甲基丙二酸尿癥動物模型研究進展

鄭亞蓓，陸相朋，鄭 宏

1)河南中醫藥大學第一臨床學院 鄭州 450008 2)河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科 鄭州 450000

甲基丙二酸尿癥(methylmalonic acidemia,MMA)又稱甲基丙二酸血癥，是由甲基丙二酰輔酶A變位酶(methylmalonyl-CoA mutase apoenzyme,MCM)缺陷及其輔酶鈷胺素代謝障礙導致中間代謝產物異常蓄積而引起的一種有機酸尿癥，同時也是目前發病率較高的遺傳代謝病之一[1]。經對我國北京、上海、山東、河南等地的新生兒篩查，MMA發病率分別為1∶26 000、1∶3 920、1∶11 160、1∶6 032[2]。MMA根據MCM酶缺陷類型分為完全缺陷(complete mutase deficiency,mut0)和部分缺陷(partial mutase deficiency,mut-)型。大部分突變主要影響MCM兩個結構域，即N端底物CoA結合區和C端腺苷鈷胺素結合區。底物結合區的突變多導致mut0型，而鈷胺素結合區的突變多為mut-型。我國MMA患者中約60%為MMA合并高同型半胱氨酸血癥，以cblC型更為多見[3]。MMA CHC是cblC的編碼基因，此基因突變可導致腺苷鈷胺素以及甲基鈷胺素合成缺陷，MCM及甲硫氨酸合成酶活性下降，最終導致甲基丙二酸和同型半胱氨酸水平增高[4]。

MMA的臨床表現個體差異較大，缺乏特異性，主要表現為神經系統損傷，多累及肝臟、心臟、腎臟、呼吸系統及造血系統等[5]。目前，MMA主要依靠藥物治療，以維生素B12、左旋肉堿和甜菜堿為主[1,6]。研究[7]發現，部分MMA患兒出生后即使得到及時、有效、規范的治療，仍遺留有神經系統后遺癥，嚴重影響患兒的生存質量，并且給社會、家庭帶來沉重的經濟和精神負擔。如何有效改善MMA的預后是我們研究的目標和努力的方向。目前基于動物模型的MMA病理機制的研究多集中在中樞神經系統及肝腎系統，但具體發病機制仍不夠明確。因此，建立合適的疾病動物模型是深入研究MMA的必要條件。國內外近年來建立了數種MMA動物模型，現將相關研究進展總結如下。

1 皮下注射甲基丙二酸構建MMA大鼠模型

皮下注射甲基丙二酸構建MMA大鼠模型，能夠成功模擬持續高濃度的甲基丙二酸對幼鼠大腦內各種生化指標的影響以及神經系統的損傷。早在 1988年Wajner等[8]選用新生Wistar大鼠幼鼠，從出生后第5天至第28天，每天兩次皮下注射甲基丙二酸(0.72～1.67 μmol/g)，建立MMA大鼠模型;進一步檢測發現，模型幼鼠腦內突觸數量減少，小腦中神經節苷脂N-乙酰神經氨酸濃度降低；該實驗初步揭示了MMA兒童智力發育延遲的原因。Dutra等[9]采用此模型進行MMA幼鼠曠場行為學研究，模型幼鼠出現明顯學習記憶障礙。Brusque等[10]觀察到此模型幼鼠大腦中髓鞘含量和神經節苷脂濃度明顯減少，血液和腦內甲基丙二酸濃度與MMA患者相當。Pettenuzzo等[11]的研究結果顯示，模型幼鼠腦內自由基生成增加，發生炎癥反應，幼鼠表現出學習障礙；抗氧化劑對MMA幼鼠的行為有明顯改善作用。Ribeiro等[12]利用物體探索實驗和高架+迷宮實驗再次驗證，長期皮下注射甲基丙二酸可降低大鼠空間識別能力，升高大腦皮層神經炎癥因子(IL-1β、TNF-α)水平，以及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和3-硝基酪氨酸(3-NT)水平；模型幼鼠血液中性粒細胞計數減少，單核細胞和其他類型細胞計數增加。Li等[13]發現，MMA模型大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO含量增加，丙二醛和iNOS濃度升高，小膠質細胞活性受抑，谷胱甘肽水平和超氧化物歧化酶活性降低，小膠質細胞的異常活化加重了海馬神經元的凋亡；進一步明確氧化應激和炎癥反應會加重MMA患者認知功能障礙，使用抗氧化劑(氨基胍)可以改善MMA患者的認知功能障礙。

