液浸速凍對牡蠣水分遷移及品質的影響

梁鉆好，陳海強，梁鳳雪，羅宏悅，謝彥安，余 銘,

（1.陽江職業技術學院食品與環境工程系，廣東 陽江 529566；2.廣東省食品低溫加工工程技術研究中心，廣東 陽江 529566；3.陽江市程村鎮政府，廣東 陽江 529821；4.陽西縣程村鎮紅光蠔協會，廣東 陽江 529821）

牡蠣，又被稱為蠔、生蠔，是目前我國乃至世界產量最大的經濟貝類[1]。牡蠣以鮮銷為主，但是高含水量（約80%）的牡蠣離水只能存活3～5 d，開殼后的牡蠣肉更不耐貯存[2]。冷凍能有效延長牡蠣肉的貨架期[3]，但冷凍過程中大冰晶的形成、水分的遷移與凍結會導致蛋白質變性、細胞機械破損，解凍后汁液流失嚴重，影響肉質和口感[4]。冰晶的大小和分布與冷凍速率密切相關，冷凍速率越大，食品內部通過-1～-5 ℃“最大冰晶生成”溫區的時間越短，形成細小的胞內晶。因此，冷凍速率是影響冷凍產品品質的重要因素，尋找一種快速冷凍技術是解決牡蠣由于冷凍變性而導致品質下降的主要途徑。在食品工業中，目前常用的快速冷凍方式有鼓風冷凍、平板速凍、流化床冷凍和低溫冷凍，它們的共同點是以氣體作為傳熱介質。由于液體傳熱系數是氣體的20多倍；因此，與傳統的空氣對流冷凍方式相比，把食品直接浸泡在制冷液中的液浸速凍方式具有冷凍速率快、冷凍均勻、能耗低、干耗小的優勢，形成的冰晶細小致密且分布均勻，避免了冰晶膨大引起的機械損傷和細胞脫水[5]。研究證明，一些果蔬[6-8]、漿汁[5]、水產[9-11]通過液浸速凍技術冷凍可最大限度保留食品原有的感官和品質。雖然關于液浸速凍方面的研究還不夠系統，但該技術是目前快速冷凍技術中比較具有產業化前景的技術[8]。

低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）通過測定質子在磁場中的弛豫特性來研究樣品中水分的含量、分布、遷移及其他相關品質性質[12]，其靈敏度高，且為無損檢測，在肉類[13]、水產[14-15]、果蔬[12]、酸奶[16]等多種食品的品質鑒定中均有應用。如通過利用LF-NMR研究食品水分遷移與分布特性，可以得出粉末的分子質量與吸濕性的關系并以此推定貯藏穩定性[17]，或是跟蹤干燥過程的水分動態從而監測干燥速率和食品干燥過程中的質構特性[18-19]。本研究基于LF-NMR技術分析牡蠣凍結后水分含量及遷移的變化，表征冷凍方式對牡蠣品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍液為體積分數95%乙醇溶液；牡蠣由紅光蠔協會提供。

牛血清白蛋白、Ca2+-ATPase測試盒 南京建成生物工程研究所；氯化鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設備

MesoMR23-040V-I NMR成像分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；KQ-01液浸式速凍機 廣東科奇超速凍科技有限公司；小型氣流式速凍機 常州凱曼制冷設備有限公司；CT3質構儀 美國博勒飛公司；TR-52i溫度記錄儀 日本TANDD公司；BD/BC-768Q臥式冰柜 雪花（北京）科技有限公司；BC/BD-208DT臥式冷柜 合肥美菱股份有限公司；JD-8S型真空包裝機廈門捷鼎機械設備有限公司；SY204分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；FJ200-SH數顯高速分散均漿機上海標本模型廠；TGL-18M臺式高速冷凍離心機 廣東省農墾集團進出口有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理、凍結與解凍

清洗干凈的牡蠣開殼，挑選新鮮無損傷、大小一致（質量為7～12 g）的牡蠣肉進行獨立真空包裝（真空時間約20 s，牡蠣不變形）。樣品于4 ℃冰柜預冷1 h，后隨機分成5 組進行不同的冷凍處理：1）對照（鮮樣）；2）-18 ℃冰柜中靜置冷凍；3）氣流速凍機中冷凍（凍結溫度根據液浸速凍最優溫度選擇）；4）液浸速凍，凍結溫度分別為-10、-18、-25、-35、-45 ℃和-55 ℃；5）-80 ℃超低溫冷凍。

當牡蠣中心溫度凍至-18 ℃以下時，停止凍結，將樣品迅速轉移至-18 ℃冰柜中貯藏待用（24 h以內）。測定指標前先把牡蠣樣品轉移至4 ℃冰柜中解凍2 h，用于理化指標的測定。對照組直接用于理化指標的測定。

