不同凍結方式對金鯧魚水分、組織結構與品質變化的影響

鞏濤碩，藍蔚青,2,，王 蒙，謝 晶,2,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

金鯧魚（Trachinotus ovatus）又名卵形鯧鲹，屬鯵科鯧鲹屬海水養殖經濟魚類[1]。在我國廣西、廣東與海南等地分布較廣，其肉質細嫩、味道鮮美，富含不飽和脂肪酸、必需氨基酸等多種營養成分，深受消費者喜愛[2]。然而，與其他水產品一樣，金鯧魚由于其魚肉中含有較多水分與營養物質，導致微生物快速繁殖，易發生腐敗變質。目前，水產品主要采用低溫方式進行保藏，此法可使其貨架期明顯延長[3]。但傳統冷凍處理方式會使水產品產生蛋白質變性、組織干耗與脂肪氧化等現象，解凍后又因汁液流失會降低其鮮味，影響口感，導致營養損失[4-5]。針對于此，國內外研究人員開展了液氮浸漬凍結、鼓風凍結與平板凍結（plate freezer，PF）等低溫方式處理水產品的研究，如宋敏等[6]研究了液氮浸漬凍結、靜止空氣凍結與鼓風凍結等凍結處理對鮰魚-18 ℃貯藏期間品質變化的影響。向迎春等[7]采用液氮、平板與冰柜凍結（ordinary freezer，OF）結合-20 ℃貯藏處理研究其對凡納濱對蝦品質變化的影響。而對螺旋式凍結與超低溫凍結等不同凍結方式研究很少，且方法相對單一，因此研究不同凍結方式對金鯧魚貯藏品質變化的影響具有重要的現實意義。本實驗以金鯧魚為原料，分別研究了PF、螺旋式凍結（spiral freezer，SF）、超低溫凍結（cryogenic freezer，CF）與OF等方式，通過比較pH值、揮發性鹽基氮（total volatile basis nitrogen，TVB-N）含量、質構特性、色澤、保水性（持水率、蒸煮損失率和汁液損失率）等指標的變化，并結合低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）儀與光學顯微鏡，分別從宏觀與微觀角度分析不同凍結處理方式對金鯧魚的水分、組織結構與品質變化的影響，以期為深入研究凍結方式對水產品品質影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活金鯧魚購自上海蘆潮港自發漁業合作社，選取大小均一的個體，樣品質量為（500±50）g，體長為（30±5）cm，將其放在盛有水的聚乙烯泡沫箱中，30 min內運回實驗室。

乙醇、蘇木精、鹽酸、戊二醛、輕質氧化鎂、磷酸緩沖液、叔丁醇、伊紅染液等購自國藥集團化學試劑有限公司，且均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PF-500型平板速凍機 南通星諾冷凍設備有限公司；LSSG120-1606型螺旋式速凍裝置 煙臺冰輪股份有限公司；CZLZ-5型超低溫速凍冷藏裝置 江蘇兆勝空調有限公司；Kjeltec8400型凱氏定氮儀 丹麥FOSS集團（中國）有限公司；TA.XT Plus型質構儀 英國Stable Micro Systems公司；CR-400色彩色差計 日本柯尼卡美能達有限公司；H-2050R型臺式高速低溫離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；AUW320型分析天平 日本島津公司；DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；2640A網絡型多點溫度采集儀 美國福祿克電子儀器儀表公司；DS-5M型數碼相機 日本Nikon公司；Meso MR23-060H-I型NMR分析及成像系統 上海紐邁電子科技有限公司；BX41型光學顯微鏡 日本Olympus光學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將鮮活金鯧魚樣品分別采用PF（溫度-30 ℃）、SF（溫度-35 ℃，風機頻率40 Hz）、CF（溫度-50 ℃，風機電機功率0.25 kW）與OF（溫度-20 ℃）4 種方式進行凍結處理。

