超聲處理對大豆分離蛋白-乳清分離蛋白混合蛋白功能特性的影響

崔 強，王 琳，周國衛，董洋洋，王喜波，江連洲

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆蛋白和牛乳蛋白具有良好的功能性質、較高的營養價值和潛在的健康益處，一直是國內外的研究熱點[1-2]。近年來，通過混合蛋白得到的具有全新質感且更有利于人體健康的食品，特別是含優質植物蛋白和優質動物蛋白的雙蛋白食品越來越得到重視[3]，已被列入“十三五”食品工業發展項目中[4]。然而，用植物蛋白部分或全部替代動物蛋白可能對食品質地和感官特性產生負面影響，如Drake等[5]報道，向乳制酸奶中添加質量分數1%的大豆蛋白也會導致感官堊白度增加。因此，了解含有植物蛋白的蛋白質混合物的結構和機械性質，并厘清這些性質如何在混合食品體系中發揮作用是至關重要的[6]。

在植物蛋白中，大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是研究最多且容易獲得的植物蛋白之一，通常用作傳統動物蛋白的部分替代品。加入SPI的混合蛋白食品有營養飲料、酸奶、咖啡奶精等。在不同條件下單一體系SPI的凝膠行為、微觀結構和力學性能得到了廣泛的研究，但是有關提高混合蛋白體系穩定性的研究較少。Jissy等[7]解析了乳清蛋白與大豆蛋白混合體系在不同離子濃度下的相互作用機理；汪亞強等[8]研究發現在谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TG）交聯作用下大豆蛋白為小麥蛋白提供了更多的催化位點，有效促進TG催化交聯混合蛋白的反應，對混合蛋白凝膠性產生重要影響；Qin Xinsheng等[9]研究表明微波處理能改變混合蛋白的內部結構從而提高大豆與小麥混合蛋白凝膠性。超聲波在生物材料中的傳播會引起顆粒的壓縮和舒張，從而改變材料的物理化學性質并提高各種性能，已在食品加工中得到廣泛應用[10]。超聲波脈沖被認為是提高蛋白質溶解度和其他功能特性的最佳方法[11]。超聲波改變蛋白質功能特性主要利用其空化作用和空穴效應破壞蛋白質的四級結構，使蛋白分子結構發生改變釋放出小分子亞基或肽[12]，是一種安全有效的蛋白質處理技術。然而，目前關于超聲處理對SPI-乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）混合蛋白體系功能性質的研究鮮見報道。本實驗以SPI-WPI混合蛋白體系為對象，以SPI和WPI為對照，研究不同超聲波功率處理對混合蛋白乳化性與凝膠性的影響，并分析混合蛋白相互作用的機理，為開發新型雙蛋白食品提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI由東北農業大學食品學院實驗室自制；WPI、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）美國Sigma公司；TG 江蘇一鳴生物制品有限公司；其他試劑均為分國產析純。

1.2 儀器與設備

ULTRA-TURRAX T18 Basic型高速分散機/勻漿機德國IKA公司；TU-1800型紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；超聲波細胞破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；TA-XT2i型質構分析儀英國Stable Micro Systems公司；掃描電子顯微鏡 日本日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI-WPI混合蛋白制備

制備方法參照Qin Xinsheng等[9]的方法，分別將SPI、WPI溶于去離子水中，質量濃度為100 mg/mL。25 ℃下磁力攪拌1 h，后將兩種蛋白1∶1（V/V）混合并用分散器以10 000 r/min間歇處理5 min（處理1 min，休息1 min），繼續勻速磁力攪拌1 h。對照組分別將單一SPI、單一WPI溶于去離子水中，質量濃度為100 mg/mL。按上述條件攪拌，使其充分溶解，靜置過夜（4 ℃）。

1.3.2 超聲處理

超聲處理參考Hu Hao等[13]的方法，將制備好的SPI-WPI蛋白混合液、SPI與WPI（30 mL）放入50 mL錐形瓶中，將超聲波處理器的鈦探頭（直徑0.636 cm）插入液面距錐形瓶底部1 cm處，然后在20 kHz，輸出功率為分別為150、300、450 W下處理30 min。整個過程對錐形瓶進行冰水浴處理，使蛋白溫度控制在25～35 ℃之間。

