木犀草素與葉酸對黃曲霉毒素B1致食管上皮細胞毒性及MTHFR基因高甲基化的影響

付凌萌，吳 逸，王 菁，魏 婕，王少康，孫桂菊

（東南大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，江蘇 南京 210009）

黃曲霉素素B1（aflatoxin B1，AFB1）是常見的污染農作物的真菌毒素，廣泛存在于谷物、油籽、堅果和香料中，其穩定性好，故難以在食品加熱加工過程中被降解[1]。AFB1暴露可在器官中產生諸多不良反應，國際癌癥研究機構將其劃分為一類致癌物[2]。食管作為上消化道的一部分，不可避免地會接觸AFB1這類外源性化學毒物，進而受到毒害作用。研究表明，AFB1污染食物是食管癌可能的危險因素[3-4]。

而相關研究顯示，木犀草素可抑制黃曲霉毒素的產生[5]，對黃曲霉毒素的毒性有抑制作用[6]。木犀草素（luteolin，LUT）是天然的黃酮類化合物，多以糖苷形式廣泛存在于芹菜、青椒等蔬菜以及菊花、金銀花等中草藥中[7]。Resende等[8]研究多種黃酮類化合物對不同誘變劑的抗突變性，只有木犀草素對包括黃曲霉毒素在內的多種直接或間接誘變劑的誘變作用都具有保護作用，該保護作用可能與抑制活性物質的形成并防止細胞凋亡和DNA損傷有關[9]。木犀草素還可以保護食管，有抗食管腫瘤作用[10-11]。動物實驗證實，葉酸（folic acid，FA）也經可減弱AFB1的毒害作用[12-13]。體外實驗證明葉酸可抵抗AFB1的致突變性[14]，葉酸作為人體必需的水溶性B族維生素之一，參與機體重要的生理活動，與細胞增殖、組織生長及機體發育密切相關。由于真核細胞本身不能夠合成葉酸，體外獲得充足的葉酸在機體發育的過程中于是變得尤為重要。FA也與食管癌的發生息息相關，多個研究表明FA是食管癌的保護因素[15-16]。有研究將木犀草素與葉酸綴合到超順磁性氧化鐵納米顆粒，發現其對癌細胞有抑制作用，有望成為抗癌劑[17]，由二者的抗腫瘤效應聯想到二者對AFB1共同的抗毒效應。

故考慮到木犀草素與葉酸對黃曲霉毒素均有抑制作用，且二者均可保護食管不受危害，本研究用木犀草素與葉酸單獨及聯合干預經AFB1染毒的人正常食管上皮細胞（human normal esophageal epithelial cells，HEEC），檢測細胞增殖、周期、凋亡及亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）蛋白表達水平及基因啟動子CpG區的甲基化狀態，闡明木犀草素和葉酸對AFB1的細胞毒性及表觀遺傳改變的影響，為二者協同降低AFB1對食管的毒性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常食管上皮細胞 上海中科院細胞庫；AFB1（純度≥98%） 德國Sigma公司；LUT（純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；FA（純度≥97%）、DMEM不完全高糖培養基 美國Gibco公司；雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%（質量分數）胰蛋白酶溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Hyclone公司；特級胎牛血清 美國Clark公司；二甲基亞砜 南京博全科技有限公司；細胞活性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8） 上海翊圣生物公司；細胞周期檢測試劑盒和Annexin V/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染凋亡檢測試劑盒 南京凱基生物科技發展有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、HRP標記山羊抗兔 武漢谷歌生物科技；MTHFR抗體美國Abcam公司；GAPDH 碧云天生物技術有限公司；DNA提取試劑盒、DNA染料 北京百泰克生物技術有限公司；NaHSO3美國Zymo公司；引物 美國Thermo公司；EpiTYPER? Reagent Kit 美國Agena公司。

