外源p-香豆酸處理對(duì)采后桃果實(shí)苯丙烷代謝和抗氧化能力的影響

李姚瑤，曹毛毛，王小璐，蘇金龍，高 慧

（西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710069）

桃（Prunus persica L.）果實(shí)清脆爽口，細(xì)膩甘甜，富含氨基酸、維生素和酚酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是有益于人體健康的果中佳品[1]。然而，桃果實(shí)皮薄多汁，且成熟于炎熱潮濕的夏季，采后極易遭受機(jī)械損傷和微生物侵染，導(dǎo)致桃果實(shí)失水萎蔫、軟化腐爛，極大地降低了桃果實(shí)的食用品質(zhì)[2]。低溫貯藏是延緩果蔬衰老和保持果蔬品質(zhì)的有效手段。但桃屬典型的冷敏性果實(shí)，低溫貯藏過程中易受到低溫脅迫，并表現(xiàn)出果肉褐變、風(fēng)味喪失及無法正常后熟等冷害癥狀[1]。針對(duì)這一問題，研究人員進(jìn)行了桃果實(shí)冷害發(fā)生和發(fā)展機(jī)理的相關(guān)研究，并通過采取物理（如紫外照射、氣調(diào)包裝等）、化學(xué)（如鈣處理、1-甲基環(huán)丙烯熏蒸）等采后處理措施增強(qiáng)桃果實(shí)的耐冷性[3]。

p-香豆酸（p-coumaric acid，p-CA）是一種廣泛存在于果蔬中的肉桂酸衍生物，也是苯丙烷代謝途徑的核心物質(zhì)[4-5]。有研究表明，p-CA可以通過發(fā)生氧化交聯(lián)反應(yīng)參與木質(zhì)素合成，進(jìn)而維持細(xì)胞膜脂系統(tǒng)的完整性[6]；還可以通過提供質(zhì)子氫清除活性氧來抑制脂質(zhì)過氧化作用[7]。近年來，p-CA作為新型褐變抑制劑，已被用于采后園藝作物的貯藏保鮮[8]。Hu Yonghua等[9]發(fā)現(xiàn)10 μmol/L p-CA浸泡雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），在延期緩褐變發(fā)生的同時(shí)，還能延長(zhǎng)蘑菇的貨架期；這主要?dú)w因于p-CA對(duì)蘑菇酪氨酸酶活力的抑制作用。但有關(guān)p-CA對(duì)冷敏果實(shí)耐冷性影響的相關(guān)報(bào)道較少。本研究從苯丙烷代謝和抗氧化能力兩方面研究了0.5 mmol/L p-CA對(duì)采后桃果實(shí)耐冷性影響，以期為冷敏果實(shí)采后低溫貯藏保鮮提供新的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試材為商業(yè)成熟度‘沙紅'桃果實(shí)，采摘于西安市城郊果園，并于采摘當(dāng)日運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。散去田間熱后，挑選大小均一、果皮色澤一致，且無可見缺陷的桃果實(shí)用于本次實(shí)驗(yàn)。

莽草酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸基磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）、p-CA、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、輔酶A（coenzyme A，CoA）、反式肉桂酸 上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、沒食子酸 美國Sigma公司；L-苯丙氨酸 美國Amresco公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超低溫冷凍箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；TCL-20Br高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UPTC10L超純水機(jī) 優(yōu)普儀器有限公司；DIONEX UltiMate-3000高效液相色譜儀 美國Thermo Fisher公司；722G型可見分光光度計(jì) 上海儀器分析有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

將桃果實(shí)隨機(jī)分為3 組，分別用0（蒸餾水，對(duì)照）、0.5、1.0 mmol/L p-CA溶液常溫浸泡10 min，攤開晾干后，放入低密度聚乙烯保鮮袋中，于4 ℃、相對(duì)濕度85%～90%低溫庫中貯藏28 d。每隔7 d進(jìn)行取樣，測(cè)定其冷害指數(shù)和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，得到最優(yōu)濃度，并收集果肉組織于-80 ℃凍藏，測(cè)定最優(yōu)濃度組其他各項(xiàng)指標(biāo)。每組處理均設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.2 冷害指數(shù)的測(cè)定

