沙蔥總黃酮水洗組分的體外抗炎活性

王翠芳，王特日格樂，杜紅喜，張秀媛，丹 妮，薩如麗，敖長金

（內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

沙蔥（Allium mongolicum Regel）屬百合目、百合科、蔥屬類植物根莖組，是一種具有抗寒、抗旱、生命力較頑強的植物[1]。主要分布于我國新疆、甘肅、內蒙古等地區的荒漠草原和沙地。近年來，沙蔥及其提取物因具有消除羊肉中的膻味、提高機體免疫力、改善羊肉品質等諸多優點，常被作為天然綠色飼料添加劑應用于養羊業[2]。黃酮廣泛存在于植物中，從1938年Kumar等首次在桔皮中發現黃酮類化合物以來，已有4 000余種黃酮類化合物被相繼發現，并成為學者們研究的熱點[3]。植物來源的黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[4]。本課題組前期研究表明，沙蔥黃酮是沙蔥重要的活性成分之一，具有抗菌[5]、改善綿羊瘤胃內環境[6]、抗氧化[7]等多種功效。目前，關于沙蔥黃酮調節機體免疫及抗氧化方面的相關研究較多，但對其抗炎活性研究甚少。所以，本實驗應用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導小鼠腹腔巨噬細胞建立炎癥模型，探討沙蔥總黃酮水洗組分對正常及LPS誘導過度激活的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應的保護作用，以期為進一步研究沙蔥黃酮抗炎相關分子機制及其在動物生產中的實際應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級雄性C57BL/6小鼠，8～10 周齡，體質量（20±2）g，購自內蒙古醫科大學實驗動物中心（生產許可證號：SCXK（蒙）2015-0001）。小鼠6 只/籠，于（20±1）℃、相對濕度（55±5）%及12 h晝夜交替的動物房中飼養，均自由采食和飲水。

沙蔥粉 阿拉善盟浩海生物科技有限公司。

RPMI-1640基礎培養基、青鏈霉素混合液 美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液 美國HyClone公司；胎牛血清 上海ExCell Bio公司；LPS（Escherichia coli O55∶B5） 美國Sigma公司；液體硫乙醇酸鹽培養基美國BD公司；CCK-8試劑盒 日本同仁化學研究所；NO測定試劑盒 美國Promega公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒美國BioLegend公司；總RNA小量制備試劑盒 美國Axygen公司；SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒、Prime ScriptTMRT Reagent Kit 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發儀 德國艾卡（IKA）儀器設備有限公司；Synergy HT型多功能酶標儀 美國Bio-Tek公司；生物安全柜、恒溫培養箱、低溫高速離心機 美國Thermo Fisher公司；LightCycler?480實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀瑞士羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 沙蔥總黃酮水洗組分的制備

沙蔥粉于室溫保存，依據本課題組前期報道的沙蔥總黃酮超聲波提取法的最佳提取工藝（體積分數75%乙醇溶液、料液比1∶30、提取溫度40 ℃、提取時間15 min）制備沙蔥總黃酮，其主要成分有3',4'-環氧基-7-O-5甲氧基黃酮醇、7-O-5,4'-二甲氧基-3'-羥基黃酮、金合歡素、蘆丁、異槲皮苷及木犀草素-5'-O-糖葡萄糖-4-羥基苯丙酸，以蒸餾水為流動相，采用聚酰胺柱層析法對沙蔥總黃酮進行分離純化，于真空冷凍干燥得到沙蔥總黃酮水洗組分（water eluate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel，wAMF）[5]。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬細胞的制備及培養

依據文獻[8-10]所報道的方法對小鼠腹腔巨噬細胞進行分離、提取及純化，將獲得的小鼠腹腔巨噬細胞置于含質量分數10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）的完全培養基中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，用于后續研究。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖活力

應用CCK-8法檢測沙蔥總黃酮水洗組分對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活力的影響，篩選有效且安全的沙蔥總黃酮水洗組分質量濃度。調整細胞濃度，按4×104cells/孔將細胞接種于96 孔細胞培養板中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養2～4 h進行貼壁，棄掉孔內培養基，將細胞分為對照組（添加含終質量分數0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的完全培養基）[11-12]、不同質量濃度沙蔥總黃酮水洗組分處理組（添加含有終質量濃度50、100、200、400、800 μg/mL沙蔥總黃酮水洗組分的完全培養基），以無細胞只添加完全培養基為空白，于5% CO2、37 ℃繼續培養24 h，棄去各孔培養基，加入含有質量分數10% CCK-8溶液的完全培養基，孵育2 h，應用全自動酶標儀檢測450 nm波長處各孔的OD值，記為OD450nm。細胞增殖活力按下式計算。