1.2 儀器與設備

CO2恒溫培養箱 美國Napco公司；RT-6000酶標分析儀 美國Rayto公司；IX51倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司；Centrifuge小型臺式高速冷凍離心機德國Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度計美國Thermo公司；脫色搖床和電泳儀 北京六一儀器廠；垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；Inage Master VDS凝膠自動成像儀 瑞典Pharmacia公司；核酸自動提取儀北京百泰克生物技術有限公司；384-well SpectroCHIP?bioarray芯片、MassARRAY Nanodispenser點樣機、MassARRAY Analyzer 4.0質譜儀 美國Agena公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

將HEEC接種于完全培養液（含質量分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM不完全高糖培養基）中，置于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度培養箱培養。每天用倒置顯微鏡觀察細胞的生長情況，每天換液一次，傳代2～3 d一次。細胞狀態良好，處于對數生長期（融合度達80%）時即可進行實驗。

1.3.2 AFB1對HEEC活力的影響

用CCK-8法檢測AFB1染毒對細胞活力的影響，待細胞處于對數生長期時，胰酶消化離心，制成細胞懸液，計數6×104個/mL細胞接種于96 孔培養板，每孔懸液100 μL。培養24 h后分別加入AFB1濃度為0（空白對照組）、13、25、50、100、200 μmol/L的培養液染毒，每組設5 個平行孔。取3 板分別培養24、48、72 h后，每孔貼壁加入10 μL CCK-8工作液，于細胞培養箱內孵育3.5 h，終止培養，酶標儀測定450 nm波長處的OD值。細胞抑制率根據下式計算。

1.3.3 LUT與FA對AFB1染毒的HEEC的干預

取生長至對數生長期的細胞，分為7 組：空白對照組、染毒組（200 μmol/L AFB1）、LUT干預組（AFB1+LUT組：200 μmol/L AFB1+160 μmol/L LUT溶液）、FA干預組（AFB1+FA1組：200 μmol/L AFB1+20 μmol/L FA溶液；AFB1+FA2組：200 μmol/L AFB1+200 μmol/L FA溶液）、聯合干預組（AFB1+LUT+FA1組：200 μmol/L AFB1+160 μmol/L LUT+20 μmol/L FA；AFB1+LUT+FA2組：200 μmol/L AFB1+160 μmol/L LUT+200 μmol/L FA的溶液），各組HEEC處理24 h后檢測各項指標，每組重復測3 次。

1.3.3.1 CCK-8法檢測細胞活力

同1.2.2節配成細胞懸液后計數6×104個/mL細胞接種于96 孔培養板，培養24 h后加入上述7 組培養液，每組設5 個平行孔。取3 板分別培養24 h后，后具體操作同1.2.2節。

1.3.3.2 流式細胞術檢測細胞周期

各組處理細胞24 h后收集細胞，PBS洗滌2 遍（2 000 r/min離心5min）并調整細胞濃度為1×106個/mL，留少量上清液與細胞沉淀混勻，滴加體積分數70%乙醇迅速振搖混勻，于4 ℃固定過夜。2 000 r/min離心細胞5 min，吸棄上清液，用1 mL PBS重懸細胞，再離心洗滌細胞一次，吸棄上清液，加入100 μL RNase A 37 ℃水浴 30 min，再加入400 μL PI染色混勻，置暗處30 min后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

各處理組培養24 h后用不含EDTA的胰酶消化收集不同處理的細胞。PBS洗滌2 遍（2 000 r/min離心5 min）并調整細胞濃度為1×105個/mL，加入500 μL的結合緩沖液懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI混勻，置暗處15 min后用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.3.3.4 Western Blot檢測MTHFR蛋白表達情況

