結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷現(xiàn)狀與展望

李自慧 張宗德

WHO[1]估計，2018年全球新發(fā)結(jié)核病患者1000萬例左右，約150萬例死于結(jié)核病。結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis, TBM)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病，約占所有結(jié)核病的1%，占肺外結(jié)核的5%～10%[2-6]。TBM的致死率高達10.0%～36.5%，生存的患者常殘留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，而在 HIV感染者和兒童患者中后果往往更為嚴重[4, 7]。

早期診斷和及時治療對于改善TBM患者預后至關(guān)重要，但TBM患者的臨床表現(xiàn)和影像學變化均不典型，現(xiàn)有的實驗室診斷方法敏感度較低，致使TBM的診斷異常困難。有研究者根據(jù)臨床特征制訂了診斷評分系統(tǒng)用以改善TBM的臨床診斷，該系統(tǒng)診斷TBM的敏感度和特異度分別為86%～98%和68%～88%，但其在HIV感染的隱球菌性腦膜炎患者中常出現(xiàn)假陽性而導致特異度較低[4]。因此，面對TBM診斷這一全球性難題，目前仍需進一步加強實驗室診斷研究，研發(fā)更為有效的TBM實驗室診斷方法。

TBM實驗室診斷現(xiàn)狀

目前，有關(guān)TBM的實驗室檢測方法眾多，主要分為細菌學檢測、病原分子檢測和基于宿主反應(yīng)的檢測三大類。盡管其中尚沒有一種方法能達到簡單、快捷、經(jīng)濟、可靠的效果，但上述三大類檢測技術(shù)對于目前TBM的診斷仍具有重要意義。

一、細菌學檢測

腦脊液中檢測到結(jié)核分枝桿菌是TBM確診的金標準。腦脊液離心沉渣涂片結(jié)合萋-尼染色或熒光染色鏡檢最為簡單快速，但腦脊液中結(jié)核分枝桿菌數(shù)量很低，通常小于100個/ml，而鏡檢低限為100個/ml[7]，因此涂片鏡檢陽性率非常低，通常低于20%，甚至為0%[8-12]。腦脊液分枝桿菌培養(yǎng)的方法敏感度有所提高，并能進一步獲取藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結(jié)果，但基于BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗的液體培養(yǎng)約需10 d，固體培養(yǎng)約需8周，TBM患者病情復雜兇險，通常無法等到培養(yǎng)結(jié)果再采取治療措施。2011年WHO推薦顯微鏡觀察藥物敏感性(microscopic observation drug susceptibility, MODS)液體培養(yǎng)法，其采用倒置顯微鏡觀察微量滴定板里細菌的生長，平均檢測時間為1周左右，對TBM診斷的敏感度達64.9%，但該方法在檢測標準化和自動化方面還需改進[13]。噬菌體生物擴增法診斷TBM的敏感度略高于離心涂片和液體培養(yǎng)法[14]，但總體上敏感度中等且不同研究結(jié)果差異大，所需測定條件嚴格，因此還需進一步改進[15]。另外，增加腦脊液檢測樣本量、延長鏡檢時間、改良抗酸染色等可在一定程度上提高TBM的陽性檢出率[10, 16-17]，但在臨床工作中往往較難實現(xiàn)。

二、病原分子檢測

近年來結(jié)核分枝桿菌核酸擴增試驗(nucleic acid amplification tests, NAAT)檢測技術(shù)發(fā)展迅速，其常以IS6110、rpoB等為靶標，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)、巢式PCR、多重PCR或?qū)崟r熒光定量PCR進行擴增和檢測。商業(yè)化試劑盒主要有Xpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、線性探針檢測等。Meta分析表明，腦脊液Xpert對TBM確診患者的診斷準確率較高，敏感度和特異度分別為57%(38%～74%)和98%(89%～100%)，對臨床疑似患者檢測的敏感度和特異度分別為13%(6%～28%)和98%(92%～100%)[18]；Xpert與傳統(tǒng)培養(yǎng)法敏感度接近，但在自動化、檢測時間及獲取耐藥結(jié)果方面優(yōu)勢明顯[12, 19]。腦脊液行LAMP檢測對TBM臨床診斷患者的敏感度為43%～88%，特異度為80%～100%，其優(yōu)點是操作簡單、快速，適用于基層單位開展[20-22]。線性探針方法(如MTBDRplus和MTBDRsl試劑盒)不僅可檢測腦脊液中的結(jié)核分枝桿菌，還能同時檢測菌株對多種抗結(jié)核藥物的耐藥情況[23-24]。因此，盡管目前核酸檢測仍然費用昂貴、存在假陽性風險，但對于提高TBM檢出率、縮短獲取病原學證據(jù)和藥敏試驗結(jié)果時間方面具有重要意義。

