雜糧早餐粉對砷致小鼠雄性生殖毒性的緩解作用

高俊宇，儀慧蘭

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

砷是自然界廣泛存在的類金屬元素。自然或人為因素造成的土壤和水體中砷含量過高已嚴重威脅人類健康[1]。砷可通過呼吸道、皮膚、消化道等途徑進入人體，飲用水攝入是砷進入人體最主要的途徑[2]。據統計全球約2億人的飲用水中砷含量高于世界衛生組織規定的最高限值10 μg/L[3]。我國山西、新疆、云南等十幾個省份存在飲用水砷超標問題。長期飲用含砷水不僅會損傷人體神經系統、心血管系統、呼吸系統和消化系統等，還能引發皮膚癌、肺癌、膀胱癌和肝癌等[4]。研究還發現，飲用水砷超標可致男性生育能力低下，使精子數量減少、活力減弱、畸形率增加[5]。目前還沒有有效的措施解決高砷飲水地區男性生育力下降的問題。

動物實驗表明，砷是生殖毒物之一，會引起一系列生殖毒性。長期飲用含砷水會導致睪丸類固醇生成抑制，睪丸和附屬器官質量減輕，精子數量減少、活性降低，血清促性腺激素和睪酮水平改變[6-8]?，F有研究認為，砷的生殖毒性可能與其引發的氧化脅迫有關，補充抗氧化劑VC能減輕砷攝入對小鼠雄性生殖能力的影響[9]。

鑒于此，本課題組前期基于抗氧化能力提升和營養成分均衡的原則研制了一款雜糧早餐粉[10]，本實驗通過毒理學實驗程序研究雜糧早餐粉對飲水攝入砷帶來的雄性生殖毒性的緩解作用，以期為高砷地區居民提供方便食材，通過日常飲食緩解砷毒性，達到保護機體健康的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康昆明種純系雄性小白鼠40 只，體質量（23±2）g（生產許可證號：SCXK 2017-0001；使用許可證號：SYXK 2017-0003），由山西省腫瘤醫院提供；小鼠飼喂專用全價大顆粒飼料由山西醫科大學提供。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、H2O2、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成科技有限公司；乙醇、甲醇、甲醛、二甲苯（分析純） 無錫市晶科化工有限公司；伊紅（分析純） 上海西隴化工有限公司；蘇木精（分析純） 北京亞米生物科技有限公司；亞砷酸鈉 美國Sigma公司；氯化鈉（分析純）山東德彥化工有限公司；考馬斯亮藍 沈陽樂衡科技有限公司；戊巴比妥鈉（純度99%） 北京華業寰宇化工有限公司；石蠟 海門市峰益實驗器材廠。

1.2 儀器與設備

SynergyH1多功能酶標儀 美國BioTek Instruments公司；BX41熒光生物顯微鏡 日本Olympus公司；HC-2518R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；800Y高速多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；G70F20CN1L-DG（B0）家用微波爐 廣東格蘭仕集團。

1.3 方法

1.3.1 早餐粉溶液的配制

課題組前期研制的早餐粉配方如下[10]：小米27.76%（質量分數，下同）、白砂糖24.44%、黃豆20.00%、核桃仁19.70%、葡萄皮5.00%、黃原膠3.00%。其中，葡萄果皮粉過120 目篩，其他成分過80 目篩。

早餐粉溶液的配制：取1 g早餐粉加入水溫90 ℃以上的蒸餾水7 mL沖調，配制質量濃度為14.30 g/100 mL的早餐粉溶液；取1 g早餐粉加水溫90 ℃以上的蒸餾水14 mL沖調，配制質量濃度為7.15 g/100 mL的早餐粉溶液。

