平菇多糖對四氯化碳誘導雄性昆明種小鼠肝損傷的保護作用

張 揚，朱彩平，林楊楠，曹鈺林，張一凡，方 豪

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西省食品與健康科學國際聯合研究中心，陜西 西安 710119）

肝臟是脊椎動物體內的重要代謝器官，發揮著去除毒素、調節免疫、儲存糖原、合成分泌性蛋白質等作用。肝損傷主要指肝細胞在乙醇、病毒、藥物、毒物等因素的誘導下引發的病變。長期肝損傷不可修復，并會導致肝臟代償性修復，即形成肝纖維化，可進一步發展為肝硬化或者肝癌[1-2]。臨床上的多種藥物可以引起肝損傷，如抗菌藥物、中樞抑制藥、抗腫瘤藥等[3]。因此，從天然產物中提取保肝物質越來越引起人們的重視。

多糖是一種天然的高分子聚合物，廣泛地存在于動植物和微生物中[4-5]。研究表明，多糖具有潛在的抗氧化[6-7]、抗癌[8]、抗衰老[9]及免疫調節[10-11]等多種功能，被廣泛應用于食品醫藥業。平菇是我國最常見的食用菌類之一，因味道鮮美而受到廣泛喜愛，含有豐富的碳水化合物、蛋白質、礦物質、維生素等營養素[12-13]。研究表明，平菇富含多糖，且平菇多糖（Pleurotus ostreatuspolysaccharide，POP）具有良好的抗氧化[14]、增強免疫力[15]、抗腫瘤[16]等功效。然而，POP的保肝作用尚鮮見報道。本實驗擬研究POP對四氯化碳（CCl4）誘導雄性昆明種小鼠肝損傷的保護作用，為開發POP保肝產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性昆明種小鼠，體質量（20±2）g，購自西安交通大學實驗動物中心，生產許可證號：SYXK（陜）2018-001。

新鮮平菇 陜西省西安市長安區大居安蔬菜批發市場。

無水乙醇、4%多聚甲醛溶液 西安晶博生物科技有限公司；谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

分析天平 北京BSISL有限公司；全波長酶標儀美國賽默飛世爾公司；勻漿機 美國Pro Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 POP的提取

新鮮平菇烘干、粉碎，得到平菇干粉，其水分質量分數為5.04%。稱取25 g平菇干粉，加入1.0 L蒸餾水，充分攪拌后置于95 ℃水浴提取4 h。冷卻后用紗布濾去不溶物，溶液以4 000 r/min離心20 min，取上清液，蒸發濃縮，加入4 倍體積的體積分數85%乙醇溶液沉淀8 h，抽濾得沉淀，再將沉淀復溶于一定體積蒸餾水中，用8 000～14 000 Da透析袋透析72 h，冷凍干燥后得到POP。

1.3.2 動物分組與處理

48 只雄性昆明種小鼠飼養于（22±2）℃、12 h光照/12 h黑暗室內，自由飲水進食。適應性飼養一周后將小鼠隨機分為6 組，分別為空白對照組、模型組、陽性對照組、POP低/中/高劑量組（POP-L/M/H），每組8 只。空白對照組與模型組每天用0.2 mL生理鹽水（0.1 mL/10 g）進行灌胃；陽性對照組用50 mg/（kg·d）的VC進行灌胃[17]；POP-L/M/H組分別用100、200、400 mg/（kg·d）的POP進行灌胃，連續給藥28 d。在第22、23天對除空白組外的小鼠進行肝損傷造模，腹腔注射質量分數0.2% CCl4-花生油溶液，劑量為10 mL/kg mb，空白組注射花生油。在第28天的最后一次灌胃結束以后，所有小鼠禁食不禁水12 h，記錄體質量，頸椎脫臼處死。

1.3.3 血清的制備

小鼠處死后立即眼球取血，將血液收集于1.0 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，制得血清立即存放于-20 ℃冰箱，待測。

1.3.4 血清指標的測定

按照試劑盒操作說明測定血清中AST、ALT、ALP活力及TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度。

1.3.5 肝臟組織指標的測定

小鼠處死后立即解剖取出肝臟組織，稱質量并記錄，按下式計算小鼠肝臟指數。隨后精確稱取0.5 g肝臟組織，加入無菌生理鹽水制成質量分數10%肝組織勻漿。將制備好的肝勻漿5 000 r/min離心10 min，取上清液并稀釋至適宜濃度，按試劑盒操作說明測定肝臟中T-AOC、MDA濃度及T-SOD、CAT、GSH-Px活力。

式中：m1為小鼠肝臟質量/g；m2為小鼠體質量/g。

1.3.6 肝臟組織病理學檢測

取小塊肝臟組織，置于4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色[18]。制成切片后用光學顯微鏡觀察肝細胞病變程度。