在結(jié)核分枝桿菌抗原檢測方面，以脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)檢測最為常用。有報道LAM商業(yè)化試劑盒在檢測HIV感染、CD4+T淋巴細胞計數(shù)低(<50個/μl)的結(jié)核病患者尿液樣本時，敏感度達66.7%，特異度高于98%[25]，但其用于檢測腦脊液樣本的研究不多并且結(jié)果差異較大。例如Patel等[26]和Siddiqi等[27]報告，腦脊液LAM檢測TBM患者(HIV感染者分別占84%和86%)的敏感度分別為31%和22%，特異度均為94%。Cox等[28]采用尸檢時從第四腦室獲取的腦脊液樣本進行LAM檢測，檢測TBM的敏感度和特異度分別為50%和70%；而Bahr等[29]采用類似方法檢測臨床腦脊液樣本時，卻無一例檢出。因此，LAM檢測對TBM的診斷價值還需做進一步評估。

三、基于宿主反應(yīng)的檢測

目前，仍缺乏可靠的基于宿主體液免疫反應(yīng)的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測方法，而基于宿主細胞免疫反應(yīng)判斷結(jié)核分枝桿菌感染的方法主要包括結(jié)核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test, TST)和γ干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay, IGRA)兩種。TST價格低廉、操作簡單，適于人群篩查，缺點是結(jié)果易受卡介苗接種的影響而出現(xiàn)假陽性。IGRA通過檢測結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激活化效應(yīng)T細胞產(chǎn)生的γ干擾素來判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染，敏感度和特異度較強；其產(chǎn)品主要基于酶聯(lián)免疫斑點試驗[如結(jié)核感染T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)]和酶聯(lián)免疫吸附試驗[如QuantiFERON-TB Gold (QFT-G)]。目前認為，IGRA不能有效區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染，不能用于確診或排除結(jié)核病，對于菌陰結(jié)核病有輔助診斷價值，檢測非血液標本的診斷價值需做進一步評估[30]。中國[31-33]、韓國[34]、南非[35]的幾項研究顯示，腦脊液和外周血T-SPOT.TB診斷TBM的敏感度分別為58%～92%和70%～91%，特異度分別為79%～97%和58%～87%。也有研究認為腦脊液QFT-G對TBM無診斷價值，全血QFT-G診斷TBM的敏感度(44.4%)和特異度(62.5%)也較低[36]。另外，腦脊液IGRA檢測也存在腦脊液需要量大(4 ml以上)、不確定結(jié)果的比例高等缺點。因此，采用IGRA檢測TBM的效果并不理想。

腦脊液腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)水平對于TBM診斷也有一定參考意義。Tuon等[37]通過分析13項研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液ADA在1～4 U/L時，敏感度>93%，特異度<80%，有助于排除TBM；>8 U/L時，敏感度<59%，特異度>96%，有助于TBM診斷；但ADA無法區(qū)分TBM與細菌性腦膜炎。另一篇納入20項研究的綜述表明，腦脊液ADA診斷TBM的敏感度和特異度分別為89%(84%～92%)和91%(87%～93%)[38]。因此，在排除細菌性腦膜炎的情況下，簡單快捷的腦脊液ADA檢測對于條件有限地區(qū)的TBM診斷有重要參考意義。