1.3.3 乳化性及乳化穩定性的測定

參考Pearce等[14]的方法，用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.0）稀釋改性后的混合蛋白樣品至2 mg/mL，以體積比3∶1將蛋白樣品溶液與大豆油混合，并對其進行11 000 r/min、1 min的均質處理。處理后迅速吸取底部乳液100 μL，將其加入到10 mL質量分數0.1% SDS溶液中均勻混合。然后用分光光度計于500 nm波長處分別測定0 min和10 min的吸光度。其乳化活性指數和乳化穩定性指數計算分別見公式（1）、（2）。

式中：N為稀釋倍數100；T為常數2.303；L為比色池光徑（1 cm）；φ為油相體積分數（0.25%）；ρ為乳化液形成前蛋白質的質量濃度/（g/L）；A0、A10分別為乳狀液在0、10 min的吸光度。

1.3.4 紫外光譜掃描

參照Liu Yan等[15]的方法并略作改動。將超聲處理后的樣品稀釋至2 mg/mL后進行紫外光譜掃描，波長范圍250～310 nm、掃描速率100 nm/min、分辨率0.2 nm。

1.3.5 混合蛋白凝膠的制備與分析

將不同比例的混合蛋白（10 g）超聲處理后加入TG（0.3 g）[7]。在45 ℃下將樣品保持2 h，在90 ℃加熱滅酶10 min。形成的凝膠在4 ℃下冷藏過夜，后進行凝膠強度、持水性（water holding capacity，WHC）測定及掃描電子顯微鏡觀察，將樣品經冷凍干燥后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析。

1.3.6 凝膠強度測定

參考Jin等[16]的方法，采用TA-XT2i型質構儀進行測定。將混合蛋白超聲處理后置于燒杯中（25 mL），制備成凝膠。凝膠強度的測定使用p/0.5柱形探頭，探頭下行速率為1 mm/s，檢測速率為5 mm/s，后撤速率為5 mm/s，下壓深度為10 mm，觸發力為5 g，一次測定探頭下壓兩次。

1.3.7 持水性測定

將凝膠樣品置于10 mL的離心管中，離心機4 000 r/min下離心30 min，分別將離心前與離心后移除多余水分的試管稱質量[17]，WHC按式（3）計算。

式中：mt為樣品離心前與離心管的總質量/g；mr為樣品離心除水后與離心管的總質量/g。

1.3.8 SDS-PAGE分析

參考Laemmli等[18]的方法略作修改：分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為5%，樣品質量濃度為5 mg/mL，上樣前于沸水浴中加熱5 min，上樣量為8 μL，電泳電壓初始為90 V，待樣品進入分離膠時，提高電壓至120 V。電泳后用考馬斯亮藍R250溶液染色，接著用脫色液脫色4 次，脫色完全后，采用Gel Doc EZ imager型凝膠成像系統分析電泳條帶。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

將超聲處理后的樣品進行前處理，凝膠切塊，浸泡在戊二醛固定劑溶液中24 h。用0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液沖洗3 次。用體積分數為50%、70%、90%乙醇溶液各進行脫水一次，每次15 min，然后體積分數100%乙醇脫水3 次，每次15 min。用體積分數100%乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）純叔丁醇各置換一次，后冷凍干燥。然后將樣品置于掃描電子顯微鏡（5 kV）下觀察其顯微結構[19]。

1.4 數據統計分析

每次實驗做3 次平行，采用SPSS Statistics 20軟件進行數據統計分析，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 乳化性及乳化穩定性分析結果