1.4 數據統計與分析

采用Excel軟件作圖，SPSS軟件對實驗數據進行處理和分析。實驗數據以平均值±標準差表示。組間差異采用t檢驗，P＜0.05表示數據差異顯著。

2 結果與分析

2.1 POP對小鼠體質量的影響

POP對小鼠平均體質量的影響如圖1所示，第1～3周，各組小鼠在自然生長狀態下，平均體質量呈上升趨勢，且POP-H組小鼠平均體質量略高于其他各組小鼠。在第22、23天腹腔注射CCl4后，除空白組小鼠體質量繼續增加外，其他組小鼠體質量均降低。另外，POP-L/M/H組的小鼠體質量下降程度隨著POP劑量的增加而減少。可以看出，POP能夠抑制CCl4引起的小鼠體質量下降。

圖1 POP對小鼠平均體質量的影響Fig. 1 Effect of POP on average body mass in mice

2.2 POP對小鼠肝臟指數的影響

表1 POP對CCl4誘導肝損傷小鼠肝臟指數的影響Table 1 Effect of POP on hepatic index in mice with CCl4-induced liver injury

CCl4是一種被廣泛用來誘導實驗動物肝損傷的化學藥物，CCl4進入機體可以產生高反應活性的三氯甲基自由基，從而引發肝臟內脂質過氧化反應并導致肝小葉中心壞死，進而引發肝壞死、肝纖維化、肝硬化等疾病[19]。同時CCl4作為一種典型的肝臟毒物，能夠破壞肝細胞內蛋白質的合成及肝細胞膜結構和功能，使細胞膜的通透性增加并失去對大分子物質的阻礙能力，生物體內的大分子物質會回流入細胞膜內，從而導致肝細胞腫脹壞死[20]，最終表現為肝臟體積腫脹、質量增加。從表1可以看出，模型組小鼠肝臟指數極顯著高于空白對照組小鼠（P＜0.01），說明模型組小鼠肝臟出現嚴重腫脹，造模成功。同時，POP-H組小鼠肝臟指數顯著低于模型組（P＜0.05），且POP-H組小鼠極顯著低于模型組（P＜0.01），說明POP對CCl4引起的肝臟腫脹有抑制效果，且與劑量呈正相關。

2.3 POP對肝損傷小鼠血清指標的影響

肝臟微粒體細胞色素P-450會激活進入肝臟內的CCl4，產生三氯甲基自由基，三氯甲基自由基會破壞細胞膜上的磷脂分子，使細胞膜完整性遭到破壞，引起細胞內各種酶的滲漏[21]。ALT和AST由于肝細胞膜的通透性被隔絕于肝細胞線粒體和細胞漿中（正常肝細胞ALT和AST不會滲漏[22]），因此血清中ALT和AST很少。當肝細胞受到自由基攻擊或壞死時，細胞中的ALT和AST大量外泄，血清中的ALT和AST活力顯著提高，標志著肝細胞遭到破壞，是鑒定肝損傷的重要指標。ALP正常情況下主要來自于骨骼，由膽道系統排泄，當肝臟受到損傷時，ALP會反流入血液從而引起血清中的ALP活力顯著提高[23]。

表2 POP對CCl4誘導肝損傷小鼠血清中ALT、AST和ALP活力的影響Table 2 Effect of POP on ALT, AST and ALP levels in serum of mice with CCl4-induced liver injury

從表2可以看出，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST及ALP活力均極顯著升高（P＜0.01），說明小鼠肝細胞膜通透性增加，肝細胞酶發生滲漏，標志著肝細胞受到破壞，造模成功。POP-M/H組小鼠血清中ALT、AST及ALP活力相比模型組極顯著降低（P＜0.01），說明POP能夠保護由CCl4引起的小鼠肝損傷。

2.4 POP對肝損傷小鼠血脂水平的影響

動脈粥樣硬化和心血管疾病通常由血清中TC、TG和LDL-C濃度的增高以及HDL-C濃度的降低引起[24]。CCl4產生的三氯甲基自由基及一系列活性氧與蛋白質共價結合導致蛋白合成障礙，影響脂質分解代謝，使TG大量積累。

表3 POP對肝損傷小鼠血清血脂水平的影響Table 3 Effect of POP on serum lipid levels in mice with CCl4-induced liver injury

由表3可知，與空白對照組相比，模型組的TC、TG和LDL-C濃度極顯著提高（P＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，POP-L/M/H組小鼠血脂水平均出現明顯下降，其中POP-M組血清TC濃度顯著降低（P＜0.05），TG及LDL-C濃度均極顯著降低（P＜0.01）；POP-H組小鼠血清血脂濃度（除HDL-C外）均極顯著降低（P＜0.01），且均接近空白對照組小鼠，說明POP能夠有效降低血清中TC、TG和LDL-C濃度。