TBM實驗室診斷最新研究進展

提升TBM實驗室診斷能力有賴于改進現(xiàn)有方法和開發(fā)新的標志物及方法，同時需要加快對新方法的診斷價值評估。近年來相關(guān)研究進展主要集中在結(jié)核分枝桿菌分子檢測和宿主標志物篩選鑒定兩方面。

一、結(jié)核分枝桿菌分子檢測及診斷價值評估

(一)結(jié)核分枝桿菌核酸擴增檢測

新一代Xpert——Xpert Ultra的主要目標是進一步提高檢測的敏感度(尤其是含菌量很少的結(jié)核病)和檢測利福平耐藥的可靠性[39]，WHO[40]推薦將其用于疑似TBM的初步檢測。Bahr等[41]用Xpert Ultra檢測成人并發(fā)HIV感染TBM患者的腦脊液，檢測敏感度可達70%；而用Xpert和培養(yǎng)檢測的敏感度均為43%。同時發(fā)現(xiàn)，檢測的腦脊液體積越大，TBM檢出率越高，如Xpert Ultra檢測≥6 ml和<6 ml腦脊液的陽性率分別為26%和7%。Wang等[42]發(fā)現(xiàn)，用Xpert Ultra和Xpert同時檢測含菌量少的痰、胸腔積液和腦脊液樣本時，兩者檢測利福平耐藥的效果相當，Xpert Ultra雖特異度略低(96.75%比98.37%)，但敏感度明顯占優(yōu)(44.19%比18.60%)。因此，Xpert Ultra和Xpert均具備自動化、快速的特點，但前者能檢出更多的TBM患者。

另外，新的技術(shù)方法也不斷嘗試用于TBM的診斷。Li等[43]采用新一代微滴數(shù)字PCR技術(shù)檢測腦脊液結(jié)核分枝桿菌IS6110核酸診斷TBM的總敏感度為57.4%(39/68)，特異度為97.0%(32/33)，敏感度顯著高于Xpert、實時熒光定量PCR、分枝桿菌培養(yǎng)和涂片檢測。Park等[44]首先采用同型雙功能亞氨酸酯和微流控平臺富集腦脊液中的結(jié)核分枝桿菌，然后再進行實時熒光定量PCR檢測，檢測敏感度可達100%，顯著高于分枝桿菌培養(yǎng)(20%)和Xpert(0%)。最新Meta分析顯示，核酸擴增檢測(包括商業(yè)化試劑盒和處于研發(fā)階段的檢測)診斷TBM的總敏感度和特異度分別為82%(75%～87%)和99%(98%～99%)(以培養(yǎng)為標準)，或68%(41%～87%)和98%(95%～99%)(以臨床表現(xiàn)加腦脊液抗酸桿菌陽性或培養(yǎng)陽性或核酸檢測陽性為標準)，提示單獨的核酸擴增檢測目前尚不足以替代培養(yǎng)的方法，但可與培養(yǎng)聯(lián)合使用以縮短檢測時間，同時也可用于不具備培養(yǎng)條件的地區(qū)[45]。

(二)結(jié)核分枝桿菌抗原檢測

除了LAM檢測，研究者們也試圖利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫組織化學等方法來直接檢測腦脊液中的結(jié)核分枝桿菌抗原，如蘋果酸合成酶G(GlcB)、熱休克蛋白X(HspX)、Rv3803c、抗原85B(Ag85B)、周質(zhì)磷酸結(jié)合脂蛋白1(PstS1)、早期分泌蛋白靶6(ESAT-6)、Rv2623等，但大多數(shù)準確性較差，無法應(yīng)用于臨床[46-48]。最近有研究評價了基于適配體檢測結(jié)核分枝桿菌抗原的方法。例如，以HspX抗原為靶標的兩種DNA適配體診斷TBM的敏感度分別為100%和95%，特異度分別為91%和97.5%[49-50]；以結(jié)核分枝桿菌蘋果酸合成酶為靶標的MS10-Trunc適配體診斷TBM的敏感度和特異度均超過97%[51]，提示此類方法用以提高TBM診斷效率上有潛力。我國也有采用適配體檢測結(jié)核分枝桿菌抗原[如帶甘露糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖Man-LAM、培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)和ESAT-6]診斷結(jié)核病的研究，但對TBM的診斷價值如何還缺乏系統(tǒng)評估[52-53]。