冷害指數(shù)的測(cè)定參照Wang Lijun等[10]的方法，并略作修改。將桃果實(shí)沿縫合線剖開，觀察果實(shí)切面的褐變面積，將其分為0～4級(jí)：0級(jí)，褐變面積＝0；1級(jí)，褐變面積＜25%；2級(jí)，25%≤褐變面積＜50%；3級(jí)，50%≤褐變面積＜75%；4級(jí)，褐變面積≥75%。冷害指數(shù)按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 MDA含量的測(cè)定

MDA含量的測(cè)定參照Dhindsa等[11]的方法。稱取2 g桃果肉，加入6 mL、體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%巴比妥酸）研磨后，加熱煮沸10 min，迅速冷卻、離心。在450、532、600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液吸光度。結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)，MDA含量表示為μmol/g。

1.3.4 酚類物質(zhì)代謝相關(guān)酶活力測(cè)定

對(duì)于苯丙氨酸脫氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、莽草酸脫氫酶（shikimate dehydrogenase，SKDH）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate: coenzyme A ligase，4CL）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化氫酶（peroxidase，POD），參照Gao Hui等[12]的方法提取粗酶液并測(cè)定其活力。定義反應(yīng)體系在290 nm波長(zhǎng)處每秒吸光度升高0.01為1 個(gè)PAL活力單位（U）；反應(yīng)體系在340 nm波長(zhǎng)處每秒吸光度升高0.01為1 個(gè)SKDH、C4H活力單位（U）；反應(yīng)體系在333 nm波長(zhǎng)處每秒吸光度升高0.01定義為1 個(gè)4CL活力單位（U）；其中反應(yīng)體系在420 nm波長(zhǎng)處每秒吸光度升高0.01定義為1 個(gè)PPO活力單位（U）；反應(yīng)體系在470 nm波長(zhǎng)處每秒吸光度升高0.01為1 個(gè)POD活力單位（U）。以上酶活力單位均為U/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.5 內(nèi)源p-CA含量的測(cè)定

內(nèi)源p-CA的提取：稱取6 g桃果肉，加入35 mL甲醇勻漿后，超聲30 min，離心，收集上清液，殘?jiān)貜?fù)提取2 次。將合并上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL左右，以色譜純甲醇定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，收集濾液備用。

測(cè)定條件：流動(dòng)相：A為甲醇，D為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸；洗脫梯度：0～5 min，85%～78% D；5～10 min，78%～70% D；10～15 min，70%～64% D；15～16 min，64%～85% D；流速1 mL/min，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)308 nm，進(jìn)樣量10 μL，時(shí)長(zhǎng)16 min。檢測(cè)器：UltiMate-3000二極管陣列檢測(cè)器，色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。以外標(biāo)法測(cè)定內(nèi)源p-CA含量，單位為μg/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.6 總酚含量的測(cè)定

參照Hinneburg等[13]的方法測(cè)定。稱取2 g桃果肉于6 mL 80%甲醇勻漿，離心后，收集上清液作為總酚粗提液。取0.5 mL上清液，依次加入1 mL福林-酚試劑、3 mL 1 mmol/L Na2CO3溶液，混勻后，以蒸餾水定容至10 mL，避光反應(yīng)1 h，760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總酚含量。結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)，總酚含量表示為mg/g。

1.3.7 DPPH自由基、羥自由基、O2-·清除率測(cè)定

以總酚粗提液進(jìn)行測(cè)定。參照Odriozola-Serrano等[14]的方法測(cè)定DPPH自由基清除率。取0.2 mL上清液，加入2.8 mL 0.15 mmol/L DPPH甲醇溶液，避光反應(yīng)30 min。于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

參照Zhuang Hong等[15]的方法測(cè)定羥自由基清除率。取0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、0.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL上清液、5.4 mL蒸餾水和0.1 mL 8.8 mmol/L H2O2混合搖勻后，37 ℃水浴30 min。于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

參照陳旭丹等[16]的方法測(cè)定O2-·清除率。取2.7 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）和0.2 mL上清液，25 ℃水浴20 min，加入0.1 mL 1.5 mmol/L連苯三酚。于320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

DPPH自由基、羥自由基、O2-·清除率均按式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：A0為以甲醇代替總酚粗提液吸光度；A1為含總酚粗提液樣品吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上指標(biāo)測(cè)定均取3 個(gè)平行樣，重復(fù)測(cè)定3 次。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05為差異顯著。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)冷害指數(shù)和MDA含量的影響