當魚體中心溫度≤-20 ℃時即結束凍結，取出樣品后即置于-20 ℃冰箱中保存（24 h以內），在凍結過程中測定凍結曲線，以新鮮樣品為對照組（CK），4 ℃冷藏解凍后測定相關理化指標測定。

1.3.2 凍結曲線

將多點溫度采集儀插入樣品中心位置，以其放入4 種凍結裝置中為起始凍結時間點，對魚體中心溫度隨凍結時間的變化進行記錄。以凍結時間為橫坐標、溫度為縱坐標繪制4 種方式處理組金鯧魚的凍結曲線。

1.3.3 pH值測定

pH值參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》[8]，利用pH計進行測定。準確稱取不同凍結方式處理魚樣5 g，充分研磨搗碎，加入45 mL蒸餾水并混勻，靜置30 min，將探頭插入到肉樣中，使電極與肌肉組織充分接觸，待pH計讀數穩定后記錄，平行測定3 次。

1.3.4 TVB-N含量測定

根據GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[9]半微量定氮法，利用全自動凱氏定氮儀測定樣品TVB-N含量，平行測定3 次。

1.3.5 質構分析

質構分析參考Tan Mingqian等[10]的方法，并稍作修改。從金鯧魚背部肌肉中取20 mm×20 mm×10 mm大小的魚塊，吸除表面水分后，采用TPA模式對不同凍結處理樣品的硬度、黏著性、彈性、咀嚼性與回復性進行測定，每個樣品經歷2 次壓縮分析，測定條件為：探頭型號為P/50平底柱狀探頭，測試前速率為3 mm/s，測試速率和測試后返回速率均為1 mm/s，二次壓縮間隔時間5 s，壓縮程度50%，弛豫時間5 s。平行測定6 次。

1.3.6 L*值測定

參考Xu Xianglian[11]和常海軍[12]等的方法，采用色差計反射法測定樣品的L*值，選擇10 mm透鏡，對6 個樣品的外表面與正反兩面進行測定。

1.3.7 持水率測定

持水率的測定參考Zheng Haibo等[13]的方法并稍作修改，稱取（5.0±0.5）g魚肉置于帶濾紙筒的離心管中，4 ℃、5 000 r/min離心10 min后稱質量，每組樣品3 個平行。持水率的計算如公式（1）所示。

式中：m1為離心前魚肉質量/g；m2為離心后魚肉質量/g。

參考李婉竹等[14]的方法測定蒸煮損失率。準確稱取20 mm×20 mm×30 mm肉樣，裝入蒸煮袋中封好，在恒溫水浴中加熱至肉樣中心溫度至75 ℃，取出冷卻至室溫。再用吸水紙吸干表面汁液后進行稱量，每組樣品3 個平行。蒸煮損失率的計算如公式（2）所示。

式中：m3為蒸煮前魚肉質量/g；m4為蒸煮后魚肉質量/g。

1.3.9 汁液損失率測定

汁液損失率的測定參考Utrera等[15]的方法，分別記錄凍結前和凍結后除去表面水分后的質量。汁液損失率的計算如公式（3）所示。

式中：m5為凍結前魚肉質量/g；m6為凍結后魚肉質量/g。

1.3.10 LF-NMR測定水分分布

水分分布的測定參考Cao Minjie等[16]的方法，略作修改。將魚肉切成2 mm×2 mm×1 mm大小的立方體。擦干樣品表面水分，稱質量，保鮮膜包裹后，將其放入核磁管中并置于LF-NMR分析儀中。該測試在100 kHz的共振頻率下進行。重復掃描次數NS＝4，回波個數EC＝8 000，通過Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列采集樣品橫向弛豫時間T2。兩次連續掃描間的重復時間為3.5 s，脈沖間的τ值為150 μs。T2分布通過MultiExp Inv分析軟件獲得。

IMT（內中膜）大于等于1mm評定為IMT增厚；IMT局限性增厚大于等于1.5cm，突出管腔，評定為斑塊形成。

CPMG測試后的樣品進行多層面自旋回波脈沖序列成像測試，運用核磁成像分析（magnetic resonance imaging，MRI）成像軟件及MSE多層自旋回波序列采集樣品冠狀面質子密度像。