不同超聲功率處理對SPI-WPI、SPI與WPI乳化活性與乳化穩定性的影響如圖1所示，SPI-WPI與WPI的乳化活性先升高后下降，在300 W時分別達到最大值（76.46 m2/g和71.31 m2/g），而SPI的乳化活性隨著超聲功率的升高而增加，在450 W時達到最大值59.08 m2/g。SPI-WPI與SPI的乳化穩定性先上升后下降，在300 W時分別達到最大值22.83 min和14.98 min。WPI的乳化穩定性隨著超聲功率的升高而增加，在450 W時達到最大值21.68 min。超聲的空穴效應會破壞蛋白質的結構，使蛋白質釋放出小分子亞基與肽，導致蛋白液乳化活性升高[20]。混合蛋白體系乳化活性顯著高于對照組，這可能是因為超聲處理后SPI-WPI混合蛋白質在水中進一步伸展，內部基團暴露，整體結構的舒展利于兩種蛋白之間相互作用[21]。此外，超聲處理后的混合蛋白體系構象穩定性更強，蛋白粒子減小更易解折疊及快速在油-水界面上穩定，因此乳化穩定性升高。Sui Xiaonan等[22]的研究結果與此相似，其認為超聲處理蛋白時，顆粒的破碎與重聚集同時發生，超聲功率增大到450 W后顆粒會聚集變大。隨著超聲功率的增加，兩種蛋白之間會發生重聚集，易于附聚在一起形成附聚物，可能影響疏水基團的暴露，從而降低體系乳化活性與乳化穩定性。

圖1 超聲處理對SPI-WPI乳化性的影響Fig. 1 Effect of ultrasonic treatment on emulsifying properties of SPI-WPI mixture

2.2 凝膠強度分析結果

圖2 超聲處理對凝膠強度的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic treatment on gel strength

凝膠強度是蛋白凝膠最重要的指標之一，由圖3可知，SPI與WPI的凝膠強度隨著超聲功率的升高明顯增加，SPI-WPI混合體系的凝膠強度隨著超聲功率的增加先升高后降低。這可能是因為隨著超聲功率的增加，蛋白質充分變性，蛋白之間弱鍵占主導地位，有利于混合蛋白之間二硫鍵的形成，使凝膠三維網絡結構更致密、規則。另外，TG對蛋白結構的影響是通過改變蛋白質側鏈上的疏水相互作用而實現的，形成孔洞微小且均勻的微觀凝膠網絡結構，在TG作用下有助于凝膠強度升高[23]。而當超聲功率增大到450 W時，蛋白質顆粒之間又發生重聚集，SPI-WPI凝膠強度反而下降。經過450 W超聲處理后，混合體系凝膠強度下降，可能是因為高功率超聲處理不溶性聚集體形成，SPI與WPI蛋白質之間的相互作用減弱，沒有形成更多的二硫鍵導致凝膠強度與穩定性有所下降，不溶性聚集體內部結構較為致密，在外界強應力作用下易斷裂，宏觀上表現為凝膠強度低[24]。掃描電子顯微鏡觀察結果同樣證實該點。

2.3 WHC分析結果

圖3 超聲處理對WHC的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic treatment on water-holding capacity

WHC是蛋白凝膠最重要的特性之一，由圖3可知，SPI-WPI混合體系的凝膠WHC先上升后下降。在300 W時達到最大值87.11%。SPI與WPI的凝膠WHC在450 W時達到最大值，分別為80.18%和78.96%。超聲處理顯著改善了蛋白質凝膠的WHC。Wu Wei等[25]得到相似的結果，并指出這可能是因為SPI與WPI混合體系在超聲作用下粒徑減小，促進兩種蛋白之間形成更加致密和均勻的凝膠結構，高密度孔隙結構且穩定的凝膠可以有效地固定水分并提升WHC[26]。SPI-WPI混合體系超聲處理后蛋白內部基團暴露，在TG作用下易形成二硫鍵，從而形成更加穩定的凝膠三維網絡結構。當超聲功率增加到450 W時，蛋白顆粒發生重聚集，得到疏松、不均勻的凝膠結構，一些大分子的不溶性聚集體造成凝膠孔隙增大，WHC降低[24]。

2.4 紫外光譜分析結果

超聲處理SPI-WPI、SPI與WPI產生不同紫外吸收峰的主要原因是兩種蛋白質側鏈含有不同色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基[27]。不同的紫外吸收光譜可以推斷出蛋白質分子三級構象的變化，進而分析氨基酸殘基的相對移動[28]。如圖4所示。隨著超聲功率的增加，SPI-WPI、WPI和SPI的紫外光譜強度增加，說明SPI與WPI分子內部多肽鏈部分展開，發色基團與芳雜環疏水基團更加暴露。混合蛋白體系與SPI紫外光譜強度遠大于WPI，說明超聲處理對混合蛋白與SPI作用效果更明顯，這與SDS-PAGE結果一致。另外隨著超聲功率的增加，SPI-WPI紫外最大吸收峰發生輕微的紅移，說明氨基酸環境向更加疏水的環境轉移，這是因為混合蛋白體系構象發生了改變，超聲使蛋白結構變得更加舒展。