綜上所述，通過皮下注射甲基丙二酸制備的MMA模型大鼠可表現出神經系統損傷，包括腦神經結構損傷、腦神經發育損傷、認知及行為等腦功能改變和血液、腦脊液生化異常。此模型適用于神經系統后遺癥新藥物療法的研究。

2 基因敲除MMA小鼠模型

單純型MMA是由于編碼MCM蛋白的MUT基因突變導致MCM蛋白活性降低而發病。基于人MUT基因與小鼠MUT基因位點的同源性，采用基因打靶技術從分子水平上刪除某一基因、去除某一外顯子、導入點突變或者用其他相近基因取代，可以獲得相應疾病的動物模型。Peters等[14]利用基因打靶技術敲除C57BL/6小鼠含有第3外顯子的關鍵CoA結合域內Mut等位基因，建立首個基因敲除MMA小鼠模型(簡稱KO小鼠)，即Mut-/-MMA小鼠模型。該模型小鼠體內檢測不到MCM酶活性，與Mut-/-MMA患者的臨床表現相似，出生后死亡率高，血、尿及組織中異常代謝產物水平顯著增高，臟器結構和功能出現異常，線粒體損傷，發生炎癥反應和氧化應激反應[15]。此后，Chandler等[16]又創建一個改進的Mut-/-小鼠模型，此模型小鼠的存活率高，小鼠體內既無Mut mRNA，也不產生MCM蛋白，甲基丙二酸循環代謝物水平明顯升高。該模型為從分子水平深入研究MMA的病理生理學特征提供了便利。該模型小鼠神經系統、肝臟組織中可觀察到與MMA患者相似的形態學和酶學改變，并伴有呼吸鏈功能障礙的巨線粒體形成，提示可以從改善線粒體功能和氧化應激方面入手，尋找MMA治療的突破口。

Chandler等[17]將攜帶有Mut基因的腺病毒通過肝內注射的途徑給予Mut-/-MMA小鼠，之后小鼠體內異常代謝物水平均有所降低，提示肝臟靶向基因治療MMA有效，這為靶向肝細胞的基因和細胞療法提供了實驗基礎。Chandler等[18-20]對Mut-/-MMA小鼠肝內注射重組腺病毒相關血清，小鼠存活時間延長，肝臟中可持續表達MCM。Wong等[21]采用病毒載體介導的基因療法治療Mut-/-MMA小鼠，小鼠體重接近正常，其肝臟中MCM顯著表達，血、尿中甲基丙二酸水平降低。以上研究結果表明靶向治療可以用于MMA。

3 轉基因MMA小鼠模型

轉基因模型的構建主要是利用DNA重組、轉化等將特定的外源目的基因經顯微注射轉移到受體，并使之產生可預期的、定向的遺傳學改變，使生物體正常發育。目前利用轉基因技術構建MMA模型的方法如下。

Peters等[22]將攜帶有完整人MCM基因座的DNA克隆序列顯微注射到已受精的C57BL/6小鼠卵母細胞核中，生育出轉基因小鼠；新生小鼠經過進一步雜交繁殖，篩選出的小鼠表達完整的人MCM的水平不一；此模型小鼠轉化MCM活性的能力較弱，大腦中MCM表達最高，其次是腎臟和肝臟。小鼠對于支鏈氨基酸的代謝途徑不同于人類，轉基因小鼠攜帶有人MCM基因，可以用于觀察人MCM的表達，同時也適用于評估肝細胞移植、基因療法及藥物上調疾病基因表達效果的研究。Buck等[23]將攜帶有人終止密碼子的突變基因經過轉基因技術引入到Mut-/-MMA小鼠，并與其雜交產生沒有內源性MCM、只有終止密碼子的轉基因小鼠；小鼠出生后24 h內死亡率高，血、尿中的異常代謝產物水平高，尤其是尿液中代謝產物水平高于血液，而且出現肝臟、腎臟腫大，該模型較適用于基因治療方法的研究。