1.3.11 光學顯微鏡觀察

微觀結構的測定參考Zhang Mingcheng等[17]的方法，略作修改。5 mm×5 mm×10 mm大小的冷凍樣品在CM1850低溫恒溫器中切成與肌纖維取向垂直或平行的4 μm厚切片。隨后，將切片置于載玻片上并在蘇木精染色溶液中染色15 min，移至體積分數1%鹽酸乙醇溶液中，使其色澤均勻。通過流動的自來水洗滌切片15 min，再用伊紅染色10 min。然后將切片樣品分別用體積分數70%、80%、90%和100%乙醇溶液依次梯度脫水，每次2 min。最后，將其放入二甲苯中脫色，置于樹脂介質中。樣品用裝有數碼相機的光學顯微鏡觀察，冰晶直徑采用Image-Pro Plus軟件分析。

1.4 數據處理分析

數據為3 次平行實驗的結果，以平均值±標準差表示，采用Origin Pro 8.5軟件繪制曲線，采用SPSS 19.0中的Duncan新復極差法進行方差分析與多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同凍結方式處理金鯧魚的凍結曲線

速凍通過最大冰晶生成區域的時間與樣品種類、個體大小、凍結溫度與處理方式等密切相關。魚類的凍結溫度曲線可分為3 個階段：第一階段是魚體溫度迅速下降，降至凍結溫度，放出的熱量為顯熱；第二階段為最大冰晶生成區域，曲線平緩，此時80%以上的水結成冰，放出潛熱巨大，所需時間較長；第三階段是從魚肉凍結點溫度凍結至規定終溫。研究表明，樣品凍結速率越快，其通過最大冰晶生成區域的時間越短，冰晶形成越細小，樣品品質越好[18]。

圖1 不同凍結方式下金鯧魚的凍結曲線Fig. 1 Freezing curves of Trachinotus ovatus using different freezing methods

從圖1可見，CF與SF樣品通過最大冰晶生成區域速率最快，其次是PF樣品，OF處理樣品的通過速率最慢。OF樣品中心溫度從室溫降至-20 ℃的時間超過13 h，遠長于其他3 種凍結方式。可見，與OF相比，采用PF、SF與CF可明顯縮短樣品的凍結時間，提高其凍結效率。

2.2 不同凍結方式對金鯧魚pH值的影響

圖2 不同凍結方式對金鯧魚pH值的影響Fig. 2 Effects of different freezing methods on pH of Trachinotus ovatus

水產品在其僵直期結束后，在酶與腐敗菌共同作用下，其蛋白質、氨基酸與含氮物質等會降解生成一些氨、胺類堿性物質，使其pH值升高[19]。如圖2所示，對照組樣品的初始pH值為6.49±0.07，樣品經不同凍結方式處理后，所有凍結處理組樣品的pH值均較對照組有所升高，以OF組樣品上升最快，SF組樣品上升最緩，CF樣品組的pH值較PF和OF樣品低。可能由于金鯧魚經凍結處理后，其蛋白質變性，細胞部分破裂，使內容物外流，部分堿性氨基酸基團暴露，中和其中的酸性基團，導致樣品的pH值升高[20]。

2.3 不同凍結方式對金鯧魚TVB-N含量的影響

TVB-N含量對魚類鮮度評價具有重要指導作用，其是判斷樣品腐敗的標準之一。根據SC/T 3103-2010《鮮、凍鯧魚》[21]規定：TVB-N含量＜18 mg/100 g為一級鮮度，18 mg/100 g≤TVB-N含量＜30 mg/100 g為二級鮮度。當TVB-N含量超過二級鮮度時，一般認為不可食用。魚肉的TVB-N含量越高，則代表魚肉腐敗越嚴重[22]。