1.3.2 實驗動物分組

將小鼠按體質量隨機分為4 組，每組10 只。設正常對照組：小鼠飲用蒸餾水；砷染毒組：小鼠飲用含砷蒸餾水（用NaAsO2配制，砷質量濃度為10 mg/L）；早餐粉干預組：小鼠在飲用含砷水的同時灌胃7.15 g/100 mL（低劑量組）或14.30 g/100 mL早餐粉溶液（高劑量組）。灌胃起始劑量為每次每只0.4 mL，小鼠體質量每增加2 g，灌胃體積增加0.03 mL，每3 d灌胃一次。實驗周期60 d。所有實驗小鼠均飼喂專用全價大顆粒飼料，每只小鼠5 g/d。各組小鼠均自由取水，每2 d對小鼠的飲水量進行監測記錄，將該籠小鼠的飲水量除以小鼠數量，即為該籠每只小鼠的日均飲水量。實驗期間平均飲水量為日均飲水量的平均值。每周稱體質量1 次。染毒結束前12 h禁食。

1.3.3 實驗動物解剖與取材

將小鼠麻醉、稱質量、解剖，取雙側附睪用于制備精子懸液，取雙側睪丸用預冷的生理鹽水浸洗，濾紙吸干表面浮水，稱質量，將左側睪丸浸泡于體積分數4%的中性甲醛溶液中固定，右側睪丸冷凍于-80 ℃冰箱中備用。睪丸臟器系數按下式計算。

1.3.4 睪丸組織氧化脅迫指標測定

取凍存的睪丸組織，加生理鹽水制備質量分數10%的組織勻漿液。按照試劑盒操作說明，檢測SOD活力和GSH、H2O2、MDA含量。用考馬斯亮藍比色法[11]測定蛋白含量。

1.3.5 精子數量和形態的觀察

將附睪用生理鹽水洗凈，置于小平皿中，加入500 μL生理鹽水浸沒，用眼科剪縱向剪1～2 次，于37 ℃水浴5 min，皿中液體經擦鏡紙過濾得到精子懸液[12]，用血球計數板對精子數量計數。

取精子懸液，推片、干燥、甲醇固定，用體積分數1%～2%伊紅染色，顯微鏡觀察。精子畸形計數以7 種畸變類型為基準，包括無鉤、香蕉頭、胖頭、不定型頭、雙頭、尾折疊和雙尾。選擇背景清晰，精子結構無損壞、無重疊的制片區域，統計該精子制片畸形精子數和精子總數，每只小鼠觀察精子共計約1 000 個，計算精子畸形率[12]。

1.3.6 睪丸組織切片與觀察

取甲醛固定的睪丸組織，制備石蠟切片。組織經自來水浸洗，乙醇脫水，二甲苯透明處理，浸蠟（石蠟熔點58～60 ℃），包埋，切片（厚度3～4 μm）、展片、貼片，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡觀察。

1.4 數據統計與分析

各組實驗所得結果均以平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析方法。

2 結果與分析

2.1 實驗小鼠的一般情況

整個實驗期間，所有小鼠毛發順暢，行走、飲食正常，未出現死亡。根據實驗期間對飲水量的監測，砷染毒組小鼠飲水量平均值為5.57 mL/d，由飲水量計算小鼠砷攝入量均值為1.731 6 mg/（d·kg mb），砷染毒組和早餐粉干預組小鼠飲水量無顯著差異（P＞0.05），因此兩組小鼠砷攝入量也無顯著差異（P＞0.05）。實驗結束時各組小鼠的體質量均無顯著差異。

2.2 砷對小鼠睪丸臟器系數和精子總數的影響及雜糧早餐粉干預效應

圖1 小鼠睪丸臟器系數Fig. 1 Mouse testicular coefficient

由圖1可知，與正常對照組相比，砷染毒組小鼠睪丸臟器系數顯著降低，14.30 g/100 mL早餐粉干預組小鼠的睪丸臟器系數較砷染毒組顯著升高（P＜0.05）。

圖2 小鼠的精子總數Fig. 2 Total sperm count of mice

由圖2可知，砷染毒組小鼠的精子總數顯著低于正常對照組（P＜0.05），7.15 g/100 mL的早餐粉溶液干預后小鼠的精子總數略高于砷染毒組，14.30 g/100 mL的早餐粉溶液干預后小鼠的精子總數顯著高于砷染毒組（P＜0.05），且接近正常對照組。