HDL-C是脂蛋白的一種，可運輸機體組織內的膽固醇到肝臟，從而抑制心血管疾病的發生，低濃度的HDL-C有誘發動脈粥樣硬化的風險。由表3可知，模型組小鼠血清中HDL-C濃度相比空白對照組極顯著降低（P＜0.01），而POP-M/H組的小鼠血清中HDL-C濃度相比模型組極顯著提高（P＜0.01），這一現象說明POP能夠改善CCl4引起的小鼠HDL-C濃度下降，維持血液中TC、TG、LDL-C和HDL-C濃度的平衡，從而預防或緩解動脈粥樣硬化和心血管疾病的發生。

2.5 POP對肝損傷小鼠肝臟酶活力的影響

MDA是脂質過氧化反應的終產物，是一種能對人體造成損傷的損害因子，通常被用來鑒別一系列的組織損傷，它的含量能反映體內氧化反應的程度[25]，因此本實驗以MDA濃度反映機體內脂質過氧化的程度；SOD是生物體內重要的活性物質，能夠清除機體內的有害物質如超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，間接地反映了機體清除體內氧自由基的能力[26]；T-AOC與機體健康存在密切聯系，能反映機體防御體系抗氧化能力的強弱，這種防御體系主要通過清除機體內的活性氧以阻止脂質過氧化反應，阻斷過氧化鏈[27]；CAT參與機體內活性氧的代謝，促進機體清除自由基以阻止細胞膜受到損傷[28]；GSH-Px能夠催化分解機體內產生的，通常與SOD協同作用，SOD首先催化超氧陰離子自由基生成O2和H2O2，生成的H2O2在GSH-Px的催化下轉換成H2O和O2[30]。因此，小鼠肝臟內的T-AOC及MDA、T-SOD、CAT、GSH-Px水平可以反映CCl4引起的小鼠肝損傷程度。

表4 POP對CCl4誘導肝損傷小鼠肝組織T-AOC及MDA、T-SOD、CAT、GSH-Px水平的影響Table 4 Effect of POP on MDA, T-SOD, T-AOC, CAT and GSH-Px levels in liver tissue of mice with CCl4-induced liver injury

從表4可知，模型組小鼠肝組織MDA濃度相比空白對照組極顯著提高（P＜0.01），說明CCl4對小鼠肝臟造成損傷；同時，模型組小鼠肝組織T-SOD、CAT、GSH-Px活力及T-AOC極顯著降低（P＜0.01），說明小鼠肝臟酶活力受到嚴重破壞，造模成功。POP-L/M/H組小鼠肝臟酶活力相比模型組均提高，MDA濃度降低，其中POP-M組小鼠肝組織MDA濃度極顯著降低（P＜0.01）、T-SOD、T-AOC、GSH-Px水平極顯著提高（P＜0.01），而POP-H組小鼠肝組織酶活力相比模型組均極顯著提高（P＜0.01）。

2.6 POP對肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

顯微鏡下觀察可以發現空白對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞排列整齊，肝竇正常，細胞核結構清晰；模型組小鼠肝細胞變性明顯，可見多處細胞壞死，且細胞有浸潤現象，細胞核萎縮，出現固縮溶解現象（圖2）。相比模型組小鼠，POP-L/M組小鼠肝組織細胞壞死雖然減少，但細胞浸潤現象依然存在；POP-H組小鼠肝組織相比模型組小鼠病理損傷程度明顯減輕，肝細胞排列比較整齊，細胞核較模型組圓潤，壞死區域明顯減少，炎性細胞浸潤程度也明顯降低。

圖2 CCl4誘導肝損傷小鼠肝組織病理學觀察結果（400×）Fig. 2 Histopathological examination of CCl4-induced liver injury in mice (400 ×)

3 結 論

相比模型組小鼠，POP-H組（400 mg/（kg·d））小鼠體質量降低程度有所減緩，肝臟腫脹程度減輕，肝臟病理學結構有明顯改善，血清中AST、ALT、ALP活力極顯著降低（P＜0.01），TC、TG和LDL-C濃度極顯著降低（P＜0.01），HDL-C濃度回升，說明POP有助于預防動脈粥樣硬化和心血管疾病；同時，MDA濃度極顯著降低（P＜0.01），T-SOD、T-AOC、CAT和GSH-Px水平極顯著提高（P＜0.01），說明POP能夠抑制CCl4引起的肝臟內脂質過氧化反應，提高肝臟內抗氧化酶活力，保護小鼠肝臟。肝臟病理學研究結果也表明，POP可以明顯減輕小鼠肝細胞所受的病理損傷。綜上，POP對CCl4引起的小鼠肝損傷具有明顯的保護作用，在保健食品和藥物治療方面有廣闊的發展空間。