一種雙層智能膜的制備及在指示三文魚新鮮度中的應用

鄒小波，薛 瑾，黃曉瑋，翟曉東，張俊俊，張澤翔，甘子玉

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

隨著對高品質、安全和新鮮食品的需求不斷增加，消費者對食品包裝也提出了更高的要求。包裝不僅應該具有保護食品、方便運輸的作用，還應該能反饋食品品質變化信息，因此食品新鮮度的智能指示包裝是目前研究熱點[1]。研究人員通過加入比色指示劑，如溴甲酚藍[2]、甲基紅[3]、聚苯胺[4]，根據與食品變質產生的揮發性成分發生反應而產生顏色變化來監測食品的新鮮度，然而這些化學色素價格較貴，且用于食品包裝具有一定的毒性。花青素廣泛存在于植物的花朵和果實中，易獲得、價格便宜[5]、安全無毒害，是一種理想的食品變質監測指示劑[6]；但花青素性質不穩定，易受溫度、光照、氧氣、金屬離子等因素的影響，在作為食品包裝材料時氧氣是影響其性質的最主要因素。因此本實驗針對隔絕氧氣進行研究，以提高花青素作為新鮮度指示型智能包裝材料的穩定性[7-9]。

低酰基結冷膠是一種高分子線性陰離子多糖，由4 個單糖分子組成的基本單元重復聚合而成，作為乳化劑和穩定劑被廣泛應用于飲料系統中[10]。Xu Xuejiao等[10]研究表明低酰基結冷膠可以通過與花青素的氫鍵作用力提高花青素穩定性。

聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）是生物相容性好、力學性能優良的合成高分子材料，在90 ℃下溶于水且透明無毒，具有良好的氧氣阻隔性[11]。殼聚糖是一種無毒的陽離子多糖，具有良好的成膜性、抗菌性、阻氧性以及生物相容性，是優良的可降解包裝材料[12]。祝二斌等[13]的研究表明殼聚糖和PVA存在的強烈氫鍵相互作用力，使得殼聚糖的熱穩定性提高、PVA的結晶性下降。Naveen等[14]研究表明殼聚糖和PVA之間的強烈相互作用，使得其組合物之間可以完全混勻。劉文霞等[15]研究表明殼聚糖/PVA共混膜具有良好的成膜性能、力學性能和阻氧性能。

本研究以桑葚花青素為指示劑，結冷膠和花青素形成指示內層膜，殼聚糖和PVA結合形成外層膜，使用逐層組裝技術制備雙層指示膜，用于三文魚的新鮮度指示。與單層膜相比，雙層膜具有更好的機械性能，較低的水蒸氣透過系數，可以通過隔絕氧氣降低花青素氧化作用，提高其穩定性，目前鮮有類似的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚干、新鮮三文魚，均購自當地超市。

低酰基結冷膠、PVA、丙三醇、殼聚糖、硫代巴比妥酸 國藥集團有限公司。

1.2 儀器與設備

高速粉碎機 江蘇益勇儀器設備有限公司；食品物性儀 英國Stable Micro Systems公司；VIS-7220N可見分光光度儀 北京瑞利分析儀器有限公司；Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；Color Quest XE 色差儀 美國Hunter Lab儀器公司；pH計 意大利HANNA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素提取

將桑葚干用粉碎機高速打磨成粉，過40 目篩備用，得到的粉末在60 ℃條件下，用體積分數75%乙醇溶液作為提取劑，按照料液比1∶10（m/V）混合，水浴鍋提取3 h[16]。使用布氏漏斗對得到的提取液進行抽濾，得到花青素濃縮液。最后將花青素濃縮液進行冷凍干燥得到桑葚花青素粉[17]。

1.3.2 桑葚花青素在不同pH值下可見光譜的測定

利用紫外-可見分光光度計測定桑葚花青素在pH 2～12范圍內的可見光譜，掃描波長為400～800 nm[18]。

1.3.3 殼聚糖/PVA-結冷膠花青素雙層膜的制備

外層膜：取殼聚糖1.5 g溶解在體積分數為1%的乙酸溶液中以制備質量分數1.5%的殼聚糖溶液，將1.5 g PVA溶解在蒸餾水中并在85 ℃的水浴中攪拌4 h制備質量分數1.5%的PVA溶液。當PVA溶液冷卻至室溫時，將殼聚糖和PVA溶液按體積比1∶1混合，溶液超聲去泡后備用。

