與組分B等體積混合物，在室溫下黑暗環(huán)境中孵育15 min，立即轉(zhuǎn)入倒置熒光顯微鏡，選擇激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，分別在530 nm（綠色）和630 nm（紅色）波長(zhǎng)處觀察拍照。對(duì)照組為未經(jīng)乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌。

1.3.7 掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察

通過(guò)掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察Durancin GL對(duì)單增李斯特菌的細(xì)胞損傷。以體積分?jǐn)?shù)1%向經(jīng)121 ℃、15 min滅菌處理過(guò)的BHI液體培養(yǎng)基中接種單增李斯特菌，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)。當(dāng)監(jiān)測(cè)到單增李斯特菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，向體系中加入乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL（終濃度為50 AU/mL），繼續(xù)培養(yǎng)5 min，4 ℃、1 500×g離心35 min收集菌體沉淀，參照文獻(xiàn)[33]的方法對(duì)菌體進(jìn)行前處理，并通過(guò)掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。對(duì)照組為未添加乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，采用單因素方差分析結(jié)合Duncan's法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Durancin GL的外源表達(dá)及對(duì)單增李斯特菌的MIC

圖1 重組菌生長(zhǎng)與細(xì)菌素的積累Fig. 1 Growth of recombinant bacterium and bacteriocin accumulation

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)因其高效易純化的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于目的蛋白質(zhì)的外源表達(dá)。從圖1可以看出，重組菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，細(xì)菌素表達(dá)開(kāi)始累積，發(fā)酵上清液與菌體破碎液中Durancin GL效價(jià)測(cè)定結(jié)果顯示兩者差異極大，表達(dá)的細(xì)菌素Durancin GL主要位于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)制備的乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL對(duì)單增李斯特菌L. monocytogenes Scott A的MIC為（2.5±0.4）mg/L。

2.2 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖2 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig. 2 Effect of durancin GL on growth curve of L. monocytogenes

圖2 為乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線的影響，即抑菌動(dòng)力學(xué)曲線。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，向培養(yǎng)體系中添加乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL后，實(shí)驗(yàn)組中OD600nm暫停增加，說(shuō)明單增李斯特菌生長(zhǎng)受抑制。添加乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL后，實(shí)驗(yàn)組菌落總數(shù)開(kāi)始下降，表明單增李斯特菌活菌數(shù)量減少。隨后因細(xì)菌素被消耗，大腸桿菌增長(zhǎng)速率超過(guò)被抑制速率，表現(xiàn)出菌體總數(shù)的增加。杜賀超等[21]研究中使用的細(xì)菌素劑量更高，其結(jié)果顯示目標(biāo)細(xì)菌大量死亡。

2.3 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞膜通透性的影響

菌體細(xì)胞膜通透性可以通過(guò)電導(dǎo)率的改變進(jìn)行觀察。在培養(yǎng)期間，添加磷酸鉀緩沖液的對(duì)照組電導(dǎo)率變化不顯著，乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理組電導(dǎo)率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增大（圖3），推測(cè)乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌膜通透性變大，導(dǎo)致菌體胞內(nèi)物質(zhì)流出，引起上清液電導(dǎo)率的增加。

圖3 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌電導(dǎo)率的影響Fig. 3 Effect of durancin GL on electrical conductivity of L. monocytogenes

2.4 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞膜完整性的影響

上清液的OD260nm、OD280nm反映了單增李斯特菌膜對(duì)蛋白及核酸大分子的通透性，進(jìn)而能夠反映細(xì)胞膜完整性的變化。如圖4所示，在2 h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，對(duì)照組的OD260nm和OD280nm基本保持不變，乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌OD260nm和OD280nm隨著時(shí)間延長(zhǎng)不斷增大，在1.5 h時(shí)均達(dá)到最大值0.2。上清液中OD260nm和OD280nm的增加表明乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL能破壞細(xì)胞膜，使單增李斯特菌細(xì)胞中的大分子物質(zhì)外流，細(xì)胞生長(zhǎng)代謝受到影響。這說(shuō)明乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL不僅能提高單增李斯特菌細(xì)胞膜通透性，而且能破壞細(xì)胞膜的完整性。

圖4 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌OD260 nm（A）和OD280 nm（B）的影響Fig. 4 Effect of durancin GL on optimal density of L. monocytogenes at 260 nm (A) and 280 nm (B)