參照Li Chao等[18]的方法，略作改動。各處理組培養24 h后，PBS沖洗細胞3 次，加裂解液裂解細胞3～5 min，收集冰浴30 min，期間反復吹打以確保細胞裂解完全。4 ℃ 12 000×g離心5 min，吸取上清液，用BCA法測定總蛋白濃度，然后配制8%（質量分數，下同）分離膠及5%濃縮膠，上樣后進行SDS-PAGE分離、濕轉法轉膜過夜，用封閉液（5% BCA、TPBS配制）封閉，室溫下脫色搖床緩慢搖動2 h。MTHFR抗體（1∶1 000）4 ℃脫色搖床緩慢孵育過夜。次日TBST清洗聚偏氟乙烯（poly(vinylidene fluoride)，PVDF）膜3 次，每次10 min。加HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶3 000），室溫下脫色搖床孵育30 min后，用TBST清洗PVDF膜3 次，每次10 min，配制化學發光混合液，浸沒PVDF膜后適時曝光，條帶采用Image J軟件進行半定量灰度值分析。

1.3.3.5 MassARRAY甲基化檢測HEEC的MTHFR基因啟動子區甲基化情況

參照Zhu Yunyun等[19]的方法，略作改動。通過NCBI獲得MTHFR基因序列及其啟動子，利用CpG島在線預測網站http∶//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/預測其基因啟動子區潛在的CpG島，該段序列相對于轉錄起始位點的位置為4 812～5 405 bp，長度為594 bp，共33 個單位信息，覆蓋49 個位點（圖1）。用EpiDesigner軟件進行引物設計，引物（5’端：AGGAAGAGAGGGAAGTGGTAGTTATTGGGAGTTATATT；3’端：CAGTAATA CGACTCACTATAGGGAGAAGGCTACAACACAAAAACCCCCTACAC）（表1）。用DNA提取試劑盒提取各處理組細胞DNA，用NaHSO3處理待檢測DNA樣品。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法擴增目的基因片段，擴增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，45 個循環；72 ℃3 min。蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）混合液去除反應體系中游離的核苷酸，將PCR/SAP反應產物混合并在37 ℃孵育，進行3 h的體外轉錄和RNase A消化，隨即進行芯片點樣，用MALDI-TOF分析點樣后的芯片，最后用EpiTYPERTM軟件對原始數據進行評估和分析。

圖1 MTHFR基因的CpG位點Fig. 1 CpG sites of MTHFR gene

表1 MTHFR引物信息Table 1 Information about primers used for MTHFR amplification

1.4 數據統計分析

數據統計分析采用SPSS 19.0軟件，多組間數據比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用Dunnett's t檢驗，P＜0.05為顯著性差異水準。

2 結果與分析

2.1 AFB1對HEEC活力的影響

圖2 AFB1作用于HEEC不同時間的抑制率Fig. 2 Inhibition rates of AFB1 against HEEC at different culture times

由圖2可知，HEEC經不同濃度的AFB1分別處理24、48 h和72 h后，細胞活力均被抑制。1～200 μmol/L范圍內，細胞抑制率隨著AFB1濃度的增加而升高，100、200 μmol/L AFB1處理組細胞抑制率極顯著高于空白對照組（P＜0.01），AFB1可以抑制HEEC的增殖，抑制率呈劑量依賴性升高，與Parveen等[20]研究AFB1對犬腎細胞毒性作用結果一致。同一濃度不同處理時間，AFB1低濃度（13、25、50 μmol/L）時抑制率與時間成反比，可能是細胞自我應激保護作用導致的[21]。而100、200 μmol/L AFB1處理組細胞的抑制率則隨著作用時間的延長而升高。綜合考慮劑量及處理時間對AFB1的影響，選擇200 μmol/L建立細胞損傷模型。

2.2 LUT及FA對AFB1染毒的HEEC的影響

2.2.1 LUT及FA對AFB1染毒細胞增殖的影響

圖3 LUT及FA對AFB1染毒HEEC增殖抑制的影響Fig. 3 Effects of LUT and FA on proliferation inhibition of AFB1-treated cells