Forny等[24]利用胚胎干細胞靶向生成攜帶MCM錯義突變等位基因的小鼠，經過一系列復雜過程而生成與臨床相關的轉基因Mut(Ki/Ki)小鼠和Mut(Ko/Ki)小鼠。兩種小鼠的存活時間均明顯延長，但生長仍比較緩慢。與Mut(Ki/Ki)小鼠相比較，Mut(Ko/Ki)小鼠MCM活性更低，代謝產物濃度更高。正常飲食時，Mut(Ko/Ki)小鼠會出現明顯的腎臟和大腦損傷，腎臟和大腦損傷標志物Lcn2水平明顯升高。鈷胺素可治療部分因飲食引起的Mut(Ki/Ki)小鼠的代謝危象，對同種情況的Mut(Ko/Ki)小鼠改善不明顯。此類模型小鼠與人高度相似，因其存活時間長，更適用于對MMA慢性臨床表現病理生理機制的研究。

Manoli等[25]利用轉基因技術構建了在肝細胞中表達Mut基因的Mut-/-；TgIns-Alb-Mut小鼠模型。此類小鼠新生兒期存活時間延長，代謝產物增加；高蛋白飲食后腎小球濾過率降低，慢性腎小管間質腎炎、腎小管功能不全的近端小管線粒體超微結構顯著改變；近端腎小管細胞色素C氧化酶(COX)活性降低，電鏡下可見腎小管胞質中多種基質顆粒/沉積物增多。抗氧化劑能有效改善高蛋白飲食引起的Mut-/-；TgIns-Alb-Mut小鼠腎功能不全現象。Mut-/-；TgIns-Alb-Mut小鼠的基因組學和生化特征檢測結果顯示，超過50多種生物標記物與MMA患者相似。該模型適用于探索與線粒體功能障礙機制有關的MMA腎臟病理研究。

Manoli等[26]再次利用轉基因技術構建在骨骼肌中表達Mut基因的Mut-/-；TgIns-MCK-Mut小鼠模型。該模型小鼠存活率有所提高，但生長遲緩并伴隨肝、腎細胞線粒體病變，仍需補充高脂肪食物和碳水化合物( high-fat and carbohydrate，HFCD)才能生存；血清中甲基丙二酸及Lcn2濃度顯著升高，COX缺乏，堿性磷酸酶濃度升高，淀粉酶濃度降低；肝細胞胞質中有明亮的Mallory小體及大量嗜酸性空泡，電鏡下可見肝細胞內線粒體增大，嵴縮短或無嵴，與人類病理改變非常相似；空腹狀態下，起著重要代謝調節作用的Fgf21因子濃度明顯升高，伴發肝細胞線粒體功能障礙以及各種急慢性應激反應，并首次提出Fgf21因子是反映MMA肝臟病變嚴重程度的生物標記物。該模型小鼠經腺病毒肝臟靶向治療，臨床和生化特征均有所改善。

針對不同突變類型，特別是我國人群c.609G>A熱點突變，開發出不同的動物模型是未來基因治療的研究方向。馬飛等[27]應用高效基因編輯工具成功構建了W203X純合突變cblC型MMA小鼠模型。此模型小鼠生后12 h內血代謝物水平正常，24 h后血代謝物C3水平顯著升高，整體存活時間較KO小鼠明顯延長，成功復制了重癥cblC型MMA患兒的臨床表型，為生后早期實施基因治療提供了時間窗。

4 總結

MMA是多基因突變導致的遺傳性疾病，發病機制復雜。生物化學藥物誘發的MMA模型具有構建簡單、易于操作的優點，是比較經典的MMA動物模型構建方法，但該類模型雖能成功模擬人體組織及體液中甲基丙二酸水平的升高和行為學改變的特征，卻不能完全復制MMA患者的臨床特征。為此，基因敲除模型在某種程度上更能解釋多種異常代謝物所導致的MMA。基因敲除MMA小鼠模型能夠從生化和表型方面成功模擬人體體液和組織中代謝物含量升高，生長發育緩慢等表現；其缺陷是KO小鼠不含MCM基因，死亡率高，不能在基因型和表型水平上顯示關鍵特征，不適用于旨在增加MCM活性的治療方法的研究。而轉基因小鼠模型恰好可以彌補基因敲除小鼠MCM缺陷的問題，但是轉基因小鼠模型制備過程中，顯微注射外源DNA很容易造成插入突變，極不穩定。目前CRISPR/Cas9技術廣泛應用于疾病動物模型構建等領域，也將成為MMA動物模型研究的新方法。