1.3.2 凍結曲線和凍結速率的測定

凍結曲線和凍結速率的測定參考文獻[20]。將溫度記錄儀傳感探頭插至牡蠣肉的中心位置，每隔1 s記錄一次溫度，待樣品中心溫度降至-18 ℃以下終止凍結，根據牡蠣肉中心溫度隨時間的變化，繪制凍結曲線。凍結速率采用國際制冷協會提出的方法（式（1））計算。

式中：δ0表示食品表面與熱中心的最短距離/cm；τ0表示食品表面達到0 ℃后至熱中心溫度達初始凍結點以下10 ℃所需的時間/h。

1.3.3 理化指標測定

1.3.3.1 汁液流失率的測定

汁液流失率的測定參考文獻[21]。用濾紙吸干牡蠣表面水分或汁液，分別稱量解凍前后牡蠣質量，汁液流失率按式（2）計算。

1.3.3.2 蒸煮損失率的測定

蒸煮損失率的測定參考文獻[22]。牡蠣樣品85 ℃恒溫水浴20 min，冷卻至室溫后用濾紙吸干表面水分或汁液，分別稱量蒸煮前后牡蠣質量。蒸煮損失率按式（3）計算。

1.3.3.3 鹽溶性蛋白含量的測定

鹽溶性蛋白含量的測定參考文獻[9]。準確稱取3.00 g樣品，加入30 mL 0.6 mol/L KCl溶液（4 ℃預冷），冰水浴中均質4 min，4 ℃離心（5 000 r/min、20 min），取上清液3 mL，加入9 mL去離子水（4 ℃預冷）使肌動球蛋白沉淀，4 ℃離心（5 000 r/min、20 min），取沉淀，加入3 mL 1.2 mol/L KCl溶液（4 ℃預冷），繼續4 ℃離心（5 000 r/min、20 min），取上清液備用。采用雙縮脲法測定鹽溶性蛋白含量。

1.3.3.4 Ca2+-ATPase活力的測定

Ca2+-ATPase活力的測定參考文獻[9]。準確稱取3.00 g樣品，加入9 倍體積的8.5 g/L NaCl溶液（4 ℃預冷），在冰水浴中均質搗碎，4 ℃離心（5 000 r/min，10 min），取上清液，加入8.5 g/L NaCl溶液稀釋到合適的質量濃度，按Ca2+-ATPase測試盒說明書上的方法進行測定。

1.3.3.5 彈性的測定

以整只牡蠣為測定對象，沸水加熱3 min熟化，取出瀝水，待降至室溫后采用CT3質構儀測定。設置參數如下：探頭型號TA44，測前探頭下降速率2.00 mm/s，測試速率1.50 mm/s，測后探頭回程速率1.50 mm/s，形變50.0%，觸發值25 g；實驗類型：壓縮。

1.3.3.6 LF-NMR的測定及成像分析

選取質量約為10.00 g的整只牡蠣，濾紙吸干表面汁液，稱質量，真空包裝，進行NMR測定，然后凍結處理，解凍后吸干表面汁液再次進行NMR測定。

測定方法：放入玻璃試管（口徑40 mm），然后將樣品管置于核磁探頭中，使用CPMG序列測定橫向弛豫時間T2。其中參數設置如下：磁體溫度32 ℃；重復采樣等待時間TW＝2 500.00 ms；重復采樣次數NS＝8；回波時間TE＝0.20 ms；回波個數NECH＝12 500；采樣帶寬SW＝200 kHz。模擬增益RG1＝20.0 db；數字增益DRG1＝3 db；前置放大器增益PRG＝1 db。

核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）分析，參數設置：層數＝1；層厚＝3.0 mm；視野FOV＝100 mm×100 mm；重復采樣次數Average＝2；重復采樣等待時間TR＝2 000.00 ms；回波時間TE＝18.125 ms。根據鮮樣和處理樣的各峰信號幅度變化計算不同狀態水分的損失率。

1.4 數據處理與分析

實驗數據采用Execl 2010軟件進行處理和作圖，橫向弛豫時間T2反演圖采用Origin 8.0軟件作圖。統計學分析采用SPSS 17軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 凍結溫度對液浸速凍牡蠣的品質影響

凍結過程中大冰晶的形成會對牡蠣肉的細胞造成機械損傷，導致細胞持水性能變差，表現為解凍后汁液流失和蒸煮損失嚴重、彈性變差或無彈性。如表1所示，凍結溫度對牡蠣解凍后的汁液流失率和彈性影響不顯著（P＞0.05），可能是由于液浸速凍傳熱快，凍結速率較快（牡蠣凍至中心溫度低于-18 ℃用時2～15 min）。蒸煮損失方面，-10 ℃冷凍的牡蠣蒸煮損失略大，-55～-18 ℃之間的差異不顯著。總體而言，液浸速凍對冷凍牡蠣的汁液流失率、蒸煮損失率、彈性影響不大，可維持牡蠣良好的持水能力。

