不同預處理方式對鰱魚肉冷藏品質的影響及其機制

胡維杰，沈韞韜，馬 良，戴宏杰，郭 婷，周鴻媛，余 永，張宇昊

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

中國是傳統的水產品生產大國，鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）的養殖量和消費量均居我國淡水魚前列，鰱魚味甘、性平、無毒，其肉質鮮嫩、營養豐富，深受消費者的喜愛[1]。隨著人們生活水平的提高，特別是我國生鮮超市的發展、銷售冷鏈的形成[2]，消費者對魚肉的需求日益增大，并對其鮮度、安全品質等的要求也越來越高。而水產品肉質相對較嫩，在運輸貯藏過程中容易受到機械損傷，導致易受微生物侵蝕，同時在貯藏過程中，魚肉本身含有的酶也會使魚肉自溶[3]。因此，淡水魚肉的保鮮措施必須及時有效。在水產品的保鮮方法上主要集中在兩個方面：一是殺滅盡可能多的微生物；二是創造一個不適宜微生物生長同時能降低酶活性的環境[4]。很多學者在這兩個方面投入了大量的工作。

在殺滅微生物方面，郭珊珊等[5]研究了臭氧水處理-冰溫保鮮對脆肉鯇魚片品質的影響，采用臭氧水淋洗、冰溫貯藏的脆肉皖魚片貯藏期為14 d，相較于未處理樣品延長了9 d；何麗等[6]研究了鮮切草魚魚腩的減菌條件優化，經過次氯酸鈉處理后的鮮切魚腩在4 ℃條件下結合氣調包裝貯藏期可達11 d，貯藏期延長83%。楊茜[7]則研究了超高壓對冷藏帶魚段的保鮮效果，超高壓能有效抑制微生物生長和總揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量的上升，壓力越高，保壓時間越長，抑制效果越明顯，但過高的壓強使得肉質透明度、持水力下降。另外，在包裝技術方面也有大量的相關研究，真空環境、惰性氣體和弱酸性氣體環境能有效抑制微生物的生長。劉明爽等[8]研究了冷藏和微凍條件下真空包裝鱸魚片的新鮮度，真空包裝可以有效抑制微生物生長，同時與低溫條件共同作用可以有效延長貯藏期。蔣碩[9]對改性抗菌聚乙烯薄膜進行了研究，0.5 g/100 mL茶多酚和0.5 g/100 mL對羥基苯甲酸乙酯聯合1.5 g/100 mL丙酸鈣的聚乙烯醇保鮮薄膜對（4±1）℃鳊魚具有最佳的保鮮效果。奉琳娜[10]應用微凍與氣調結合的保鮮技術保藏羅非魚片的研究說明微凍氣調保鮮時，較優的氣體比例為50%（體積分數，下同）CO2+40% O2+10% N2，貯藏期可達30 d。汪金林[11]將茶多酚應用于大黃魚的保鮮、崔生輝等[12]將輻照應用于幾種水產品保藏和唐亞麗等[13]將抗菌涂膜應用于魚類保鮮上的研究都為水產保鮮提供了新的思路和方向。

目前我國鰱魚主要以活魚流通和銷售為主，近年來隨著餐飲模式的改變以及中央廚房的興起，對半成品配送市場的需求逐年增長，此外大型超市銷售的冷藏調制鰱魚塊制品的銷售量也在增加[14]，這對于鰱魚的冷藏保鮮提出了更高的要求。目前鰱魚保鮮方式主要包括殼聚糖涂膜處理[15-16]、添加茶多酚輔助保鮮[17]等，經過這些方法處理后，在4 ℃冷藏條件下，鰱魚保質期相對于未處理組可以延長3～5 d，達到1 周左右。在運輸和售賣過程中，諸多因素影響半成品及冷藏調制食品的貨架期，1 周左右的保質期無法有效滿足市場的需要，進一步研發鰱魚肉保鮮方式對延長其貨架期具有實際意義。