表1 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)冷害指數(shù)和MDA含量的影響Table 1 Effect of p-CA treatment on CI index and MDA content in peach fruit

如表1所示，對(duì)照桃果實(shí)貯藏期間，其冷害指數(shù)隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。與對(duì)照處理（0 mmol/L p-CA）相比，0.5 mmol/L p-CA處理可顯著抑制桃果實(shí)冷害的發(fā)生（P＜0.05）；而相較于0.5 mmol/L p-CA處理，1.0 mmol/L p-CA處理則促進(jìn)了桃果實(shí)冷害指數(shù)的增加。貯藏第28天時(shí)，0.5 mmol/L p-CA處理桃果實(shí)的冷害指數(shù)較對(duì)照果實(shí)降低60.71%。MDA是細(xì)胞膜脂過氧化終產(chǎn)物，其含量可反映桃果實(shí)冷害發(fā)生的嚴(yán)重程度。對(duì)照桃果實(shí)MDA含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)亦呈緩慢上升趨勢(shì)變化，0.5 mmol/L p-CA處理顯著抑制了桃果實(shí)MDA含量的增加（P＜0.05），而1.0 mmol/L p-CA處理則與0.5 mmol/Lp-CA處理相比，促進(jìn)了桃果實(shí)MDA的累積。貯藏結(jié)束時(shí)，0.5 mmol/L p-CA處理桃果實(shí)的MDA含量較對(duì)照桃果實(shí)降低12.69%。因此，選定0.5 mmol/L p-CA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)酚類物質(zhì)合成相關(guān)酶活力的影響

圖1 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)酚類物質(zhì)合成相關(guān)酶活力的影響Fig. 1 Effect of p-CA treatment on the activities of phenolic synthesis enzymes in peach fruit

SKDH是催化莽草酸生成L-苯丙氨酸的關(guān)鍵酶。如圖1A所示，對(duì)照桃果實(shí)的SKDH活力在貯藏的前21 d逐漸降低，隨后上升。貯藏第21天時(shí)，對(duì)照桃果實(shí)的SKDH活力較采收當(dāng)天降低67.85%。p-CA處理顯著提高了桃果實(shí)的SKDH活力（P＜0.05），貯藏末期時(shí)，p-CA處理桃果實(shí)的SKDH活力為對(duì)照桃果實(shí)的1.67 倍。

PAL、C4H、4CL是苯丙烷代謝途徑的3 個(gè)關(guān)鍵酶。如圖1B所示，對(duì)照和p-CA處理桃果實(shí)的PAL活力變化趨勢(shì)相似，貯藏前14 d緩慢上升隨后逐漸下降，并于貯藏第14天達(dá)到峰值，其中p-CA處理桃果實(shí)的PAL活力為對(duì)照桃果實(shí)的1.20 倍。且整個(gè)貯藏期內(nèi)，p-CA處理桃果實(shí)的PAL活力始終顯著高于對(duì)照桃果實(shí)（P＜0.05）。

如圖1C、D所示，p-CA處理顯著提高了桃果實(shí)的C4H和4CL活力（P＜0.05）。p-CA處理桃果實(shí)的C4H和4CL活力在貯藏第21天均出現(xiàn)峰值，其活力分別為對(duì)照桃果實(shí)的1.45 倍和1.22 倍。整個(gè)貯藏期內(nèi)，p-CA處理桃果實(shí)的C4H和4CL活力始終高于對(duì)照桃果實(shí)。

2.3 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)酚類物質(zhì)氧化相關(guān)酶活力的影響

PPO和POD是苯丙烷代謝途徑末端的兩個(gè)氧化酶，可氧化果蔬中酚類化合物形成褐色物質(zhì)。如圖2A所示，整個(gè)貯藏期內(nèi)，對(duì)照和p-CA處理桃果實(shí)的PPO活力呈下降、升高波動(dòng)趨勢(shì)變化，并于貯藏第14天出現(xiàn)峰值，此時(shí)對(duì)照桃果實(shí)的PPO活力較p-CA處理桃果實(shí)高16.67%。如圖2B所示，對(duì)照桃果實(shí)的POD活力呈先升高再降低再升高趨勢(shì)變化。貯藏結(jié)束時(shí)，對(duì)照桃果實(shí)的POD活力是p-CA處理桃果實(shí)的1.26 倍。P-CA處理顯著抑制了桃果實(shí)的PPO和POD活力（P＜0.05）。