1.3.4 實驗分組

基于1.3.3節篩選出的沙蔥總黃酮水洗組分安全質量濃度，將細胞分為空白對照組（添加含終質量分數0.1% DMSO的完全培養基）、LPS應激模型組（1 μg/mL LPS）及不同質量濃度沙蔥總黃酮水洗組分預處理組（各組先加入100、200、400 μg/mL沙蔥總黃酮水洗組分預處理細胞1 h，培養結束后，各組再分別添加終質量濃度為1 μg/mL LPS共同培養細胞），各組加入LPS后的處理時間根據后續不同實驗所需時間進行調整。

1.3.5 Griess法檢測小鼠腹腔巨噬細胞NO的生成量

實驗分組同1.3.4節，細胞經各質量濃度沙蔥總黃酮水洗組分處理1 h后，繼續與LPS共同處理24 h，收集各處理組培養上清液。向待測培養上清液中加入等體積的Griess A（1%（質量分數，下同）磺胺、5%磷酸）及Griess B（N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽）試劑進行室溫避光孵育，測定各孔520 nm波長處吸光度，根據繪制的標準曲線計算各處理組NO濃度。

1.3.6 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的生成量

實驗分組同1.3.4節，各質量濃度沙蔥總黃酮水洗組分預處理細胞1 h后，繼續與LPS共同處理24 h，12 000×g、4 ℃離心15 min，收集細胞培養上清液，依據ELISA試劑盒說明書檢測各處理組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的質量濃度。

1.3.7 反轉錄實時熒光定量PCR法檢測iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、MyD88、NF-κB mRNA的表達水平

實驗分組同1.3.4節，各質量濃度沙蔥總黃酮水洗組分預處理細胞1 h后，繼續與LPS共同處理4 h。根據總RNA小量制備試劑盒說明書對收集的細胞進行細胞內總RNA的提取，對所獲得的RNA溶液進行純度及質量濃度的檢測。應用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA，采用10 μL反轉錄體系，反轉錄條件為：37 ℃、15 min；85 ℃、5 s。以β-actin為內參基因，按擴增試劑盒說明書對待測基因的mRNA表達量進行檢測，反應條件為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40 個循環；95 ℃ 15 s；60 ℃ 20 s。采用2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達量，ΔΔCt＝（Ct目的基因-Ctβ-actin）實驗組-（Ct目的基因-Ctβ-actin）空白對照組。引物信息見表1[13-15]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.4 數據處理與分析

實驗數據采用平均值±標準差表示，應用GraphPad Prism 5軟件對所有實驗數據進行顯著性分析并作圖，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey's Test，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 沙蔥總黃酮水洗組分對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活力的影響

圖1 沙蔥總黃酮水洗組分對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活力的影響Fig. 1 Effect of wAMF on cell viability of mouse peritoneal macrophages

如圖1所示，各質量濃度沙蔥總黃酮水洗組分處理小鼠腹腔巨噬細胞24 h后，小鼠腹腔巨噬細胞增殖活力與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），即沙蔥總黃酮水洗組分質量濃度在50～800 μg/mL時對小鼠腹腔巨噬細胞無細胞毒性作用，選用100、200、400 μg/mL進行后續實驗。

2.2 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞NO濃度和iNOS mRNA表達量的影響

NO作為一種重要的炎性介質，其濃度是評價炎癥反應程度的重要指標，而iNOS作為NO的限速酶，與NO的合成密切相關。圖2顯示，與未受LPS誘導的空白對照組相比，1 μg/mL LPS可高度顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞中NO濃度及iNOS mRNA的表達量（P＜0.001）。而與LPS應激模型組相比，經過不同質量濃度沙蔥總黃酮水洗組分（100～400 μg/mL）預處理的細胞均呈劑量依賴性地高度顯著降低NO的生成及iNOS mRNA的表達（P＜0.001），且在400 μg/mL時對NO的抑制率為74.2%。

圖2 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞NO生成及iNOS mRNA表達的影響Fig. 2 Effect of wAMF on NO production and iNOS mRNA expression in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