本實驗以鰱魚肉為對象，首先研究氣調處理、超高壓處理、ClO2協同氣調與ClO2協同超高壓處理等不同預處理方法對其保質期的影響，在此基礎上篩選效果最優的兩種方式，研究鰱魚肉預處理后冷藏過程中持水性、蒸煮損失率以及全質構等品質指標變化規律，并采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和拉曼光譜研究鰱魚肉再貯藏過程中結構變化情況，以明確貯藏期間鰱魚肉品質變化的機制，旨在為鰱魚魚肉的保鮮和貯藏提供行之有效的方法并提供初步的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鰱魚購于重慶市北碚區雄風超市，體長50 cm左右，質量1.5～2.0 kg。

二氧化氯 山東華實藥業；氧化鎂、硼酸、三氯乙酸、冰乙酸、鹽酸、體積分數95%乙醇（分析純）、平板瓊脂培養基、無菌生理鹽水（生物制劑）成都市科龍化學試劑廠；Tris、考馬斯亮藍R-250（優級純） BIO BASIC公司；質量分數30%丙烯酰胺（優級純） 北京索萊寶科技有限公司；甘氨酸（分析純） 生工生物工程（上海）有限公司；標準蛋白（分子質量10～200 kDa，分析純） 加拿大Fermentas公司。

1.2 儀器與設備

Power PacTM基礎電泳儀 美國Bio-Rad公司；8002溫控水浴鍋 北京永光明醫療儀器廠；JA3003B電子天平 上海精天電子儀器有限公司；101-4-S電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療儀器廠；CT-3質構儀 美國博勒飛公司；FSH-2A均質器 上海標模儀器廠；DZ-600-2S真空包裝機 雙豐儀器制造公司；氣調包裝機 利強儀器制造廠；DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將新鮮鰱魚擊頭宰殺、去頭、去內臟，沿脊柱切成兩片后剁成多段，取其脊背肉。切成6 cm×4 cm×1 cm左右的魚塊，分組并進行不同的處理，處理后均置于4 ℃的冰箱中冷藏20 d，并分別在冷藏1、5、10、14、15、19、20 d時隨機取樣。

氣調組：將切好的魚肉分成3 組，各組分別進行不同的氣調包裝，充氣比例為100% CO2、45% N2+55% CO2、75% N2+25% CO2。

氣調+ClO2組：將切好的魚肉分成3 組，各組首先在10 mg/L的ClO2溶液中浸泡40 min[13]，之后分別進行氣調包裝，充氣比例為100% CO2、 45% N2+55% CO2、75% N2+25% CO2。

超高壓組：將切好的魚肉進行真空包裝，之后超高壓（壓強500 MPa；保壓120 s）處理。

超高壓+ClO2組：將切好的魚肉首先在10 mg/L的ClO2溶液中浸泡40 min，真空包裝后使用超高壓處理（壓強500 MPa；保壓120 s）。

未處理組：將切好的魚肉直接真空包裝。

1.3.2 TVB-N含量的測定

TVB-N含量參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》進行測定。

1.3.3 菌落總數的測定

菌落總數參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數的測定》進行測定。

1.3.4 持水力的測定

從魚的背部取白肉，取2 g絞碎后放入離心管中。3 000×g離心5 min后稱量魚肉質量。持水力按照式（1）進行計算。

式中：m1表示離心前魚肉質量/g；m2表示離心后魚肉質量/g。

1.3.5 蒸煮損失率的測定

從魚背部取魚肉，切成2 cm×2 cm×1 cm的小塊，稱質量（m3/g），放入蒸煮鍋中蒸煮5 min后冷卻至室溫，用吸水紙吸去表面水分再次稱質量（m4/g）。蒸煮損失率按式（2）進行計算。

1.3.6 質構特性的測定

使用CT-3質構儀測定魚肉的質構特性（硬度、彈性、咀嚼性、內聚性）。質構特性測定參數設置：探頭：TA5；測試類型：TPA；測試速率：5 mm/s；觸發力：5 g。