圖1 雙層膜制備示意圖Fig. 1 Schematic diagram for developing bilayer films

內層膜：取1.5 g結冷膠溶解在蒸餾水中以制備質量分數為1.5%的結冷膠溶液，將5 mmol/L氯化鈣和體積分數為1.0%甘油加入結冷膠溶液中增強膜的性質，再加入基質干質量11.3%的桑葚凍干粉（桑葚凍干粉含量為4.29 mg/g）；雙層膜（圖1）：將結冷膠溶液超聲去泡后倒入直徑為9 cm的培養皿中，并在30 ℃烘箱中干燥24 h以形成內層膜，隨后，將殼聚糖/PVA溶液倒入內層膜培養皿中，在30 ℃烘箱中干燥24 h形成雙層膜。

1.3.4 內層膜組分優化設計

在單因素試驗基礎上對內層膜進行正交試驗設計，選擇結冷膠含量、氯化鈣濃度、甘油含量3 個影響因子，按照L9（34）正交設計進行試驗，各因素及其水平設計如表1所示，每組試驗重復3 次。

表1 L9（34）正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 指示膜厚度及機械性能的測定

用數顯千分尺隨機量取膜6 個點的厚度值，得到平均膜厚度，單位μm。

參照GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的測定》[19]的方法測定機械性能，把膜裁為60 mm×20 mm的長條狀，采用質構分析儀的TA96裝置測量膜的拉伸強度（tensile strength，TS）和斷裂伸長率（elongation at break，EB）。初始夾距為40 mm，拉伸速率為0.6 mm/s，每組膜重復測定3 次。按照公式（1）和（2）分別計算TS和EB。

式中：F為試樣斷裂時承受的最大拉力/N；w為膜的寬度/mm；d為膜的厚度/mm。

式中：L1為膜斷裂時的拉伸長度/mm；L0為初始夾距/mm。

1.3.6 指示膜的含水率以及透氣性能測定

稱取質量為m1/g的膜放置于溫度設置為105 ℃的鼓風干燥箱中，烘干至質量恒定后，取出稱得質量為m2/g，每組膜取3 個平行樣品，按照公式（3）計算含水率[20]。

取20 mL蒸餾水倒入50 mL燒杯中，用膜包覆杯口并用細皮筋進行固定，在22 ℃條件下，放入含有硅膠的干燥器中。每隔2 h稱量，稱取6 次，每組膜取3 個平行樣品，按照公式（4）計算水蒸氣透過系數（water vapor permeability，WVP）[21]。

式中：x為膜厚/mm；S為有效面積，S＝18.08×10-4m2；Δm為水分透過的質量/g；t為間隔時間/s；ΔP為膜兩邊的壓強差，ΔP＝3 179 Pa（22 ℃）。

1.3.7 指示膜的顏色穩定性測定

將膜裁為20 mm×20 mm的方形，分別置于4、25、37 ℃，相對濕度為75%的恒濕恒溫箱中保存，每2 d取出采集膜的圖像信息，共14 d。提取圖像的亮度（L*）、紅綠度（a*）、黃藍度（b*）特征值，利用L*、a*、b*總變化率ΔE表征膜的顏色穩定性，按照公式（5）[22]計算。