如圖3所示，AFB1+LUT、AFB1+LUT+FA1及AFB1+LUT+FA2組細胞抑制率顯著低于染毒組（P＜0.05），而單獨使用FA干預（AFB1+FA1組、AFB1+FA2組），效果不顯著（P＞0.05）。AFB1+LUT組與AFB1+LUT+FA1組及AFB1+LUT+FA2組細胞抑制率差異無統計學意義（P＞0.05）。在用LUT及FA干預后，含有LUT的組別抑制率均明顯降低，提示LUT降低了AFB1對HEEC增殖的抑制，對AFB1抑制增殖有保護作用。

2.2.2 LUT及FA對AFB1染毒的HEEC細胞周期的影響

圖4 LUT及FA對AFB1染毒的HEEC細胞周期的影響Fig. 4 Effects of LUT and FA on cell cycle of HEECs with AFB1 exposure

由圖4a可知，AFB1可誘導HEEC周期發生改變，G0/G1期細胞比例升高（P＜0.05），S期細胞比例降低（P＜0.05），說明AFB1將HEEC阻滯于G0/G1期，抑制細胞分裂增殖，與Liu Caixia等[22]的研究結果一致。由圖4b可知，與染毒組相比，LUT干預組、聯合干預組G0/G1期細胞比例較染毒組顯著降低（P＜0.05），S期的細胞所占比例顯著升高（P＜0.05），減少了AFB1對細胞G0/G1期的阻滯作用。AFB1+LUT組與AFB1+LUT+FA1組及AFB1+LUT+FA2組各細胞周期占比差異無統計學意義（P＞0.05）。說明LUT可減少G0/G1期的細胞，增加S期的細胞，減輕AFB1對細胞周期的阻滯作用。

2.2.3 LUT及FA對AFB1染毒HEEC細胞凋亡的影響

圖5 LUT及FA對AFB1染毒的HEEC細胞凋亡的影響Fig. 5 Effects of LUT and FA on HEEC apoptosis induced by AFB1

由圖5a可知，分析實驗結果發現，染毒組細胞凋亡率顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明AFB1促進HEEC凋亡。由圖5b可知，LUT干預組、聯合干預組細胞凋亡率雖然高于空白對照組（P＜0.05），但顯著低于AFB1染毒組（P＜0.05），說明LUT及FA抑制了AFB1的促凋亡作用。雖然FA單獨干預后的細胞凋亡率與染毒組無顯著差異，但聯合LUT后顯著抑制了AFB1的促凋亡作用，且該聯合效應強于LUT單獨干預組（P＜0.05）。

2.2.4 Western Blot檢測MTHFR蛋白表達結果

由圖6a可知，AFB1染毒可以上調HEEC的MTHFR蛋白的表達（P＜0.05）。經LUT干預相比染毒組可下調細胞MTHFR蛋白表達（P＜0.05）。由圖6b可知，用FA進行干預，發現FA增強染毒細胞MTHFR蛋白的表達，20 μmol/L的FA干預能顯著上調MTHFR蛋白表達（P＜0.05）；LUT聯用不同濃度的FA干預能顯著減弱AFB1對MTHFR蛋白表達的影響，作用強于LUT干預組（P＜0.05）。

圖6 LUT及FA對經AFB1染毒的HEEC的MTHFR蛋白表達影響Fig. 6 Effects of LUT and FA on the expression of MTHFR protein in AFB1-induced HEECs

2.2.5 MassARRAY甲基化檢測HEEC的MTHFR基因啟動子區甲基化情況

圖7 MassARRAY甲基化檢測結果Fig. 7 Results of MassARRAY methylation

表2 MassARRAY甲基化水平定量結果（n=3）Table 2 Quantitative results of MassARRAY methylation level (n= 3)

圖8 甲基化水平升高的CpG單位的MassARRAY甲基化檢測結果Fig. 8 Results of MassARRAY methylation for CpG units with elevated methylation levels