1.3.7 SDS-PAGE分析

電泳膠的制備參照楊暉等[18]的方法進行，制備質量分數10%分離膠、5%濃縮膠，按鄭紅等[19]的方法對樣品進行前處理并電泳。用凝膠成像系統拍攝電泳圖，再通過Gene Tools軟件分析結果。

1.3.8 拉曼光譜分析

使用DRX激光共聚焦顯微拉曼光譜儀測定拉曼光譜。激光波長為785 nm，激光能量30 mW，光闌50 μm針孔。記錄400～4 000 cm-1的光譜信息。光譜分析中，樣品為貯藏期魚肉。載玻片用錫紙包裹，將少量魚肉樣品放置在載玻片上壓平。收集獲得的信號使用OMNIC軟件處理。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均重復3 次，結果均以平均值±標準差表示。采用Microsoft Excel 2016軟件對數據進行處理分析，SPSS 22軟件進行顯著性分析（多重比較采用Duncan檢驗），并用Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對魚肉貯藏14 d時TVB-N含量及菌落總數的影響

表1 不同處理對鰱魚肉貯藏14 d時TVB-N含量及菌落總數的影響Table 1 Effects of different pretreatments on TVB-N content and total number of colonies in silver carp meat after storage for 14 d

TVB-N含量和菌落總數是反映魚類產品腐敗程度的兩個重要指標，GB 2733—2015《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》要求貯藏期間淡水魚和蝦的TVB-N含量應不超過20 mg/100 g，菌落總數應不超過6（lg（CFU/g））。由表1可知，未處理或者經過單純氣調處理的鰱魚肉冷藏14 d后均已變質，在TVB-N含量和菌落總數均符合GB 2733—2015的4 組中，有2 組為ClO2協同氣調處理，其中以ClO2+100% CO2處理效果最優。另外2 組分別為超高壓處理和ClO2協同超高壓處理組，二者的保鮮效果并無顯著差異（P＞0.05）。因此，從中選出ClO2+100% CO2組與超高壓處理組，進一步分析這兩種保鮮方式處理后，冷藏過程中鰱魚肉品質變化及其機制。

2.2 不同處理對魚肉貯藏期間持水力的影響

圖1 鰱魚魚肉在貯藏期內持水力的變化Fig. 1 Change of water holding capacity in silver carp meat during storage

持水力表示在一定外力作用下，樣品束縛自身或外加水分的能力，是評價魚肉品質的一個重要指標[20]。如圖1所示，總體上，各組樣品的持水力隨貯藏時間的延長均呈下降趨勢。F組持水力下降最為明顯，從第1天的93.1%下降到第10天的52.4%，之后逐漸趨于平穩，UF組與QPF組在第10天和第19天的持水力分別為88.5%、77.6%和66.2%、58.6%，顯著高于F組（P＜0.05）。貯藏期間，在內源酶與外源微生物的共同作用下，魚肉蛋白質降解，導致持水力下降，UF組與QPF組持水力下降較緩，可能與微生物的抑制作用有關。與QPF組相比，UF組在貯藏過程中持水力保持得更好，這可能是由于超高壓處理后，魚肉蛋白之間氫鍵作用增強，導致更多的水分子被包裹[21-22]，此外，超高壓作用可以使魚肉肌纖維與肌絲之間的空間間隙增大，水分具有更大的空間被保留，這也使魚肉在貯藏過程中水分流失減緩[23]。

2.3 不同處理對魚肉貯藏期間蒸煮損失率的影響

圖2 鰱魚魚肉在貯藏期內蒸煮損失率的變化Fig. 2 Change in cooking loss rate in silver carp meat during storage