表1 不同溫度下液浸速凍的牡蠣品質（n＝6）Table 1 Quality of oysters subjected to immersion freezing at different temperatures (n= 6)

牡蠣蛋白由水溶性的肌漿蛋白、鹽溶性的肌原纖維蛋白和不溶性的基質蛋白組成。冷凍過程中的蛋白變性主要是由肌原纖維蛋白變性引起的，牡蠣在凍結過程中，肌原纖維蛋白發生冷凍變性導致其鹽溶性發生變化，鹽溶性蛋白含量減少[23]。Ca2+-ATPase活性來源于肌原纖維蛋白中的肌球蛋白，可表征肌原纖維蛋白頭部S-1片段的性質，是衡量蛋白質冷凍變性程度的另一重要指標[24]。由表1可知，與鮮樣相比，冷凍牡蠣的鹽溶性蛋白含量以及Ca2+-ATPase活力均有不同程度的下降，表明在冷凍過程中牡蠣的肌原纖維蛋白發生變性[25-26]。液浸漬溫度從-10 ℃降到-35 ℃過程中，隨著凍結速率加快，牡蠣鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活力的下降程度降低，-35 ℃凍結的牡蠣樣品鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活力與鮮樣最接近，二者之間無顯著差異（P＞0.05）。但隨著凍結溫度繼續降低，牡蠣的鹽溶性蛋白含量反而下降，這可以解釋為凍結速率過快，小冰晶過細，在凍藏過程中會因為冷藏設備的溫度波動而導致部分小冰晶更容易融化，融化后的冰水又在低溫下重新結冰，即發生融化再重結晶的現象[27]，此時再結晶更容易被旁邊的冰晶吸收，形成大冰晶。在此過程中，可能有以下原因導致蛋白變性：大冰晶的擠壓導致蛋白聚集變性；水分遷移形成大冰晶的過程導致蛋白質的水合狀態發生改變；體系水化程度降低導致蛋白質開鏈[28]。

總體分析，-35 ℃凍結的牡蠣汁液流失和蒸煮損失較少，可保持牡蠣肉固有的良好彈性，鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活力與鮮樣無顯著差異（P＞0.05），品質保持最佳。

2.2 凍結方式對牡蠣水分遷移變化的影響

根據2.1節凍結溫度篩選，確定-35 ℃為最優液浸速凍溫度，同時對比-18 ℃靜置冷凍、-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍效果。

2.2.1 凍結曲線

圖1 牡蠣凍結曲線Fig. 1 Freezing curve of oysters

表2 牡蠣不同冷凍方式的凍結速率（n＝3）Table 2 Freezing speeds of different freezing methods of oysers (n= 3)

由圖1和表2可知，-35 ℃液浸速凍的牡蠣中心溫度降至-18 ℃僅需要5.48 min，用時最短，凍結曲線最為陡峭，凍結速率最大，高達13.03 cm/h，按凍結速率等級劃分，屬于超速凍結（凍結速率＞10 cm/h）。-35 ℃液浸速凍的凍結速率是-18 ℃靜置冷凍的40.7 倍，分別是-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍的5.54、5.94 倍。-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍的凍結曲線也較為陡峭，二者的凍結速率和牡蠣中心溫度通過-1～-5 ℃最大冰晶生成區的時間無顯著性差異（P＞0.05），屬于快速凍結（食品中心溫度通過-1～-5 ℃最大冰晶生成區的時間不超過30 min）。-18 ℃靜置冷凍屬于慢速凍結（凍結速率＜0.5 cm/h，食品中心溫度通過-1～-5 ℃最大冰晶生成區的時間超過30 min），其凍結曲線在-1～-5 ℃區間非常平緩。

大部分食品中心溫度從-1 ℃降至-5 ℃時，近80%的水分可凍結成冰，此溫度范圍稱為“最大冰晶生成區”。一般凍結速率越快，通過-1～-5 ℃溫區的時間越短，冰層向內伸展的速率比水分移動速率要快時，其冰晶就越細小，冰晶分布越接近新鮮物料中原來水分的分布狀態。-35 ℃液浸速凍的牡蠣通過最大冰晶生成區時間僅需2.15 min，其凍結速率比-35 ℃氣流冷凍或-80 ℃超低溫冷凍快約5 倍。