2.3 砷對小鼠睪丸組織的氧化損傷及雜糧早餐粉的干預效應

圖3 小鼠睪丸組織的氧化脅迫指標Fig. 3 Oxidative stress indexes of testicular tissue in mice

由圖3可知，與正常對照組相比，砷染毒組小鼠睪丸組織SOD活力和GSH含量顯著降低（P＜0.05），H2O2和MDA含量顯著升高（P＜0.05），采用雜糧早餐粉干預后，睪丸組織中SOD活力和GSH含量較砷染毒組提高，其中14.30 g/100 mL早餐粉干預組顯著高于砷染毒組（P＜0.05）。兩個早餐粉干預組中H2O2和MDA含量均顯著低于砷染毒組（P＜0.05），睪丸組織氧化損傷程度明顯降低。

2.4 砷對小鼠精子的致畸作用及雜糧早餐粉干預效應

圖4 小鼠精子畸形率Fig. 4 Sperm deformity percentage in mice

由圖4可知，砷染毒組的精子畸形率顯著高于正常對照組，7 種精子畸形類型所占比例依次為：尾折疊＞不定型頭＞香蕉頭＞胖頭＞無鉤＞雙尾、雙頭，其中雙尾和雙頭所占比例很少。與正常對照組相比，砷染毒組中不同類型精子畸形率的增幅分別為：尾折疊2.64%、不定型頭0.78%、香蕉頭0.58%、胖頭0.48%和無鉤0.16%。早餐粉干預組的精子畸形率顯著低于砷染毒組，其中，14.30 g/100 mL早餐粉溶液干預后精子畸形率降低至接近正常對照組，效果好于7.15 g/100 mL早餐粉干預組。

2.5 砷對小鼠睪丸組織結構的損傷及雜糧早餐粉干預效應

圖5 小鼠睪丸組織切片（×200）Fig. 5 Testicular tissue sections of mice (× 200)

由圖5可知，光學顯微鏡下，正常對照組小鼠睪丸生精小管排列規則，基膜結構完整，管腔內有大量精子，生精細胞排列緊密且層次分明，各發育階段精細胞均有，生精細胞大約有5～6 層。砷染毒組生精小管間有間隙產生，基膜結構出現破損，生精細胞排列疏松且不規則，生精小管管腔內成熟精子較少。采用早餐粉干預后，生精細胞排列的緊密度和規則性提高，生精小管基膜結構較完整，管腔內的精子較砷染毒組明顯增多。兩個早餐粉干預組相比，14.30 g/100 mL早餐粉干預組的睪丸結構更接近于正常對照組。

3 討 論

現有研究表明，氧化損傷是砷毒性作用的主要機制[13-15]，本研究采用含砷質量濃度為10 mg/L的蒸餾水飼喂小鼠，60 d后小鼠精子數量下降、結構異常，睪丸組織出現氧化應激和結構損傷，說明本實驗所用昆明種小鼠對砷致雄性生殖毒性的反應與大鼠和雄兔[16]等實驗動物一致，建立的毒理模型具有較好的代表性。而雜糧早餐粉干預不僅能改善砷攝入引發的睪丸組織氧化脅迫，對砷致睪丸組織結構損傷也有明顯的緩解效應，可能與雜糧早餐粉增加機體抗氧化活性繼而降低砷誘發的氧化損傷有關。

臟器系數是動物實驗中重要的檢測指標，臟器系數降低說明該組織器官萎縮[17]。本研究中通過飲水攝入10 mg/L砷，導致小鼠睪丸質量的下降，在用14.30 g/100 mL早餐粉溶液干預后小鼠睪丸臟器系數得到顯著提升（P＜0.05），表明攝入一定量的早餐粉可緩解砷致小鼠雄性生殖器官的毒性作用。