圖3 不同凍結方式對金鯧魚TVB-N含量的影響Fig. 3 Effects of different freezing methods on TVB-N content of Trachinotus ovatus

如圖3所示，對照組樣品的TVB-N含量為（11.89±0.56）mg/100 g。與對照組相比，不同凍結處理組樣品的TVB-N含量均有所上升。與其他速凍方式相比，SF組樣品的TVB-N含量最低，其次是CF組，可能由于速凍速率相對較快，對魚肉肌肉組織影響小，且SF組和CF組樣品中的微生物尚未適應低溫環境，使樣品中的微生物生長得到一定抑制[23]，可見SF和CF處理能較好抑制金鯧魚TVB-N含量的升高。

2.4 不同凍結方式對金鯧魚質構特性的影響

水產品死后會發生自溶現象，魚肉在微生物和酶的作用下，肌肉變得柔軟，質構發生改變，彈性更小[24]。樣品在凍藏過程中，由于魚肉中水的重新分布與肌纖維蛋白的變性，其質構也會發生相應變化，最終導致其品質劣變[25]。因此，質構特性可作為反映水產品品質變化的重要指標，用于表征肌肉品質變化。

由表1可知，不同凍結方式處理的金鯧魚彈性無顯著差異，其中以OF組樣品的黏著性更高。可能由于OF組樣品內應力升高引起魚肉組織間隙或薄弱部位斷裂，形成低溫斷裂，使其蛋白質二級結構受到破壞，導致細胞間的結合力降低[26]。不同凍結方式處理樣品的咀嚼性與硬度由高至低均為：SF＞CF＞PF＞OF，回復性由高至低為：SF＞CF＞OF＞PF，這與廖媛媛等[26]的研究結果一致。結果表明，SF組和CF組快速凍結魚肉在抵抗硬物壓入或在受壓狀態下快速回復變形方面更接近CK組新鮮樣品。

表1 不同凍結方式對金鯧魚質構特性的影響Table 1 Effects of different freezing methods on texture of Trachinotus ovatus

2.5 不同凍結方式對金鯧魚保水性的影響

保水性是衡量食品品質變化的重要指標，對其食用與感官品質都會有直接影響[27]。魚肉在凍結再解凍過程中由于冰晶的形成，解凍后肌肉細胞膜和細胞器會受到損傷，其自由水含量增多，由細胞內向細胞外擴散，水分流失增大，導致其持水能力降低。由表2可以看出，SF、PF、CF和OF組樣品的持水率依次降低，CF、SF、PF和OF組樣品汁液損失率依次上升；而蒸煮損失率OF組最高，但與其他組無顯著性差異。綜上所述，OF組樣品的持水力降低最明顯，可能其凍結速率最慢，冰晶大對樣品組織破壞顯著所致，該結果與胡亞芹等[4]的研究結果類似。

表2 不同凍結方式對金鯧魚保水性的影響Table 2 Effects of different freezing methods on water retention capacity of Trachinotus ovatus

2.6 不同凍結方式對金鯧魚色澤的影響

圖4 不同凍結方式對金鯧魚色澤的影響Fig. 4 Effects of different freezing methods on color difference of Trachinotus ovatus

魚肉的色澤是影響消費者是否愿意購買的重要因素，也是評價魚肉品質的間接指標。由圖4可知，不同凍結處理后的金鯧魚L*值均比CK組高，表明各凍結組魚肉的顏色更亮，可能是凍融后樣品的肌球蛋白逐漸變性造成的[28]，其中SF組與CK組的L*值最為接近，SF組和CF組L*值較其他兩組低。

2.7 不同凍結處理組金鯧魚的LF-NMR結果

LF-NMR技術中多以氫核（1H）為研究對象，弛豫是指1H核以非輻射的形式從高能態轉變為低能態的過程，在肉與肉制品中用橫向弛豫時間T2來表征水分狀態。魚肉中不同的水分狀態根據其流動性強弱可分為結合水（T2b與T21）、不可流動水（T22）和自由水（T23）[29]。其中大分子結構中存在的水用T2b（＜1 ms）表示，與大分子結合的水用T21（1～10 ms）表示，不可移動水用T22（30～100 ms）表示，自由水用T23（＞100 ms）表示[30]。一般情況下，T2越大，表明水分流動性越強。