式中：ΔL*＝L*-L0*、Δa*＝a*-a0*、Δb*＝b*-b0*；L*、a*、b*為指示膜反應后的值；L0*、a0*、b0*為指示膜反應前的值。

1.3.8 指示膜的光譜分析

采用FT-IR儀測定膜的紅外光譜，采用衰減全反射附件測量，掃描次數為32，分辨率4 cm-1，測量范圍4 000～500 cm-1。

1.3.9 指示膜的微觀結構

用7800F型掃描電子顯微鏡觀察指示膜的橫切面結構并拍照，測量前用液氮對指示膜進行冷凍斷裂，并經過真空噴金，加速電壓為15 kV。

1.3.10 指示膜檢測三文魚新鮮度

取新鮮三文魚20 g放在直徑為9 cm的帶蓋塑料培養皿中，將膜剪切成2 cm×2 cm的正方形，粘貼在培養皿的蓋子上，將培養皿放置在4 ℃的冰箱中貯存14 d，每隔2 d測一次指示膜的顏色，計算ΔE，并按照GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》測定肉的總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量[23]；同時參考Arashisar等[24]的方法，將10 g魚肉絞碎于燒杯中，加入90 mL蒸餾水，均質機勻漿后靜置30 min，抽濾，取濾液測其pH值，重復3 次，硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值以每千克魚肉中所含丙二醛質量計。參考Mousakhani-Ganjeh[25]、張新林[26]等的方法，并采取適當調整，向5 g三文魚樣品中加入15 mL、7.5%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），均質后過濾，取濾液5 mL并加入同等體積0.02 mol/L的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液，再放于沸水中保持40 min，取出冷卻后1 600 r/min離心5 min，測定上清液在532 nm波長處的吸光度。

1.4 數據統計分析

應用SPSS軟件，利用Duncan's方法進行方差分析，結果用 ±s表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 桑葚花青素的可見光譜分析結果

圖2 桑葚花青素在pH 2～12的顏色及可見光譜Fig. 2 Color and visible spectra of mulberry anthocyanin solutions at pH 2～12

如圖2A所示，在pH 2～12的范圍內，桑葚花青素的顏色隨著pH值的升高由紅色到藍色又變為黃色，pH值小于7時，桑葚花青素顏色呈粉紅色，其最大吸收峰在520 nm波長附近，pH值在7的時候，已經從520 nm開始向587 nm波長方向移動，同時最大吸收波長處的吸光度下降，pH 8～12時，花青素顏色從藍色變為黃色，其最大吸收峰也從520 nm移至587 nm波長處。在不同的pH值下桑葚花青素顏色改變的原因是自身結構的改變。

桑葚花青素在不同pH值環境下會呈現出醌型堿、黃烊鹽離子、假堿、查耳酮結構[27]。pH值小于3時，花青素主要以黃烊鹽離子形式存在，溶液顯現鮮艷的紅色。pH值小于7時，隨著酸性的減弱，花青素主要以醇型假堿或查耳酮形式存在，溶液的紅色逐漸變淺。pH值大于7時，花青素主要表現為醌型堿，溶液顏色變為藍色，且隨著堿性增強由淺變深，pH 12時變為黃綠色。

2.2 內層膜正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選取結冷膠含量（A）、氯化鈣濃度（B）、甘油含量（C）3 個影響因子作為考察標準，按照L9（34）正交試驗設計考察這3 個影響因子對內層膜的TS和EB的影響。

由表2可以得出，三因素對機械性能的影響程度的主次順序是A、B、C，較好的水平為A3B2C2，表明對內層膜機械性能影響程度順序為結冷膠＞氯化鈣＞甘油。結冷膠質量分數為1.5%、氯化鈣含量為5 mmol/L、甘油質量分數為1.0%時，以此工藝條件進行3 次重復驗證實驗，得到最優組合膜的TS為（24.80±1.12）MPa，EB為（27.67±0.41）%，內層膜的機械性能最好，其中氯化鈣的加入可以屏蔽結冷膠因靜電作用力而產生的羧基側鏈相互排斥作用，增加分子內的交聯作用，提高膜的機械性能[28]；甘油是親水性較強的增塑劑，可以增加聚合物分子鏈的移動性以降低膜的抗張能力，克服聚合物鏈之間的剛性互聯引起的脆性，增加膜的彈力[29]。

表2 內層膜組分正交試驗分析結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results for formulation optimization of inner layer

2.3 指示膜的厚度與機械性能

表3 雙層膜的膜厚度、含水率、水蒸氣透過系數和機械性能Table 3 Thickness, water content, water vapor permeability and mechanical properties of inner and outer layers