精子數量和質量是判斷砷致雄性生殖毒性的重要指標，進入機體的砷會抑制雄性生殖細胞的發生和發育，使精子總數減少[8,18]，畸形率升高。本研究中砷染毒組精子總數降低，精子畸形率增加，表明本實驗條件下攝入的砷劑量已對小鼠精子的生成產生毒性或抑制作用，使精子總數降低、形態異常。采用雜糧早餐粉干預后小鼠精子總數升高，可能是雜糧早餐粉中含有的生物活性物質，如植物抗氧化成分、功能小分子物質等，可有效地提高小鼠機體抗氧化能力，緩解砷攝入引發的小鼠生精過程異常。

生物體內存在抗氧化防御系統，維持生物體內氧化還原狀態的動態平衡。本研究中砷染毒組SOD活力和GSH含量降低，H2O2和MDA含量提高，這與前人在動物實驗中取得的結果[14-15]一致，說明飲用水攝入砷引發了小鼠睪丸組織細胞的氧化還原失衡。SOD是機體抗氧化系統的第一道防線，攝入砷使睪丸SOD活力降低，可能是砷對巰基的高親和力導致酶結構發生變化，競爭性抑制Cu2+和Zn2+等微量元素的吸收，致使含巰基的抗氧化酶失活[18]。GSH是抗氧化系統的第二道防線，可通過自身氧化還原循環降低胞內自由基水平，GSH也是谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione S-transferases，GST）的底物，砷染毒組還原型GSH消耗量增加[19]，導致還原型GSH含量減少、機體還原能力降低，通過影響GPx和GST活力引發機體抗氧化能力下降。砷染毒組H2O2含量提高表明睪丸組織中存在較高水平的自由基，胞內高水平自由基能損傷生物大分子，使抗氧化分子減少、抗氧化酶活力降低，膜脂過氧化產物MDA濃度提高。采用雜糧早餐粉干預后SOD活力和還原型GSH含量升高，H2O2和MDA含量降低，可能是雜糧早餐粉中含有的大豆異黃酮、花色苷和VC等活性物質增加了睪丸組織中酶和非酶抗氧化劑的水平，阻止了自由基鏈式反應[20]。

本課題組研制的雜糧早餐粉，其主要成分包括小米、大豆、核桃和葡萄皮，小米中含有豐富的不飽和脂肪酸、維生素、氨基酸和多酚類物質[21]；大豆含有豐富的全蛋白、不飽和脂肪酸、花色苷等黃酮類物質[22]；核桃中含有豐富的可溶性蛋白、VE、VC、氨基酸、多酚類物質和核桃油，核桃油中含不飽和脂肪酸、棕櫚酸、槲皮素和鞣花酸等[23]；葡萄皮中含有大量的植物天然活性成分，如白藜蘆醇、VC、原花青素和花青素等[24-25]。大豆中的全蛋白易于被人體消化吸收，不僅能為人體活動提供能量，還能提供必需氨基酸，全蛋白中的酪蛋白能夠緩解砷引起的氧化應激，抑制活性氧生成，提高機體抗氧化酶活力[26]。早餐粉中含有的VC是氧化還原反應中的單電子供體，可直接中和活性氧，保護SOD和過氧化氫酶的活力，降低砷對機體的氧化應激作用[9]；原花青素、花青素、白藜蘆醇、槲皮素、鞣花酸和花色苷等黃酮類和酚類物質具有很好的抗氧化、抗炎癥和清除自由基功效，具有減緩砷氧化應激的作用[27-30]；不飽和脂肪酸α-亞麻酸可上調SOD蛋白和基因的表達水平，從而提高其活力和含量[14]，提高睪丸組織的抗氧化能力。

上述結果表明，通過飲水攝入砷能誘發睪丸組織氧化脅迫，機體的氧化應激反應可能會導致雄性生殖毒性，包括睪丸組織氧化還原系統失衡、精子質量和數量異常、睪丸組織結構破壞。雜糧早餐粉能顯著增強小鼠睪丸組織的抗氧化能力，緩解砷攝入對睪丸組織的氧化脅迫，提高精子數量和質量，并對睪丸組織結構有一定保護作用。