圖5 不同凍結方式對金鯧魚弛豫時間（T2）值變化的影響Fig. 5 Effect of different freezing methods on change in relaxation time (T2)value of Trachinotus ovatus

由圖5可知，不同凍結處理樣品的結合水含量均無明顯差異，可見凍結處理對樣品內部的結合水含量影響不明顯，可能是由于凍結狀態下水分子與大分子間結合較牢固，束縛作用較強[31]。同時，各處理組樣品T22區間的積分面積所占總積分面積比A22相對于CK組均有所降低。凍結處理導致樣品肌肉組織結構受到破壞，肌肉纖維保水性降低，不可流動水向自由水轉化，自由水的比例增加，可能是由于速凍后肌原纖維蛋白分子空間結構發生改變，即高級構象發生改變，從而影響其與水分子的結合能力。SF處理組樣品A22與CK組最為接近，說明SF處理對樣品水分流失影響最小。

2.8 不同凍結方式金鯧魚的水分分布

一般情況下，MRI圖像中的亮度越強（由加權像轉化的偽彩圖越趨紅色），即此部位的水質子信號越強，該部位的水分含量就越高。

由圖6可發現，質子密度加權像的亮度由高到低依次為SF＞CF＞PF＞OF。李俠等[32]研究發現，偽彩圖中藍色程度越高，其自由水含量越高。由圖6可知，OF組樣品藍色趨勢變化最明顯，表明其自由水含量最高，水分流失嚴重。

圖6 不同凍結方式金鯧魚的MRI圖Fig. 6 Effects of different freezing methods on pseudo color of 1H MRI of Trachinotus ovatus

2.9 不同凍結方式對樣品微觀組織結構的影響

魚肉肌肉組織的微觀結構變化可反映其品質，通常可采用光學顯微鏡直接觀察樣品肌肉微觀結構的變化。由圖7可知，CK組新鮮金鯧魚肌肉表面結構排列緊密、間隙小。樣品經凍結處理后，其肌肉表面結構變得疏松，肌纖維間隙逐漸增大，這與魯珺等[33]的研究結果一致。樣品在凍結過程中，其肌原纖維與內部結締組織的降解使魚肉的肌原纖維與肌節分離，肌原纖維間縫隙增大。而CF組與SF組樣品的肌纖維間隙小，分散均勻，形成的冰晶較小，其次是PF組。而OF組樣品組織中的間隙大，碎片數量多，可能由于該凍結方式形成的冰晶較大，對樣品的機械損傷作用更明顯，品質下降也最嚴重。

圖7 不同凍結方式對金鯧魚橫斷面微觀結構變化的影響（×100）Fig. 7 Effects of different freezing methods on cross-sectional microstructure of Trachinotus ovatus (× 100)

3 結 論

樣品經PF、SF與CF處理后，其pH值、TVB-N含量、質構特性（硬度、黏著性、彈性、咀嚼性）、色澤、保水性與肌肉組織微觀結構均優于OF。其中，CF與SF組樣品的pH值與TVB-N含量較PF和OF樣品低；其質構、L*值與保水性的下降速率也緩于其余兩組處理組樣品。由LFNMR結果分析可知，凍結后樣品的不可流動水向自由水轉化，自由水的比例增加，速凍可在一定程度上減緩水分流失的速率，OF處理對樣品水分流失影響最小。由肌肉組織的微觀結構觀察可知，CF組與SF組樣品的肌原纖維間隙小、分散均勻，組織冰晶細小，樣品的綜合品質更好。綜上所述，4 種凍結處理方式中，以SF處理的綜合效果最佳，該研究結果能為后期金鯧魚等水產品的速凍保藏提供理論參考。