從表3可以看出，指示膜之間的含水率存在顯著性差異（P＜0.05）。空白指示膜含水率最低，外層膜殼聚糖與PVA體積比為2∶3時含水率最低，膜的厚度存在顯著性差異（P＜0.05），內層膜由于是單層膜，其厚度與雙層膜的差異較大。膜的TS存在顯著性差異（P＜0.05），內層膜的TS最低，殼聚糖為外層膜的雙層膜TS最大，這種差異是可能由于殼聚糖膜與結冷膠層的羥基數不同導致，當殼聚糖含量增加，雙層膜的TS逐漸上升。膜的EB存在顯著性差異（P＜0.05），當PVA含量增加，雙層膜的EB率逐漸上升。此外，水蒸氣可以滲透進食品包裝內部，從而引起食品品質變化，由表可知，不同的膜水蒸氣透過系數有顯著性差異（P＜0.05），其中內層膜的水蒸氣透過系數最高，這可能是由于內層膜的桑葚花青素中含有大量的酚羥基，使得膜的親水性較好，而雙層膜的水蒸氣透過系數普遍較低；外層膜為殼聚糖和PVA的共混物時，膜的水蒸氣透過系數相比其他較低，說明殼聚糖和PVA的相容性很好，可以很好地阻隔水蒸氣。故殼聚糖和PVA體積比為1∶1時，雙層膜的性能最優。

2.4 指示膜的FT-IR譜圖

圖3 PVA、殼聚糖、桑葚花青素、結冷膠和雙層指示膜的FT-IR譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of polyvinyl alcohol, chitosan, gellan gum,mulberry anthocyanins and the bilayer film

由圖3可知，在PVA和殼聚糖的紅外光譜圖中，3 330、3 374、3 381 cm-1和3 361 cm-1處的強峰為—OH鍵的伸縮振動吸收峰，雙層膜吸收峰移至3 357 cm-1處，說明這些物質同時存在羥基，且發生了一定的相互作用力。2 936 cm-1和2 886 cm-1處的雙峰為—CH3和—CH2伸縮振動吸收峰，低酰基結冷膠在此處存在較強的峰型，由于殼聚糖脫乙酰度較高，故殼聚糖在此處峰型比較弱[30]。1 420 cm-1為—CH伸縮振動吸收峰，在雙層膜中形成了較強的峰型。1 630 cm-1處的峰為芳香環架中C＝C振動，與花青素的芳香物質對應，1 590 cm-1和1 603 cm-1為—NH2特征吸收峰，雙層膜中移至1 614 cm-1，說明芳香族化合物與成膜基質間存在分子間作用力。1 154 cm-1為氨基C—N的特征吸收峰，雙層膜中此處峰消失，這是反應后殼聚糖形成的—NH3+反對稱變形振動吸收峰和結冷膠的羧基吸收峰重疊，可能是殼聚糖和結冷膠通過正負電荷發生了一定的絡合作用[31]。PVA和殼聚糖中1 080、1 089、1 041 cm-1為C—O伸縮振動吸收峰，雙層膜中對應的峰移至1 037 cm-1處，可能是復合物之間形成了分子間作用力。綜上，由FT-IR譜圖可知，雙層膜中分子間作用力影響膜性能，而化學物質沒有太大變化。

2.5 指示膜的微觀結構

掃描電子顯微鏡圖可以反映出物質之間的相容狀態，相容性越好，膜的截面越均勻。由圖4可知，雙層膜的分層部分交聯緊密，膜性質穩定。圖4A中外層膜為殼聚糖/PVA時，截面之間比較規則，結構緊致，PVA分子鏈上含有大量羥基可與殼聚糖形成氫鍵，使得殼聚糖和PVA之間相容性良好；圖4B中外層膜為PVA時，膜截面粗糙，交聯性差，這可能是PVA結晶度高導致；圖4C中外層膜為殼聚糖時，外層膜截面帶有紋路，組分均一性較差，存在纖維狀走向結構。對比可知，當外層膜為殼聚糖和PVA復合物時，膜的性能最好。