(三)基因組測序檢測

有研究用腦脊液宏基因組二代測序的方法檢測TBM確診患者，其敏感度和特異度分別為66.67%和100%，敏感度高于抗酸染色(33.33%)、PCR(25%)和分枝桿菌培養(yǎng)(8.33%)，該方法與傳統(tǒng)方法聯(lián)合診斷可使TBM的陽性檢出率達95.65%[54]。

二、基于宿主的TBM標志物的發(fā)現(xiàn)

(一)免疫學檢測標志物

由于基于細胞免疫的IGRA無法區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染，一些研究者嘗試發(fā)現(xiàn)新的結(jié)核分枝桿菌免疫原。Liu等[55]通過篩選1250個結(jié)核分枝桿菌蛋白，發(fā)現(xiàn)34個蛋白能夠誘導肺結(jié)核患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)釋放γ干擾素。Serra-Vidal等[56]發(fā)現(xiàn)Rv1733具有強免疫原性，用該蛋白刺激后進行IGRA檢測，能區(qū)分未感染、潛伏性結(jié)核感染和活動性結(jié)核病三種不同的狀態(tài)；同時發(fā)現(xiàn)Rv2389和Rv2435n也是潛伏性結(jié)核感染的候選標志物。也有一些研究從不同T細胞的功能和表型、細胞因子等方面尋找可區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染不同狀態(tài)的標志物[57-62]，一個研究提示腦脊液白細胞介素(IL)-12p40、IL-13等可能對TBM診斷有一定意義[63]。但總體上，這些新標志物尚處于發(fā)現(xiàn)和驗證階段，對TBM的診斷價值尚缺乏評價。

在結(jié)核分枝桿菌抗體檢測方面，Liu等[55]通過系統(tǒng)篩選發(fā)現(xiàn)了結(jié)核病患者血清中有29個結(jié)核分枝桿菌蛋白的抗體水平高于商業(yè)化的38 kDa(即相對分子質(zhì)量為38 000)蛋白抗體水平，其中很多蛋白是首次報道，它們對TBM是否有診斷意義尚待評估。

(二)蛋白標志物

利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的TBM腦脊液蛋白標志物有花生四烯酸5脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase, ALOX-5)[64]、神經(jīng)表皮生長因子樣類似物2(neural epidermal growth factor-like like 2, NELL2)[65]、人脂類代謝蛋白ApoB等[66]。其中NELL2在TBM腦脊液中顯著降低，其區(qū)分TBM與健康對照的敏感度和特異度分別為83.3%和75.0%[65]；ApoB在TBM腦脊液中明顯升高，其區(qū)分TBM與健康人群和病毒性腦膜炎對照的敏感度和特異度分別為89.3%和92.0%[66]。也有研究評價了一些蛋白分子對TBM的診斷價值。例如，腦脊液高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1, HMGB1)采用ELISA檢測TBM的敏感度和特異度分別為61.02%和89.94%[67]。腦脊液熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp)70 和Hsp 90，采用ELISA檢測TBM的敏感度分別為89%和88%，特異度分別為82%和89%[68]。另外，轉(zhuǎn)化生長因子β[69]、基質(zhì)金屬蛋白酶9[70]、白三烯B4[71]等在TBM腦脊液中也明顯升高，提示有潛在的輔助診斷意義。

對各種蛋白標志物進行聯(lián)合檢測也是提高TBM診斷效率的重要途徑。腦脊液血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、IL-13和抗菌肽LL-37三者聯(lián)合診斷兒童TBM的敏感度和特異度分別為52%和95%[72]，而腦脊液VEGF、γ干擾素和髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)聯(lián)合診斷兒童TBM的敏感度和特異度可分別提升至91.3%和100.0%[73]。