圖4 不同超聲條件下SPI-WPI、WPI、SPI的紫外光譜圖Fig. 4 UV spectra of SPI-WPI, WPI and SPI as affected by ultrasonic power

2.5 蛋白的亞基變化

圖5 不同超聲條件下SPI-WPI、WPI、SPI的SDS-PAGEFig. 5 SDS-PAGE patterns of SPI-WPI, WPI and SPI as affected by ultrasonic power

如圖5所示，SPI的蛋白條帶主要分布在48、35 kDa與17 kDa。WPI的蛋白條帶分子質量主要分布在11 kDa。經超聲處理的SPI-WPI混合蛋白條帶主要分布在63～75、25～35、11～17 kDa以及小于11 kDa處，且隨著超聲功率的增加，條帶灰度變淺，說明超聲處理會影響大豆蛋白亞基的組成[29]，可能是因為超聲使蛋白分子解聚。一般的改性手段可以形成暫時可溶性聚集體，然后解聚成酸性和堿性多肽[1]，而高強超聲處理后在TG作用下形成了致密的凝膠網絡結構，大豆蛋白亞基在蛋白體系和SPI-WPI混合體系中變性聚集，很可能超過凝膠檢測分子質量的上限，造成條帶的缺失。與對照組相比，SPI-WPI混合體系凝膠在63～75、11～17 kDa與小于11 kDa中有新條帶出現，這表明SPI與WPI之間形成復合物。因此可以發現，超聲處理SPI-WPI混合體系蛋白質-蛋白質相互作用確實存在且有聚集體形成。

2.6 掃描電子顯微鏡觀察結果

圖6 不同超聲條件下SPI-WPI、WPI、SPI的掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 Scanning electron micrographs of SPI-WPI, WPI and SPI as affected by ultrasonic power

通過掃描電子顯微鏡可以觀察到在TG作用下不同超聲功率處理SPI-WPI混合蛋白、SPI和WPI凝膠放大1 000 倍后的微觀結構，如圖6所示，未經超聲處理的蛋白凝膠結構粗糙、表面不平整，且未形成致密的凝膠網絡結構。與之相比，經過超聲處理的蛋白凝膠結構均一、致密、空間結構分布均勻，汪亞強等[8]實驗結果與此相似。這可能是因為超聲處理后蛋白分子舒展，形成小分子物質，在TG催化作用下，兩種蛋白之間互相作用形成共價交聯。另外超聲處理后蛋白內部基團暴露于蛋白表面，更有利于混合蛋白二硫鍵的形成和疏水相互作用，形成分子內或分子間的網絡結構，從而表現出均勻致密的凝膠三維網絡結構[30]。Ringgenberg等[31]研究表明凝膠結構與蛋白的聚集體有密切的關系，高強度超聲處理后，由于重聚集作用，蛋白凝膠均勻結構受到破壞，顯得更加無序，立體感差。

3 結 論

超聲功率為300 W時，SPI-WPI混合體系乳化活性與乳化穩定性達到最高值。紫外光譜結果顯示，SPI-WPI紫外最大吸收峰發生輕微紅移，且紫外光譜強度發生改變。說明超聲處理改變了蛋白內部結構，更有利于兩種蛋白相互作用。

SPI-WPI混合蛋白300 W超聲功率處理后在TG交聯作用下，凝膠強度與WHC達到最大值，分別為1 000.93 g和87.11%。這與掃描電子顯微鏡觀察到的結果一致。兩種蛋白在超聲空化效應作用下，分子內部結構被打開，TG作用位點增加，在TG誘導的凝膠化過程中SPI和WPI分子之間形成了二硫鍵，因而形成結構致密均勻的蛋白凝膠。

SDS-PAGE結果顯示有新的條帶出現，說明超聲處理后在TG作用下SPI-WPI混合蛋白之間形成復合物。本研究為SPI-WPI混合蛋白的實際加工利用提供了理論參考。