圖4 雙層膜的橫切面掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of cross sections of the bilayer film

2.6 指示膜的顏色穩定性

圖5 雙層膜在4（A）、25（B）、37（C）℃下貯藏14 d的顏色變化Fig. 5 Color change of the indicator film stored at 4 (A), 25 (B) or 37 (C) ℃ for 14 days

比較了不同比例外層結構的雙層膜在不同溫度下（4、25、37 ℃）的顏色穩定性，從圖5可知，當溫度升高時，花青素顏色穩定性降低，4 ℃時的穩定性明顯高于25 ℃，25 ℃的穩定性高于37 ℃，溫度越高，花青素的降解速率越快，并使得花青素結構二苯基苯并吡喃陽離子轉變為無色的假堿與查耳酮[32]。當外層膜殼聚糖和PVA的體積比為1∶1時，花青素穩定性表現最好，說明兩者的結合度最高，能防止內層花青素跟外層環境的接觸，抑制外界氧氣對內層花青素的氧化作用；單獨為內層膜時穩定性較低，因為色素裸露在環境中，加速了花青素氧化作用，膜的自身穩定性降低[33]。

2.7 雙層膜用于指示三文魚新鮮度

選用體積比為1∶1的外層殼聚糖和PVA制備雙層膜，用于指示三文魚新鮮度。TVB-N是指肉類在腐敗過程中，蛋白質分解產生的氨類等堿性物質，其含量是一種反映魚肉新鮮度的主要指標。GB 2733—2015《鮮、凍動物性水產品》規定海水魚類TVB-N含量不高于30 mg/100 g為新鮮肉[34]。魚肉在貯藏初期產生乳酸降低環境中的pH值，但隨著貯藏時間的進一步延長，肉中的蛋白質在微生物作用下分解為氨、三甲胺等堿性含氮物質，造成pH值上升，因此pH值變化可較好地評價魚肉的新鮮度情況[35]。TBA值是描述脂肪氧化程度的指標，三文魚中所含有的不飽和脂肪酸在低溫貯藏過程中與氧氣反應發生酸敗，因此用TBA值的變化來判斷三文魚的新鮮度，一般情況下魚肌肉中TBA值達到1～2 mg/kg時魚肉腐敗[26,36]。從圖6可以看出，三文魚在4 ℃貯藏6 d時TVB-N含量為33.14 mg/100 g，TBA值為0.921 mg/kg，pH值為6.75，此時，三文魚呈不新鮮狀態，指示膜顏色明顯變化，由暗紅變為淡紫色，最后變成藍褐色，是肉眼明顯可見的范圍，說明指示膜的顏色變化和三文魚品質信息關系密切，可以肉眼進行顏色辨別，因此該指示膜可用于指示三文魚新鮮度。

圖6 三文魚4 ℃貯藏下TVB-N含量、TBARS值、pH值和雙層膜的色差變化Fig. 6 Changes in TVB-N content and TBARS value of salmon samples during storage and change in ΔE of the indicator film corresponding to pH

3 結 論

本研究利用PVA和殼聚糖的共混物制成外層膜，結冷膠和桑葚花青素制成內層膜，得到的雙層膜用于三文魚新鮮度指示。桑葚花青素在不同pH值下呈現不同的顏色，本實驗通過對外層膜基質的比例進行比較分析，得到了外層膜PVA和殼聚糖的體積比為1∶1時，水蒸氣透過率最低，膜機械性能、截面相容性以及膜的自身穩定性最好。FT-IR圖表明成膜基質之間形成一定的相互作用力，膜性質穩定。將雙層膜用于三文魚新鮮度指示，當三文魚貯藏6 d時，通過肉眼可以直觀看到膜顏色從由暗紅變為淡紫色，最后變成藍褐色。此時，TVB-N含量為33.14 mg/100 g，TBARS值為0.921 mg/kg，pH值為6.75，說明三文魚已經腐敗。結果表明，包含桑葚花青素制成的雙層膜既可降低花青素氧化作用提高其穩定性，又可用于三文魚新鮮度指示，具有良好的應用潛力。