圖2 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)酚類物質(zhì)氧化相關(guān)酶活力的影響Fig. 2 Effect of p-CA treatment on phenolic oxidase activity in peach fruit

2.4 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)中內(nèi)源p-CA和總酚含量的影響

圖3 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)中內(nèi)源p-CA（A）和總酚（B）含量的影響Fig. 3 Effect of p-CA treatment on endogenous p-CA (A) and total phenolic (B) contents of peach fruit

p-CA是植物苯丙烷代謝途徑的核心物質(zhì)。如圖3A所示，對(duì)照桃果實(shí)的內(nèi)源p-CA含量呈先上升后下降趨勢(shì)變化。p-CA處理顯著增加了桃果實(shí)的內(nèi)源p-CA含量（P＜0.05），貯藏第14天時(shí)，p-CA處理桃果實(shí)的內(nèi)源p-CA含量是果實(shí)貯藏第0天的14.47 倍。如圖3B所示，對(duì)照桃果實(shí)的總酚含量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，貯藏結(jié)束時(shí)，對(duì)照桃果實(shí)的總酚含量比果實(shí)貯藏第0天低37.65%。p-CA處理顯著誘導(dǎo)了桃果實(shí)總酚含量的增加（P＜0.05）。貯藏前14 d，p-CA處理桃果實(shí)總酚含量緩慢增加并于第14天達(dá)到峰值，此時(shí)總酚含量為對(duì)照桃果實(shí)的1.64 倍，隨后總酚含量逐漸下降直至貯藏結(jié)束。整個(gè)貯藏期內(nèi)，p-CA處理桃果實(shí)的總酚含量始終高于對(duì)照桃果實(shí)。

2.5 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)DPPH自由基、羥自由基、清除率的影響

如圖4所示，在貯藏的前14 d，對(duì)照桃果實(shí)的DPPH自由基、羥自由基、O2-·清除率逐漸下降，之后趨于穩(wěn)定；相關(guān)性分析顯示，對(duì)照桃果實(shí)中總酚含量與DPPH自由基、羥自由基清除率呈顯著正相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為0.989 5和0.991 7；對(duì)照果實(shí)中總酚含量和O2-·清除率呈一定正相關(guān)關(guān)系（r＝0.592 9）。p-CA處理顯著提高了桃果實(shí)對(duì)3 種自由基的清除率（P＜0.05），且p-CA處理桃果實(shí)中內(nèi)源p-CA含量與DPPH自由基、羥自由基和O2-·清除率呈顯著正相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)r分別為0.913 5、0.968 3和0.878 6；p-CA處理桃果實(shí)中總酚含量與3 種自由基的清除率呈一定正相關(guān)關(guān)系。

圖4 p-CA處理對(duì)桃果實(shí)DPPH自由基（A）、羥自由基（B）、（C）清除率的影響Fig. 4 Effect of p-CA treatment on scavenging capacity against DPPH (A),hydroxyl (B) and superoxide anion (C) radical in peach fruit

3 討 論

桃果實(shí)是典型的冷敏性果實(shí)，采后不適宜低溫貯藏且極易遭受低溫傷害，尤以2.2～7.6 ℃時(shí)更為嚴(yán)重，并表現(xiàn)出果肉褐變、失去果實(shí)原有風(fēng)味和更易遭受微生物侵襲等冷害癥狀，這嚴(yán)重影響了其市場(chǎng)價(jià)值[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-CA是一種廣泛存在于果蔬中的小分子酚酸，其外源處理可顯著抑制桃果實(shí)冷害指數(shù)的增加，大大提高了桃果實(shí)的耐冷性（表1）。與p-CA相似，小分子酚酸（如水楊酸）已被證實(shí)可有效緩解低溫脅迫對(duì)桃果實(shí)造成的損傷，延緩冷害的發(fā)生[17]。