由表2及圖7、8可知，本次共獲得了29 個有效單位信息，包括43 個位點。這些CpG單位的甲基化水平范圍是0.00～74.00%，經統計分析，除CpG_6.7、CpG_16、CpG_35、CpG_42位點外，其余位點甲基化水平在染毒組和空白對照組中的差異無統計學意義（P＞0.05）。分析這幾個位點的甲基化水平，結果顯示染毒組甲基化水平顯著高于空白對照組（P＜0.05）。比較CpG_6.7位點的甲基化水平，染毒組細胞甲基化水平顯著高于空白對照組（P＜0.05），200 μmol/L FA組的甲基化水平顯著低于染毒組（P＜0.05）；對于CpG_35位點，發現LUT組及LUT聯用200 μmol/L FA干預組的甲基化水平顯著低于染毒組（P＜0.05），與空白對照組接近（P＞0.05）；對于CpG_16、CpG_42位點，各干預組干預效果顯著（P＜0.05）。分析各組4 個位點總的甲基化水平，染毒組細胞甲基化水平顯著高于空白對照組（P＜0.05），各干預組甲基化水平均相對染毒組降低（P＜0.01）。

3 討 論

AFB1具有急性毒性、慢性毒性及蓄積性致癌作用[23]，伊朗一項研究發現AFB1污染是食管癌可能的危險因素，食管癌高風險區小麥粉中AFB1含量為（0.80±1.14） ng/g，顯著高于低風險的（0.26±0.31）ng/g（P＝0.003）[3]。同樣的，在對江蘇淮安食管癌高發區和山東桓臺食管癌低發區進行的調查研究發現，食管癌高發區淮安地區玉米樣品中AFB1含量為13.5 μg/kg，遠高于食管癌低發區桓臺的1.3 μg/kg（P＜0.05），而根據食物頻率法調查AFB1的膳食攝入量，淮安地區為1.723（0.242～49.772）μg/kg，桓臺為0.397（0.267～1.218）μg/kg，食管癌高發區的外暴露量遠高于低發區（P＜0.05），說明食管癌的發生與AFB1有關[4]。因此，探討AFB1對食管細胞的毒性作用對AFB1毒性的防控有重要意義。

多個研究表明由于細胞種類不同，AFB1對細胞周期的影響體現在不同階段，導致HepG2細胞停滯于S期和G2期[24]，增加人支氣管上皮細胞中S期細胞數量[25]。細胞周期的阻滯導致細胞增殖的抑制[26]，故本研究中AFB1通過將細胞周期阻滯于G0/G1期，進而抑制細胞增殖。而LUT的干預可減少G0/G1期的細胞，增加S期的細胞，減輕AFB1對周期的阻滯作用，從而相對增加細胞增殖。

細胞凋亡是細胞的程序性死亡，它的啟動可通過兩種基本途徑：外在和內在途徑。外在途徑由死亡受體啟動，內在途徑由線粒體或溶酶體透化介導[27]。AFB1誘導細胞凋亡可能與線粒體功能受損有關[28-29]。有研究表明，AFB1通過誘導氧化應激，減少細胞線粒體含量和增強Bax、caspase-3、p53表達導致精子細胞線粒體依賴性細胞凋亡[30]。而也有研究顯示，LUT可通過抑制細胞凋亡等作用減輕乙酰氨基酚誘導的 L02 肝細胞損傷[31]。本實驗中AFB1增強了HEEC的凋亡，LUT以及LUT聯合FA可以減少這種凋亡，且兩者聯合作用強于LUT單獨作用。表明LUT及二者聯合可以通過抑制細胞凋亡保護HEEC。

