高溫蒸汽處理對余甘子果汁貯藏期間的品質影響及褐變行為解析

徐 涓，張雯雯，李 凱，李 坤，劉蘭香，馬金菊，甘 瑾，張 弘

（中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，國家林業和草原局特色森林資源工程技術研究中心，云南 昆明 650224）

余甘子（Phyllanthus emblica L.），別名庵摩勒迦果、山油柑、滇橄欖等，是大戟科葉下珠屬灌木或落葉小喬木植物，因其初入口味酸澀、后回甜生津而得名[1-2]。在我國余甘子的主要產地為福建、海南、云南、廣東、廣西、四川、貴州等省，作為藥食兼用植物，也被世界衛生組織指定為在全世界推廣種植的保健植物之一，近年來被大量栽培，資源豐富[3]。中醫學認為余甘子具有利咽生津、化痰止咳、護肝、改善動脈硬化、抗氧化、抗菌、抗疲勞、抗糖尿病、抗腫瘤等功效[4-7]，且其果實中含有豐富的多酚、多糖、維生素以及黃酮等化合物[8-10]。余甘子主要用于功能飲料（如余甘子果汁和果酒飲料）和功能食品（余甘子含片、余甘子果粉等）[11]的開發，而較常見的加工方式是將余甘子榨汁，但果汁在貯藏過程中，褐變現象嚴重，不僅產品顏色發生變化，其營養成分也發生不同程度的損失，降低了余甘子產品的商品價值。為了保留余甘子的有效成分，使其價值最大化，需采取有效措施控制余甘子果汁的褐變現象。普遍認為果汁在加工和貯藏過程中的褐變包括酶促褐變和非酶促褐變，可通過熱處理或添加抗氧化劑等方法來抑制酶促褐變的發生[12-13]，潘少香等[14]的研究結果表明蒸汽熱燙處理后的生姜汁能保持良好的色澤、高含量的總酚和姜辣素以及生姜的典型香氣成分；汪良峰等[15]發現合適的蒸汽處理蘋果果漿，可達到滅酶防褐變、改善果漿品質的效果；而非酶促褐變較復雜，目前認為導致非酶促褐變的主要原因有：VC氧化分解、多酚類物質氧化聚合反應、美拉德（Maillard）反應以及焦糖化反應等[16-17]。陳雪梅等[18]研究了5 ℃貯藏條件下余甘子中沒食子酸、單寧酸等成分含量的變化；甘瑾等[19]檢測余甘子果汁在貯藏過程中VC含量的變化；但目前余甘子果汁在貯藏過程中的褐變反應類型及其內源因子尚不清楚，導致實際控制褐變的措施缺乏針對性和有效性。

通徑分析是一種多變量分析方法，能有效地得出相關變量間因子對結果的直接影響效應，同時能推導出自變量與因變量間的間接效應，從而能直接比較各因素的相對重要性[20-21]。本研究通過高溫蒸汽預處理鈍化余甘子果中的酶活性，檢測果汁在4、25、37 ℃貯藏條件下，VC、總酚、總糖、還原糖和5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）質量濃度的變化，并利用通徑分析方法進一步解析余甘子果汁在貯藏過程中引起褐變的主要因素和各因素間的交互作用，以期為品質調控技術及有效控制其褐變提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘子鮮果由中國林業科學研究院資源昆蟲研究所景東南亞熱帶試驗站提供。

抗壞血酸（標準品）、葡萄糖（標準品）、沒食子酸（標準品）、2,6-二氯靛酚鈉鹽、蒽酮 阿拉丁試劑上海有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉天津市風船化學試劑科技有限公司；硫酸、無水乙醇重慶川東化工（集團）有限公司；福林-酚、蘆丁（標準品） 北京索萊寶科技有限公司；以上試劑除標準品外其余均為分析純。

1.2 儀器與設備

HX-7.5D小型電加熱蒸汽發生器 上海華征特種鍋爐有限公司；BPZ-6090Lc真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；BCD-539WT冰箱 青島海爾股份有限公司；1200高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Varioskan Flash全波長多功能酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；高速冷凍離心機 德國HERMLE科技公司。

1.3 方法

1.3.1 余甘子果汁制備

余甘子鮮果（直徑約為10～15 mm）經挑選清洗后，置于蒸汽壓力為0.3 MPa的高溫蒸汽中處理130 s[22-23]，取出，立即冷卻，去核，螺旋榨汁，離心過濾備用（標為D樣）。對照樣品：余甘子鮮果挑選清洗后直接螺旋取汁，離心過濾備用（標為W樣）。