2.2.2 凍結方式對牡蠣水分分布的影響

鮮樣和凍結后解凍的牡蠣樣品LF-NMR橫向弛豫時間T2反演的標準譜圖見圖2。橫向弛豫時間T2反映了樣品內部氫質子的自由度及其所受束縛力的大小，且與其成反比關系[12]。牡蠣的T2反演圖有4 個峰，分別標記為T21、T22、T23、T24。其中T21（0.2 ms）為強結合水，T22（2.3～3.5 ms）為弱結合水，T23（57～73 ms）為不易流動水，T24（460～650 ms）為自由水。4 種凍結方式的牡蠣解凍后的T21峰和T22峰與鮮樣差異不大，但T24峰的幅度均有明顯降低，而T23峰幅度也有不同程度的降低。這表明，凍結對牡蠣的結合水影響不大，解凍后自由水大量流失，不易流動水因凍結方式不同，損失率不同。

圖2 牡蠣凍結前與解凍后的橫向弛豫時間T2反演圖Fig. 2 Signal amplitude curves as a function of transverse relaxation time T2 for oysters before freezing and after thawing

圖3 牡蠣解凍后的不同狀態水分的損失率Fig. 3 Water loss of oysters after thawing

牡蠣在解凍后不易流動水和自由水與鮮樣對比有不同程度的損失，表現為汁液流失。圖3A顯示，4 種凍結方式中，-18 ℃靜置冷凍的牡蠣解凍后不易流動水損失率顯著高于其他組（P＜0.05），高達12%以上，其次是-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍，損失率分別為6.70%和4.75%，二者無顯著差異（P＞0.05），-35 ℃液浸速凍牡蠣的不易流動水損失率最少（2.11%），僅分別為-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍的31.5%、44.4%。自由水束縛力最小，4 種凍結方式的牡蠣解凍后自由水損失率在81%～87%之間，差異不顯著（P＞0.05）。

不易流動水存在于牡蠣肌原纖維細胞間質和肌原纖維細胞內，凍結解凍可能導致牡蠣肌纖維蛋白結構變化，引起水分遷移、變化[29]。而且不易流動水是牡蠣水分的主要存在狀態，約占3 種水分的90%（通過T2反演圖峰面積計算），因此這部分水的損失直接影響到整體的汁液流失率。凍結方式導致牡蠣解凍后不易流動水損失率的差異可以歸結于凍結速率，-18 ℃靜置冷凍方式的凍結速率最慢（圖1），凍結速率最小，細胞間隙的冰晶最大，刺破細胞膜，產生許多通道，可以使細胞內容物在解凍時流出[30-31]；與此相反，液浸速凍速率最快，液浸速凍牡蠣的水分損失最少。

2.2.3 不同凍結方式牡蠣的MRI

MRI偽彩圖中的顏色深淺反映了質子密度不同引起的弛豫時信號強弱差別[32]。由圖4中可知，-35 ℃液浸速凍的牡蠣解凍后，肉體內部有大面積黃紅色區域，表明該區域水分含量較高，與鮮樣對比的信號差值圖顯示，肉體邊緣信號差值較低（綠色），內部基本無信號差值（藍色），即解凍后牡蠣樣品邊緣有少量汁液流失，肉體內部的水分含量和分布與鮮樣的差異不大。這一結果與上述液浸速凍牡蠣不易流動水損失最少的結論一致。其他3 種凍結方式處理的牡蠣解凍后，NMR信號值普遍較低，僅有零星小面積的黃色區域，與鮮樣對比的信號差值圖整體偏藍綠色，或略微帶黃色。這表明其他3 種凍結方式處理的牡蠣解凍后整體均有汁液流失，細胞持水性減弱。

圖4 牡蠣鮮樣與解凍后的MRI偽彩圖Fig. 4 Magnetic resonance images of fresh oysters and frozen-thawed oysters

3 結 論

本研究采用液浸速凍方式凍結牡蠣，對解凍后的牡蠣進行品質分析，得出液浸速凍的最佳凍結溫度為-35 ℃，此凍結溫度下的牡蠣汁液流失和蒸煮損失較少，能較好地保持牡蠣肉固有的良好彈性，鹽溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活力與鮮樣之間無顯著差異（P＞0.05），品質保持最佳。而且按凍結速率區分，-35 ℃液浸速凍屬于超速凍結。以-18 ℃靜置冷凍、-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍作對照，通過LF-NMR測定凍結后解凍的牡蠣水分含量和分布，結果表明：不同凍結方式的牡蠣解凍后的不易流動水和自由水均有明顯損失，凍結方式對牡蠣自由水損失率無顯著影響，但對不易流動水損失率影響顯著，其中-35 ℃液浸速凍牡蠣的不易流動水損失率最小，僅分別為-35 ℃氣流冷凍和-80 ℃超低溫冷凍的31.5%和44.4%。MRI成像也得出類似結論。