蒸煮損失主要是蒸煮過程中魚肉蛋白質聚集，導致水分和部分物質流失所致。如圖2所示，隨著貯藏時間延長，各組樣品的蒸煮損失率均呈現上升趨勢，F組蒸煮損失率從第1天的4.5%增加至第5天的28.8%，上升速率較快，第19天達到44.5%；UF組蒸煮損失率第1天為4.3%，而后呈現上升趨勢，其值始終顯著低于F組（P＜0.05）。這可能是因為一方面超高壓具有殺菌作用；另一方面超高壓更有利于熱誘導過程中肌原纖維蛋白凝膠的快速形成，使蒸煮過程中水分損失減少[24-25]。Yang Huijuan等[26]在對低鹽低脂香腸的研究中，發現經400 MPa壓強處理后的香腸，蒸煮損失率明顯下降。QPF組第1天蒸煮損失率為12.5%，高于F組，可能是因為CO2產生的弱酸性環境對蛋白質的結構穩定性有一定影響，但隨著貯藏時間的延長其增速變緩；5 d后，QPF組的蒸煮損失始終顯著低于F組（P＜0.05）。原因可能在于QPF處理具有抑菌作用，減少了蛋白質的降解，更好地保持了魚肉的完整性，降低了魚肉的蒸煮損失率。

2.4 不同處理對魚肉貯藏期間質構特性的影響

圖3 鰱魚魚肉在貯藏期內質構特性的變化Fig. 3 Change in texture properties of silver carp meat during storage

魚肉質構特性可以反映魚肉表觀品質的變化，硬度表示魚肉肌肉的緊致程度，內聚性表示魚肉的黏性，彈性表示魚肉受壓后的回復速率，咀嚼性則表示柔軟度和口感[26]。如圖3所示，在整個貯藏過程中，魚肉的硬度、內聚性、咀嚼性呈下降趨勢，彈性呈先上升后下降趨勢。綜合魚肉貯藏過程中質構特性變化情況，UF組魚肉質構品質優于F和QPF組，一方面因為超高壓對魚肉的抑菌作用明顯，降低了微生物的腐敗作用；另一方面，可能因為高壓處理后，蛋白分子間形成了更多氫鍵，使肌束排列更加緊密，魚肉的質地更加緊實，進而提升了魚肉的質構特性。QPF組質構特性略優于F組，原因可能在于CO2與ClO2協同抑菌作用下，減緩了微生物對魚肉的腐敗速率。

2.5 不同處理魚肉在貯藏期內SDS-PAGE分析

圖4 鰱魚魚肉蛋白在貯藏期內SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of silver carp meat proteins during storage

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，F組魚肉的肌球蛋白重鏈變淺，說明在貯藏過程中肌原纖維蛋白發生了降解。UF組魚肉在貯藏過程中肌球蛋白重鏈也發生了明顯降解，說明超高壓處理并不能使魚肉中內源酶失活，在劉平等[27]的研究中發現，采用超高壓技術（100～600 MPa，20 min）處理胰蛋白酶，500 MPa的超高壓處理組胰蛋白酶活性與未處理組無明顯差異。QPF組魚肉肌球蛋白重鏈并未出現明顯變淺，這可能是因為ClO2在一定程度上使內源酶失活，為了驗證ClO2對內源酶的抑制作用，將UPF組貯藏過程中的魚肉進行電泳分析，結果表明肌球蛋白重鏈條帶并未明顯變淺，說明ClO2對內源酶活性具有抑制作用。Benarde等[28]采用快速消毒取樣法，結合分光光度法和同位素示蹤法觀察了ClO2對大腸桿菌細胞壁和蛋白質合成的影響后指出，用ClO2處理細菌后其細胞內容物（蛋白質和核酸）沒有滲漏出來，說明ClO2沒有破壞細胞壁的完整性，而細胞合成蛋白質的過程卻明顯被抑制，說明ClO2對其內源性酶活性有抑制作用。

2.6 不同處理魚肉在貯藏期內拉曼光譜分析

圖5 不同處理組鰱魚魚肉貯藏期內的拉曼光譜圖Fig. 5 Raman spectra of silver carp meat with different pretreatments during storage