MTHFR是葉酸代謝途徑中的關鍵酶[32]，它將5,10-亞甲基四氫葉酸不可逆地催化轉化為5-甲基四氫葉酸，而后者又是循環葉酸的主要形式，它將甲硫氨酸轉換為S-腺苷甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸用于細胞內各的甲基化反應的供體，特別是DNA甲基化[33]。而膳食AFB1暴露可能導致DNA甲基化的改變[34]。DNA甲基化在基因調控中起重要作用，如參與基因表達，影響染色質構型和DNA的結構穩定性、轉錄因子與其他蛋白質的結合，導致X染色體失活，致衰老和致癌作用[35]。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，其包括在CpG二核苷酸的胞嘧啶中添加甲基。這些CpG二核苷酸主要位于CpG島上，其主要聚集在蛋白質編碼基因的啟動子區域周圍[36]。有研究表明MTHFR基因與AFB1在癌癥形成過程中可能有著密切聯系[37]，且其甲基化與食管腫瘤發生密切相關[38]，故本研究在AFB1對人食管上皮細胞的染毒及LUT、FA的干預實驗中檢測了MTHFR基因啟動子CpG區的甲基化狀態，以闡明AFB1所致的表觀遺傳改變以及LUT、FA對該表觀遺傳改變的影響。

MassARRAY是近年來新出現的DNA甲基化定量檢測方法。它比亞硫酸氫鹽測序PCR（BSP）能更有效地反映低甲基化區域的真實甲基化水平，它可以檢測到低至5%的甲基化水平[39]，故而能更準確的定量甲基化水平。本研究采用該方法檢測了MTHFR啟動子區甲基化水平，發現經AFB1染毒后多個位點甲基化水平高于空白對照組，而經LUT及FA干預后，甲基化水平有所下降。甲基化水平的升高與諸多疾病的發生有關，特別是癌癥。Xia Fada等[40]的研究13 種癌組織miR-204啟動子區的甲基化水平，發現13 種癌組織中該基因甲基化率均高于正常組織。MTHFR甲基化水平與哈薩克族食管癌的相關性研究中，病例組MTHFR基因的甲基化率高于空白對照組（P＜0.05），提示MTHFR基因的甲基化與食管癌的發生有密切的關系[41]。本研究用AFB1染毒HEEC，MTHFR甲基化升高，表明MTHFR在AFB1對食管的作用中起到了一定的作用。DNA甲基化后，基因序列保持不變，但不同的甲基化表達水平可能會起到不同的作用。這種修飾反應經常發生在富含CG序列的二核苷酸中，其結構與支持染色體，胚胎發育，細胞記憶和衰老的結構密切相關。研究DNA甲基化在腫瘤風險的預防，早期診斷和預后發展的臨床評價有重要的指導作用[42]。本研究FA雖在周期凋亡中未對AFB1染毒產生的相關變化，在MTHFR高甲基化上和LUT體現了同樣的干預作用，且聯合作用較強，體現了二者在AFB1的毒性作用中的抑制作用，一定程度上阻止了食管毒性向癌癥的轉化。

本研究結果顯示AFB1上調了MTHFR的蛋白表達，LUT可以下調MTHFR蛋白的上調，而FA則是相反的作用，和LUT聯合后該相反的作用消失。研究表明，MTHFR基因多態性可以影響MTHFR的活性及穩定性，進而影響葉酸的正常代謝[41]。參考該研究，推測MTHFR的高甲基化影響蛋白表達，甲基化水平升高的MTHFR蛋白導致葉酸代謝紊亂，從而導致葉酸干預的反向作用，而聯用LUT則糾正了其對葉酸代謝的影響，對MTHFR蛋白的上調不再是繼續上調而是下調，使葉酸的正向干預作用得以顯現。而Kim等[43]的研究也證明葉酸有雙重調節作用。

綜上，本研究發現AFB1抑制HEEC的增殖，阻滯其周期，促進凋亡，LUT對這些毒性作用有相應的改善；在AFB1可引起MTHFR高甲基化，LUT與FA及二者聯合均可降低升高的甲基化水平，對該表觀遺傳改變具有調節作用，體現了抗AFB1毒性作用；MTHFR高甲基化的同時，蛋白表達水平也有所上調，LUT可以減少上調，改善AFB1對MTHFR蛋白表達的影響，而FA體現的是反向調節作用，考慮是MTHFR基因高甲基化導致的葉酸代謝紊亂，對其確認及機制的探討有待進一步研究。