1.3.2 余甘子果汁的貯藏

將1.3.1節的余甘子果汁巴氏滅菌后分裝，分別置于4、25、37 ℃避光貯藏42 d，每隔7 d取余甘子汁用于各項指標的測定。

1.3.3 褐變度的測定

褐變度的測定參考文獻[24]的方法。取余甘子果汁1 mL用去離子水稀釋10 倍后，4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，取上清液，在420 nm波長處測定吸光度，以A420nm表征其褐變度。

1.3.4 成分質量濃度測定

VC質量濃度采用2,6-二氯靛酚鈉標定法[25]檢測，單位為mg/mL；總酚質量濃度采用福林-酚比色法[26]進行測定，以每毫升余甘子果汁中的沒食子酸質量來表示，單位mg/mL；5-HMF質量濃度的測定參照Li Zhao等[27]的液相法，單位為μg/mL；采用蒽酮比色法[28]測定余甘子果汁中的總糖質量濃度，以每毫升余甘子果汁中的葡萄糖質量來表示，單位mg/mL；還原糖質量濃度的測定參照趙凱等[29]的方法（3,5-二硝基水楊酸法），以每毫升余甘子果汁中的葡萄糖質量來表示，單位mg/mL。

1.4 數據處理與分析

以VC（X1）、總酚（X2）、5-HMF（X3）、還原糖（X4）質量濃度為自變量，以褐變度為因變量Y，對引起余甘子果汁褐變的各因素進行通徑分析，求出直接通徑系數P1、P2、P3、P4，按式（1）計算各因素間的間接通徑系數Pij，由相關系數和通徑系數計算決定系數d[30-31]，單個因素（i）、兩個因素（i、j）對Y的決定系數計算分別如公式（2）、（3）所示，剩余通徑系數（Pe，未考慮因變量的影響因素和實驗誤差）的計算如公式（4）所示。

式中：Pi為因素i的通徑系數；Pj為因素j的通徑系數；rij為因素i和j的相關系數。

每個指標測定3 個平行樣，實驗數據采用Origin 8.0軟件繪圖，利用SPSS 17.0軟件進行相關性分析、通徑分析和差異顯著性分析（方差分析），P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 高溫蒸汽處理對余甘子果汁貯藏過程中VC、總酚質量濃度的影響

如圖1A所示，VC雖在余甘子果汁中含量豐富，但在長期受熱過程中并不穩定，且隨著貯藏溫度越高，損失越嚴重。VC的降解主要為有氧降解和無氧降解，體系中的含氮物質（如氨基酸、蛋白質等）會與VC的氧化產物進一步發生羰氨反應，從而加速樣品的褐變[13]，植物體內VC分解酶的存在也會促進VC氧化[32]，致使其質量濃度降低。余甘子果汁在4、25 、37 ℃下貯藏42 d后，W樣的VC保留率分別為77.67%、64.43%和61.76%，D樣VC保留率分別為80.80%、67.47%和63.69%，可見W樣和D樣在4 ℃貯藏條件下VC保留率明顯高于25 ℃和37 ℃，故低溫條件下更利于余甘子果汁的貯藏。在4 ℃貯藏42 d后，D樣VC質量濃度顯著高于W樣（P＜0.05），可能因為樣品經過高溫蒸汽預處理后可鈍化其中的VC酶，同時使果汁中的部分含氮物質變性，從而減緩VC的損失。

由圖1B可知，余甘子總酚質量濃度隨著貯藏時間的延長而下降，且隨著貯藏溫度的升高總酚質量濃度下降，37 ℃貯藏42 d后，W樣和D樣總酚質量濃度分別下降了9.38、8.90 mg/mL，酚類物質質量濃度減少是其氧化聚合和多酚氧化酶的酶促反應導致，而W樣總酚保留率低于D樣，可能是由于W樣中的酚類發生酶促反應同時還伴有氧化聚合，高溫蒸汽處理可鈍化多酚氧化酶[33]，故D樣中的總酚質量濃度減少可能主要由氧化聚合所導致，可見，高溫蒸汽預處理和低溫貯藏利于余甘子果汁中酚類物質的保留。

圖1 余甘子果汁貯藏期間VC（A）和總酚（B）質量濃度的變化Fig. 1 Changes in vitamin C (A) and total phenol (B) concentration of Phyllanthus emblica L. juice during storage