圖5 為不同處理組鰱魚魚肉的拉曼光譜圖，選取其中特征峰進行分析。被稱為費米共振雙峰的850 cm-1和830 cm-1處的譜峰是酪氨酸殘基對位取代苯的有關振動，采用I850/I830以表征酪氨酸殘基的暴露與包埋情況，當I850/I830大于1時，表明酪氨酸殘基在蛋白表面是暴露的，其可作為氫鍵供體或受體而與溶劑水分子相互作用；當比值為0.7～1.0時，說明酪氨酸殘基包埋在蛋白分子內部疏水環境中，可以作為氧鍵供體[29-30]。

通過比較I850/I830，發現F組從第1天的1.04降至第15天的0.85，QPF組從第1天的1.09降至0.92，說明隨著貯藏時間的延長，酪氨酸殘基由暴露轉向包埋到疏水環境中，蛋白疏水性增強，與水的氫鍵作用減弱。UF組從第1天的1.19降至第20天的1.01，說明超高壓處理對酪氨酸殘基的包埋具有抑制作用，進而抑制了蛋白疏水性的增加，UF組魚肉在貨架期間酪氨酸殘基始終處于親水微環境中，有利于蛋白中魚肉與水的氫鍵結合，這賦予了UF組樣品在貨架期內更好的持水性與質構特性[31]。

位于1 600～1 700 cm-1范圍的酰胺I帶與蛋白質骨架構象類型相關，其主要涉及肽鏈C＝O伸縮振動和N—H平面彎曲振動等。α螺旋集中于1 650～1 658 cm-1，β折疊集中于1 610～1 640 cm-1，β轉角集中于1 660～1 700 cm-1，無規卷曲集中于1 640～1 650 cm-1。

圖6 鰱魚魚肉貯藏期內蛋白質二級結構相對含量Fig. 6 Relative contents of secondary structures in silver carp meat during storage

如圖6所示，隨著貯藏時間的延長，F組α螺旋含量呈降低趨勢，無規卷曲含量呈增加趨勢，這表明魚肉蛋白在貯藏過程中結構展開，逐漸呈現無序化[32]。相對于F組，UF組第1天魚肉α螺旋含量較低，而后隨貯藏時間（1～15 d）的延長逐漸增加，15 d后呈下降趨勢，這表明超高壓處理作用后魚肉蛋白結構展開，在隨后貯藏過程中逐漸呈現有序化，證明了超高壓處理促進魚肉體系中新的氫鍵形成，使蛋白質結構呈現有序化，而貯藏約20 d后魚肉蛋白重新表現為展開，這可能與微生物的繁殖有關。QPF組在整個貯藏過程中無規卷曲含量都很低，說明其蛋白質結構較F組始終保持更加有序的狀態，原因是ClO2在一定程度上使內源酶失活，保持了蛋白質結構的完整性。

綜合電泳與拉曼光譜結果分析，兩種保鮮方式除了均有抑菌作用外，對抑制產品劣化的原因有所不同，UF組魚肉品質的改善與魚肉中新的氫鍵的形成有關，QPF組中ClO2主要對魚肉中的內源酶活性起抑制作用，更好地保持了蛋白結構的完整性，從而改善魚肉的品質特性。

3 結 論

ClO2+100% CO2氣調處理和超高壓處理的效果最好，能使鰱魚冷藏14 d以上。與未處理組相比，超高壓、氣調協同ClO2（ClO2+100% CO2）處理后魚肉冷藏過程中持水力提高，蒸煮損失率降低，質構品質提高。原因在于超高壓的殺菌作用以及超高壓處理促進魚肉體系中新的氫鍵的形成，使蛋白質結構更加有序化；而ClO2+100% CO2處理抑制了微生物的快速生長和魚肉的內源酶活性，使貯藏過程中魚肉蛋白質降解程度降低，從而改善了魚肉的品質特性。