低溫脅迫下，果蔬組織的胞內(nèi)活性氧代謝失衡，這使得自由基大量累積。累積的自由基可引發(fā)和或加劇膜脂過氧化，進(jìn)而造成細(xì)胞膜脂系統(tǒng)的損傷[18]。MDA含量的高低可衡量細(xì)胞膜脂過氧化程度。本研究中，p-CA處理能顯著抑制桃果實(shí)MDA含量的增加（表1）。這表明p-CA處理可有效提高桃果實(shí)對(duì)低溫誘導(dǎo)氧化脅迫的抵御能力，抑制膜脂過氧化導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷。這與草酸、水楊酸等外源處理桃果實(shí)的研究結(jié)果[19-20]一致。

有研究表明，酚類物質(zhì)在植物抵御低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[21]。這基于酚類物質(zhì)可提供質(zhì)子氫清除活性氧，或通過分解過氧化物，減輕植物氧化損傷程度，維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能[22]。苯丙烷代謝途徑是酚類物質(zhì)的生物合成途徑，SKDH、PAL、C4H和4CL是此途徑中主要的合成代謝相關(guān)酶[23-24]。其中，SKDH催化莽草酸生成L-苯丙氨酸[23]，之后L-苯丙氨酸在苯丙烷代謝關(guān)鍵限速酶PAL的作用下被轉(zhuǎn)化為肉桂酸[25]。C4H則催化肉桂酸發(fā)生羥化反應(yīng)生成p-CA，4CL作用于此途徑的最后一步反應(yīng)[21]。SKDH、PAL、C4H和4CL活力的高低與果實(shí)中酚類物質(zhì)的含量直接相關(guān)[26]。經(jīng)外源水楊酸處理的葡萄果實(shí)，其PAL、C4H和4CL活力顯著升高，且水楊酸處理還誘導(dǎo)了PAL、C4H和4CL 3 種酶mRNA的累積[27]，進(jìn)而誘導(dǎo)了酚類物質(zhì)的合成。本研究中，p-CA處理激活了SKDH、PAL、C4H和4CL活力（圖1），且p-CA處理果實(shí)含有較高的總酚含量（圖3B）。因此，推測(cè)p-CA處理可能通過誘導(dǎo)酚類物質(zhì)合成酶相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)總酚的累積。其中所涉及的具體機(jī)制將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步明確。PPO和POD可協(xié)同催化酚類物質(zhì)氧化形成醌，醌再進(jìn)一步聚合成棕色聚合物，致使果蔬褐變。在桃果實(shí)上，較高的PPO和POD活力已被證實(shí)與冷害導(dǎo)致的果肉褐變直接相關(guān)。本研究中，在整個(gè)貯藏過程中，與對(duì)照果實(shí)相比，p-CA處理果實(shí)的PPO和POD活力被顯著抑制（圖2），這使得酚類底物的氧化消耗減少（圖3B），減輕了桃果實(shí)果肉褐變的冷害癥狀。本研究結(jié)果與Luo Zisheng等[28]的結(jié)果一致，該研究認(rèn)為外源水楊酸處理通過調(diào)控PPO和POD活力顯著減輕李果實(shí)果肉褐變，延緩冷害的發(fā)生。p-CA與酪氨酸結(jié)構(gòu)相似，此二者可競(jìng)爭(zhēng)PPO的活性位點(diǎn)[8]，這可能是p-CA處理抑制桃果實(shí)PPO活力的機(jī)理。此外，p-CA處理還顯著增加了桃果實(shí)的內(nèi)源p-CA含量（圖3A），這與Yang Zhenfeng等[29]的研究結(jié)果一致，即基于滲入，外源水楊酸處理可顯著提高桃果實(shí)的內(nèi)源水楊酸含量。

酚類物質(zhì)是果蔬組織內(nèi)一類重要的非酶抗氧化劑。盧娟芳等[30]認(rèn)為，桃果實(shí)中酚類物質(zhì)含量的高低與其抗氧化活性直接相關(guān)。本研究中，p-CA處理果實(shí)含有較高的內(nèi)源p-CA和總酚含量，且內(nèi)源p-CA含量均與DPPH自由基、羥自由基、O2-·清除率呈顯著正相關(guān)。這表明p-CA處理可通過提高自由基清除能力，提高桃果實(shí)對(duì)低溫冷害的抵御能力。