2.2 高溫蒸汽處理對余甘子果汁貯藏過程中總糖和還原糖質量濃度的影響

如圖2A所示，貯藏期間余甘子果汁總糖質量濃度隨著時間的延長而降低，且與貯藏溫度呈負相關。貯藏42 d后，4 ℃貯藏的W樣和D樣果汁總糖保留率分別為88.72%和89.70%，而37 ℃條件下貯藏的余甘子果汁總糖的保留率分別為82.67%和82.91%，37 ℃條件下的總糖質量濃度顯著低于4 ℃條件下（P＜0.05）。總糖的損失主要是由于酸性和熱處理的條件會導致蔗糖水解生成還原糖，還原糖進一步與氨基酸進行Maillard反應[34]。

圖2 余甘子果汁貯藏期間總糖（A）和還原糖（B）質量濃度的變化Fig. 2 Changes in total sugar (A) and reducing sugar (B) concentration of Phyllanthus emblica L. juice during storage

由圖2B可知，余甘子果汁在貯藏過程中還原糖質量濃度的變化較復雜，在4 ℃下0～21 d，還原糖質量濃度隨著貯藏時間的延長而降低，但第28天還原糖質量濃度略有上升，35 d后開始下降；在25 ℃和37 ℃均有類似的變化規律，不同的是上升的時間點提前至14 d。余甘子果汁在貯藏期間，與還原糖質量濃度變化有關的反應主要有蔗糖水解反應生成還原糖和Maillard反應消耗還原糖，當水解反應占主導地位時，還原糖質量濃度出現上升趨勢，反之還原糖質量濃度下降。不同溫度貯藏42 d后，W樣還原糖質量濃度顯著高于D樣，可能是貯藏期間D樣總糖水解速率低于W樣，其還原糖的生成量低所致。

2.3 高溫蒸汽處理對余甘子果汁貯藏過程中5-HMF質量濃度的影響

圖3 余甘子果汁貯藏期間5-HMF質量濃度的變化Fig. 3 Changes in 5-HMF concentration of Phyllanthus emblica L.juice during storage

5-HMF是Maillard反應過程中極為重要的中間產物之一，不僅是造成果汁褐變的潛在因素，同時也是Maillard反應的重要指示因子[35]；因此，5-HMF質量濃度可作為褐變程度的評價指標之一。如圖3所示，5-HMF質量濃度與貯藏溫度正相關。同時，5-HMF質量濃度隨貯藏時間的延長而增加。貯藏42 d后，W樣在4、25 、37 ℃下5-HMF質量濃度分別增加1.58、4.81 μg/mL和10.38 μg/mL，37 ℃下5-HMF的生成量顯著高于4 ℃（P＜0.05）；同樣條件下放置42 d后，D樣5-HMF的增量分別為1.26、2.84 、5.92 μg/mL。在25 ℃和37 ℃貯藏條件下D樣的5-HMF生成量明顯低于W樣，可能原因是高溫蒸汽使余甘子中的部分蛋白變性，抑制了Maillard反應的進行，致使D樣的5-HMF生成量較低。由圖可知，4 ℃條件下貯藏W和D樣的5-HMF的增量均較小，有利于果汁的貯藏。

表1 不同貯藏溫度下W樣和D樣各因素間的相關系數Table 1 Correlation coefficients among factors for samples W and D at different storage temperatures

2.4 高溫蒸汽處理對余甘子果汁貯藏過程中褐變度的影響

圖4 余甘子果汁貯藏期間的褐變度Fig. 4 Browning curves of Phyllanthus emblica L. juice during storage

由圖4可知，隨著貯藏溫度的升高，果汁的褐變加劇。貯藏42 d后，在4、25 ℃和37 ℃下W樣的A420nm分別增加0.101 2、0.202 5和0.335 7，D樣分別增加0.051 2、0.120 7和0.165 5，相同貯藏時間37 ℃處理組褐變度顯著高于4 ℃處理組（P＜0.05）。另外，貯藏時間越長，褐變越明顯。因此，低溫貯藏可有效減少余甘子果汁的褐變度。

2.5 相關性分析

由表1可知，4 ℃貯藏溫度下，兩各處理組的總酚（X2）、5-HMF（X3）和還原糖（X4）質量濃度均與褐變度（Y）顯著或極顯著相關，其中W樣的褐變度與總酚（X2）和還原糖（X4）質量濃度呈極顯著負相關（P＜0.01），與5-HMF質量濃度（X3）呈顯著正相關（P＜0.05），VC質量濃度（X1）與褐變度（Y）相關性不顯著。25 ℃貯藏溫度下，W樣和D樣的VC（X1）、總酚（X2）和5-HMF（X3）質量濃度均與褐變度（Y）呈極顯著相關（P＜0.01），W樣的還原糖質量濃度（X4）與褐變度（Y）呈顯著負相關（P＜0.05），而D樣的還原糖質量濃度（X4）與褐變度（Y）相關性不顯著。37 ℃貯藏溫度下，W樣和D樣的還原糖質量濃度（X4）與褐變度（Y）相關性不顯著，其余3 個因素均具有一定的相關性，其中W樣的VC（X1）、總酚（X2）和5-HMF（X3）質量濃度均與褐變度（Y）呈極顯著相關（P＜0.01），而D樣只有VC（X1）、總酚（X2）質量濃度與褐變度（Y）呈極顯著相關（P＜0.01），5-HMF質量濃度（X3）與褐變度（Y）呈顯著相關（P＜0.05）。