2.5 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌存活率的影響

LIVE/DEAD BacLight Kit常用于快速檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞存活率[33]，近年來(lái)應(yīng)用越來(lái)越廣泛。利用熒光探針檢測(cè)乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL對(duì)單增李斯特菌存活情況的影響，綠色代表活菌體，紅色代表死菌體。從結(jié)果中可以看出，未經(jīng)乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖5A），乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL可以導(dǎo)致單增李斯特菌部分死亡（圖5B）。圖5結(jié)果直觀反映了細(xì)菌素Durancin GL對(duì)單增李斯特菌的影響，因該方法是通過(guò)熒光探針的熒光信號(hào)來(lái)反映Durancin GL處理后單增李斯特菌細(xì)胞膜通透性的變化，而細(xì)胞膜通透性的增加不一定會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此，細(xì)菌素Durancin GL作用于單增李斯特菌后細(xì)胞存活情況的檢測(cè)采用平板計(jì)數(shù)法更為準(zhǔn)確（圖2）。

圖5 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌存活情況的影響Fig. 5 Effect of durancin GL on survival of L. monocytogenes

2.6 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響

采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察單增李斯特菌的外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，未經(jīng)乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌呈桿狀，表面光滑且飽滿（圖6A）；細(xì)菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌菌體表面凹陷、有褶皺（圖6B）。

圖6 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)影響的掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 Effect of durancin GL on morphology and structure of L. monocytogenes observed by scanning electron microscopy

圖7 Durancin GL對(duì)單增李斯特菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)影響的透射電子顯微鏡圖Fig. 7 Effect of durancin GL on morphology and structure of L. monocytogenes observed by transmission electron microscopy

透射電子顯微鏡觀察結(jié)果可以看出，未經(jīng)處理的單增李斯特菌菌體結(jié)構(gòu)致密，內(nèi)部及細(xì)胞膜完整（圖7A）；乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL處理后，觀察到單增李斯特菌菌體結(jié)構(gòu)疏松，胞內(nèi)透亮（圖7B），說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)已外流，說(shuō)明乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL對(duì)單增李斯特菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及外部形態(tài)均造成影響。結(jié)合圖3～7結(jié)果，推斷是乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL與單增李斯特菌細(xì)胞表面受體結(jié)合后引起的某些物質(zhì)交換或者結(jié)構(gòu)變化，造成細(xì)胞通透性增加，進(jìn)而影響細(xì)胞功能與形態(tài)，導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡。

3 討 論

本研究通過(guò)將實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX/his-durAB轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E. coli Rosetta（DE3）中，在5 L發(fā)酵罐中外源表達(dá)、制備乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL。其對(duì)單增李斯特菌的MIC為（2.5±0.4）mg/L。考慮到制備后的細(xì)菌素凍存保藏，每次取用時(shí)需要重新測(cè)定其效價(jià)，為此本研究依然采用效價(jià)作為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)菌素活性標(biāo)準(zhǔn)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)制備的乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL效價(jià)為50 AU/mL時(shí)，對(duì)單增李斯特菌具有較好的抑制效果。

研究通過(guò)對(duì)乳酸菌細(xì)菌素Durancin GL抑制單增李斯特菌活性及其機(jī)制的探討，明確了Durancin GL對(duì)單增李斯特菌的抑制效果，該細(xì)菌素作用于單增李斯特菌時(shí)，OD260nm與OD280nm檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明胞內(nèi)蛋白質(zhì)類和核酸類釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。一方面，細(xì)菌素引起菌體細(xì)胞透性的增加，導(dǎo)致物質(zhì)釋放；另一方面，隨著胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，菌體細(xì)胞裂解死亡，從而加劇胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，隨之使菌體的形態(tài)（胞內(nèi)、胞外）均發(fā)生改變。杜賀超等[21]對(duì)細(xì)菌素Plantaricin 163抑制熱殺索絲菌作用機(jī)制的研究，以及劉國(guó)榮等[34]對(duì)雙歧桿菌細(xì)菌素Bifidocin A抑制大腸桿菌作用機(jī)理的研究均得到類似結(jié)論，這與已見(jiàn)報(bào)道的Ⅱa類細(xì)菌素作用機(jī)制[35-36]較為一致。

微生物污染是食品工業(yè)中最重大的安全問(wèn)題，控制及消滅微生物技術(shù)的探索一直未曾間斷。在化學(xué)防腐劑被逐漸舍棄的未來(lái)，食品級(jí)來(lái)源的乳酸菌細(xì)菌素潛力無(wú)限。更安全和更可持續(xù)發(fā)展是食品產(chǎn)業(yè)鏈對(duì)于未來(lái)發(fā)展的清晰定位，食品級(jí)乳酸菌細(xì)菌素作為防腐保鮮劑防止微生物污染、提高食品安全性是非常值得稱贊的應(yīng)用趨勢(shì)[37]。為此，深入、全面、透徹地認(rèn)知細(xì)菌素抑制目標(biāo)菌的機(jī)理機(jī)制，將為細(xì)菌素早日應(yīng)用提供重要保障。