2.3 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞相關炎性細胞因子質量濃度及其mRNA表達量的影響

圖3 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞相關炎性細胞因子質量濃度及其mRNA表達量的影響Fig. 3 Effect of wAMF on inflammatory cytokine production and gene expression in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖3 A、C、E、G顯示，與空白對照組相比，LPS應激模型組可高度顯著提高TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的質量濃度（P＜0.001），表明炎癥模型建立成功。與LPS應激模型組相比，添加不同質量濃度沙蔥總黃酮水洗組分組均可不同程度地抑制促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌（P＜0.01或P＜0.001），對3 種促炎性細胞因子的最大抑制率分別為61.8%、29.6%及62.5%；同時高度顯著提高抗炎性細胞因子IL-10的質量濃度（P＜0.001），且呈劑量依賴效應，最大提高率為170.4%。

為進一步明確沙蔥總黃酮水洗組分對TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的調節作用，通過反轉錄PCR法檢測了其mRNA表達量的變化。圖3B、D、F、H顯示，沙蔥總黃酮水洗組分在100～400 μg/mL范圍內均可顯著或極顯著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達，提高IL-10 mRNA的表達，表明沙蔥總黃酮水洗組分對炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10 mRNA表達量的調節作用與其對TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10 4 種炎性因子分泌水平的調節作用基本一致。

2.4 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中MyD88及NF-κB mRNA表達量的影響

由圖4可知，與空白對照組相比，LPS應激模型組小鼠細胞中MyD88及NF-κB?mRNA的表達量高度顯著升高（P＜0.001）；與LPS應激模型組相比，小鼠腹腔巨噬細胞經不同質量濃度沙蔥總黃酮水洗組分預處理1 h后，可極顯著降低MyD88及NF-κB mRNA表達水平（P＜0.01或P＜0.001），且400 μg/mL時對NF-κB的抑制效果最佳。

圖4 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中MyD88（A）及NF-κB（B）mRNA表達量的影響Fig. 4 Effect of wAMF on MyD88 (A) and NF-κB (B) mRNA expression in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

3 討 論

炎癥是一種由物理因素（如溫度、放射性物質及機械損傷）、化學因素（如強酸、強堿及內源性毒性物質的分解產物）或生物因素（如細菌、毒素）在一定條件下刺激觸發的適應性反應[16]。在正常情況下，適宜的炎癥反應有利于宿主抵御病原體和傷口愈合，從而保護機體免受傷害和感染。巨噬細胞在炎癥反應過程中通過調節保護反應起著核心作用，當細菌等外來物質侵入機體時，其會釋放炎癥介質來預防有害刺激；但過度的炎癥反應會導致組織損傷，并出現動脈粥樣硬化、肥胖、系統性紅斑狼瘡及糖尿病等多種疾病[17]。所以，阻斷或延緩炎癥反應可治療或預防由炎癥引起的機體損傷。

細胞的增殖活性是機體的重要生命特征，也是體現細胞活力的重要指標。CCK-8法是一種無放射性、高靈敏度、簡便、高效檢測細胞毒性和增殖活力的方法。熊建文等[18]研究指出CCK-8法具有步驟少、重復性好等優點，能夠準確反映出細胞的增殖活性。本實驗通過CCK-8法檢測了沙蔥總黃酮水洗組分對小鼠腹腔巨噬細胞的潛在細胞毒性，結果顯示，沙蔥總黃酮水洗組分質量濃度在50～800 μg/mL時對小鼠腹腔巨噬細胞均沒有細胞毒性作用，表明實驗用沙蔥總黃酮水洗組分的質量濃度對小鼠腹腔巨噬細胞是安全無毒的。

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成成分，又名內毒素，是引起機體炎癥損傷的重要致病因子，可激活巨噬細胞產生TNF-α、IL-1β、IL-6、NO等多種促炎介質，并增加炎癥損傷的程度。TNF-α是一種多功能的細胞因子，在炎癥的發生與發展過程中起著至關重要的作用，可增強巨噬細胞的敏感性，激活中性粒細胞和淋巴細胞，促進其他炎性細胞因子的合成與釋放[19-20]；IL-6可由多種免疫細胞產生，參與、調節絕大多數由炎癥引起的急性期蛋白誘發機體產生的非特異性反應[21]；IL-1β作為促炎性細胞因子可在炎癥初期大量產生，并促進炎癥反應進程，引起多種炎癥性疾病[22]。所以，由LPS誘導引發的對機體的炎癥損傷遠大于其對機體的直接毒性。在養殖業中，內毒素感染導致的動物死亡給養殖企業造成了巨大的經濟損失。因此，中和、抑制LPS誘導產生的炎癥介質及細胞因子成為預防與治療炎癥損傷的主要思路和方法之一。