2.6 不同貯藏條件下余甘子果汁褐變的通徑分析

各因素間的相關系數只能表明兩因素間的直接關系及相關程度，但不能完全確定各因素對余甘子果汁褐變的相對重要性；因此，為了進一步探討不同貯藏條件下引起W樣和D樣余甘子果汁褐變的主要因素，對其進行通徑分析，再根據通徑系數分析各因素的相對重要性。直接通徑系數Pi反映因素Xi對Y的直接效應，Pi絕對值越大，表明因素Xi對Y的作用越大，反之亦然；間接通徑系數Pij表示因素Xi通過Xj（i≠j）對Y的作用，Pij絕對值越大，表明因素Xi通過Xj（i≠j）對Y的影響越大。

表2 W樣在不同貯藏溫度下的通徑分析Table 2 Path analysis among factors for samples W and D at different storage temperatures

在4、25、37 ℃貯藏條件下，因素VC（X1）、總酚（X2）、5-HMF（X3）、還原糖（X4）質量濃度與褐變度之間的通徑分析見表2。對于W樣，在4 ℃貯藏條件下，直接通徑作用的關聯程度為P2＞P4＞P3＞P1，還可看出總酚質量濃度通過VC、5-HMF和還原糖質量濃度對褐變度產生的間接作用也很明顯，而VC質量濃度通過其他因素對褐變度產生的間接作用相對較弱；在25 ℃貯藏溫度下，由直接通徑系數可知，對余甘子果汁的褐變度起首要作用的是總酚質量濃度（P2＝-2.204 4），其次是還原糖質量濃度（P4＝1.114 5），再次是VC質量濃度（P1＝0.193 3），而5-HMF質量濃度所起的作用較小（P3＝-0.049 7）；在37 ℃貯藏溫度下，各因素對余甘子果汁的褐變度影響的大小順序為P2＞P1＞P4＞P3，由表2還可看出總酚質量濃度通過VC、5-HMF和還原糖質量濃度對褐變度產生的間接作用也很明顯，而5-HMF質量濃度通過其他因素對褐變度產生的間接作用相對較弱。由此可知，W樣在4、25 、37 ℃貯藏條件下，對余甘子果汁的褐變度起首要作用的均是總酚質量濃度，可能原因是在本體系中，相比VC氧化反應和Maillard反應，多酚的氧化聚合和酶促反應更易發生。

從表2中得知，對于D樣，在4 ℃貯藏溫度下，由直接通徑系數可知，對余甘子果汁的褐變度起首要作用的是5-HMF質量濃度（P3＝0.825 7），其次是還原糖質量濃度（P4＝-0.568 3），再次是總酚質量濃度（P2＝0.552 7），而VC質量濃度所起的作用較小（P1＝-0.166 0）；在25 ℃貯藏溫度下，各因素對余甘子果汁的褐變度影響的大小順序為P2＞P3＞P4＞P1，由表2還可看出總酚質量濃度通過VC、5-HMF和還原糖質量濃度對褐變度產生的間接作用也很明顯，而VC質量濃度通過其他因素對褐變度產生的間接作用相對較弱；在37 ℃貯藏溫度下，對余甘子果汁的褐變度起首要作用的是VC質量濃度（P1＝-1.712 6），其次是5-HMF質量濃度（P3＝-1.568 4），再次是總酚質量濃度（P2＝-1.212 5），而還原糖質量濃度所起的作用較小（P4＝0.488 0）。

由表3可知，在4 ℃貯藏條件下，將W樣各因素對余甘子果汁褐變度的決定系數按照絕對值由大到小的順序排列可知，總酚質量濃度和5-HMF質量濃度的交互作用是影響其褐變的第一決定因素，d23＝-0.696 1；總酚質量濃度和還原糖質量濃度的交互作用是影響褐變度的第二決定因素，d24＝0.639 1；總酚質量濃度是影響褐變度的第三決定因素，d2＝0.619 4；其余以此類推；通過Σd來判斷通徑分析中設置的自變量的合理性，Σd理論值為1，但由于實驗中很難考慮到所有的影響因素及不可避免的誤差，Σd不可能達到1，只能保證Σd盡可能地接近1，此時通徑分析的結果才越符合實際情況。W樣在4 ℃貯藏條件下Σd＝0.901 9，Pe＝0.313 2，說明影響余甘子果汁褐變的主要因素已基本考慮。由D樣的決定系數可知，4 ℃下5-HMF質量濃度和總酚質量濃度的交互作用是影響余甘子果汁褐變的第一決定因素，d23＝-0.897 4；5-HMF質量濃度和還原糖質量濃度的交互作用是影響其褐變的第二決定因素，d34＝0.690 2；5-HMF質量濃度是影響其褐變的第三決定因素，d3＝0.681 8，其余以此類推；Σd＝0.818 6，Pe＝0.425 9，說明影響余甘子果汁褐變的因素還有部分未考慮到。

表3 不同貯藏溫度下W樣和D樣的決定系數Table 3 Determination coefficients for samples W and D at different storage temperatures

25 ℃下，由W樣的決定系數可知，總酚質量濃度是影響余甘子果汁褐變的第一決定因素，d2＝4.859 2；總酚質量濃度和還原糖質量濃度的交互作用是影響其褐變的第二決定因素，d24＝-4.607 0；還原糖質量濃度是影響其褐變的第三決定因素，d4＝1.242 2，其余以此類推。對于D樣而言，總酚質量濃度是影響余甘子果汁褐變的第一決定因素，d2＝7.258 7；總酚和5-HMF質量濃度的交互作用是影響其褐變的第二決定因素，d23＝-7.266 1；總酚質量濃度和還原糖質量濃度的交互作用是影響其褐變的第三決定因素，d24＝-5.855 9，其余以此類推；Σd＝0.971 8，Pe＝0.167 9，說明已涵蓋影響余甘子果汁褐變的主要因素。

貯藏溫度達到37 ℃時，總酚質量濃度是影響W樣余甘子果汁褐變的第一決定因素，d2＝0.774 8；VC質量濃度和總酚質量濃度的交互作用是影響其褐變的第二決定因素，d12＝0.752 3；總酚質量濃度和還原糖質量濃度的交互作用是影響其褐變的第三決定因素，d24＝-0.665 2，其余以此類推。由D樣的決定系數可知，VC質量濃度和5-HMF質量濃度的交互作用是影響余甘子果汁褐變的第一決定因素，d13＝-5.293 7；VC質量濃度和總酚質量濃度的交互作用是影響其褐變的第二決定因素，d12＝3.795 0；5-HMF質量濃度和總酚質量濃度的交互作用是影響其褐變的第三決定因素，d23＝-3.507 1，其余以此類推；Σd＝0.958 7，Pe＝0.203 2，說明已包含影響余甘子果汁褐變的主要因素。由表3可知，不同貯藏溫度下，余甘子果汁褐變與多酚質量濃度密切相關；因此，可從保留多酚的角度入手，控制余甘子果汁的褐變，為后期余甘子產品的開發提供數據支撐。

3 結 論

本研究結果表明，不同貯藏條件下，高溫蒸汽預處理可減緩貯藏過程中余甘子果汁的VC、總酚及總糖質量濃度的損失，并降低5-HMF的生成量及果汁的褐變度，且低溫貯藏更有利于果汁成分的保留。在4、25、37 ℃貯藏條件下，將余甘子果汁W樣和D樣中的VC、總酚、5-HMF和還原糖質量濃度與褐變度進行通徑分析，結果表明：1）在4 ℃貯藏條件下，W樣中的總酚質量濃度對褐變度起首要作用，總酚質量濃度和5-HMF質量濃度的交互作用是褐變度的第一決定因素；對于D樣來說，5-HMF質量濃度對褐變度起首要作用，5-HMF質量濃度和總酚質量濃度的交互作用是褐變度的第一決定因素。2）在25 ℃貯藏條件下，總酚質量濃度對W樣和D樣的褐變度起首要作用，同時也是決定褐變度的首要因素。3）在37 ℃貯藏條件下，W樣中的總酚質量濃度對褐變度起首要作用，也是其褐變度的第一決定因素；對于D樣來說，VC質量濃度對褐變度起首要作用，VC質量濃度和5-HMF質量濃度的交互作用是褐變度的第一決定因素。綜上所述，可以通過控制多酚和VC的損失，以及阻止5-HMF的形成來防止余甘子果汁在貯藏過程中的褐變，保護其產品的品質。