本研究結果表明，小鼠腹腔巨噬細胞經LPS刺激后，可顯著提高炎性介質的質量濃度。細胞經沙蔥總黃酮水洗組分預處理后，可呈劑量依賴性地極顯著抑制由LPS誘導的TNF-α、IL-1β、IL-6的產生，同時抑制相關炎性細胞因子mRNA表達量，表明沙蔥總黃酮水洗組分通過調節促炎細胞因子的基因轉錄水平來抑制炎癥的發生。NO為重要的炎癥介質，在細胞中由iNOS催化L-精氨酸產生，在各種生理和病理條件下廣泛存在于機體內，過量的NO會導致細胞死亡，破壞組織穩態[23-24]。沙蔥總黃酮水洗組分可高度顯著抑制LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞中iNOS mRNA的表達和NO的產生，表明沙蔥總黃酮水洗組分通過抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞iNOS的活性抑制炎性介質NO的生成。IL-10作為另一種重要的細胞因子，其主要的生物學功能是調節炎癥反應程度和炎癥的持續時間，并選擇性地阻斷促炎性細胞因子及趨化因子的表達[25]。因此，誘導IL-10可被認為是內毒素損害機體期間內源性宿主保護機制的一部分。本研究結果表明，與LPS應激模型組相比，添加100～400 μg/mL沙蔥總黃酮水洗組分能夠高度顯著提高抑炎細胞因子IL-10的質量濃度及其mRNA表達水平，并呈濃度依賴性。

細胞表面存在一類模式識別受體，如Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs），被LPS激活后與連接蛋白MyD88銜接，進一步活化下游重要的核轉錄因子NF-κB，使其實現從細胞質到細胞核的核移位，引發如TNF-α、IL-1β、IL-6、NO等炎癥介質的大量產生，進而造成機體炎性損傷[26]。所以，長期以來與NF-κB信號通路相關的關鍵分子被認為是許多抗炎藥物的主要靶點。本研究結果表明，小鼠腹腔巨噬細胞經質量濃度100～400 μg/mL沙蔥總黃酮水洗組分處理后，可極顯著降低由LPS誘導的MyD88和NF-κB mRNA的表達，且在400 μg/mL時效果更好。提示沙蔥總黃酮水洗組分的抗炎活性可能與NF-κB信號通路有關，但是具體的作用機制還有待進一步研究。

目前，天然健康產品或其次級代謝產物已被用于治療和預防許多炎癥性疾病，且可以強烈抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的分泌，這可能歸因于提取物對NF-κB活性的影響[27]。一些研究表明，自然抑制劑通過抑制炎癥介質進而抑制NF-κB，從而可明顯改善內毒素誘導的膿毒癥[28]。近年來，越來越多的研究報道了黃酮類化合物對機體的抗炎作用及其機制，如抑制與類花生酸合成相關酶的產生及其本身存在的抗氧化活性；但有研究表明，一些黃酮類化合物可通過調節促炎分子的產生導致炎癥反應的減弱[29]。有報道指出，異槲皮苷可通過調控NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶信號通路抑制TNF-α、IL-6及iNOS等促炎介質的分泌，減輕由LPS誘導的心臟功能障礙，從而作為治療膿毒癥引起的心臟功能障礙的潛在藥物[30]。Liu Lin等發現金合歡素對關節炎具有緩解作用，可預防病變，降低促炎介質的產生[31]。Elnur等的研究結果表明，由Inula montana L.中提取出的含有木樨草素等黃酮類化合物的復合成分可降低由LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中NO等炎癥介質的產生，發揮較強的抗炎活性[32]。本研究結果與上述研究結果相一致，表明沙蔥總黃酮水洗組分具有良好的抗炎活性。

綜上所述，沙蔥總黃酮水洗組分通過調節炎癥介質及細胞因子的分泌體現其體外抗炎活性，其作用機制可能與NF-κB信號通路有關。