(三)微小核糖核酸(miRNA)標志物

有研究報道PBMC和腦脊液miR-29a診斷兒童TBM(以健康兒童為對照)的敏感度分別為67.20%和81.10%，特異度分別為88.50%和90.00%；兩種樣本聯(lián)合檢測的敏感度和特異度分別為84.40%和95.38%，表明miR-29a是兒童TBM診斷的潛在標志物[74]，但miR-29a能否區(qū)分TBM與其他類型腦膜炎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及對成人TBM有無診斷價值還需進一步研究。Pan等[75]通過全基因組miRNA微陣列篩選，發(fā)現(xiàn)了成人TBM患者PBMC樣本中的4個miRNAs標志物(miR-126-3p，miR-130a-3p，miR-151a-3p和miR-199a-5p)，經(jīng)獨立樣本驗證該標志物組合區(qū)分TBM和病毒性腦膜炎的敏感度和特異度分別為81.8%和90.0%，區(qū)分TBM和其他非TBM疾病的敏感度和特異度分別為81.8%和84.6%。

(四)代謝標志物

臨床上早已發(fā)現(xiàn)TBM患者通常腦脊液中氯化物和葡萄糖降低、乳酸升高，研究證明乳酸是宿主對感染反應(yīng)的L-乳酸，而非細菌來源的D-乳酸[76]。近年來出現(xiàn)了一些應(yīng)用代謝組學技術(shù)鑒定TBM代謝標志物的研究。Mason等[77]發(fā)現(xiàn)了16個有助于區(qū)分兒童TBM與非腦膜炎對照的代謝分子。Li等[78]篩選到25個有助于區(qū)分成人TBM和病毒性腦膜炎的代謝分子。van Laarhoven等[79]在TBM患者腦脊液中發(fā)現(xiàn)了250個升高和18個降低的代謝分子，而在血清中僅發(fā)現(xiàn)了5個差異性代謝分子，其中腦脊液色氨酸在TBM存活組中較死亡組和對照組中的濃度顯著降低，提示腦脊液色氨酸代謝對TBM預后非常關(guān)鍵，采取靶向干預措施有可能會改善患者預后。

展 望

TBM是一種嚴重的結(jié)核病類型，快速確診和及時治療是提高患者生存率的關(guān)鍵，但現(xiàn)有的實驗室檢測方法敏感度低，經(jīng)常所有檢測結(jié)果均為陰性或僅有某一種檢測結(jié)果陽性，幾種方法同時陽性的比例較低，因此有必要聯(lián)合多項檢測以提高檢出率。另外，由于TBM患者往往有中樞神經(jīng)系統(tǒng)外的結(jié)核病灶，Riste等[80]建議有條件的地區(qū)應(yīng)該采用胸部CT初篩，然后結(jié)合支氣管鏡檢查、支氣管灌洗液培養(yǎng)等手段積極尋找中樞神經(jīng)系統(tǒng)外的結(jié)核病灶，這種策略聯(lián)合Xpert Ultra等新型分子檢測技術(shù)有望進一步改善對TBM的診斷現(xiàn)狀。

除了利用和改進現(xiàn)有方法，研究者們也積極研發(fā)新技術(shù)和新標志物以提高TBM檢出率。結(jié)核分枝桿菌分子檢測仍將是未來研發(fā)的重點，而應(yīng)用高通量技術(shù)篩選TBM診斷標志物也是研究熱點。目前，新發(fā)現(xiàn)的標志物大多處于發(fā)現(xiàn)階段，一些研究結(jié)果不一致或僅在某個研究中報道，尚缺乏在不同地區(qū)、不同人群、不同病程階段和病情輕重不同的TBM患者中進行大樣本驗證，因而診斷價值如何還亟待做進一步評估。

與此同時，TBM實驗室診斷研究仍面臨著諸多問題和挑戰(zhàn)。首先，評估新方法或新標志物的診斷價值時納入標本十分困難。由于TBM發(fā)病率相對較低，能留取檢測的腦脊液樣本量有限，并且需要通過有創(chuàng)的腰椎穿刺獲取，因此腦脊液標本獲取非常困難，這使得許多研究的標本量很小，評估得到的診斷價值可靠性不高。其次，TBM納入標準不統(tǒng)一導致研究結(jié)果很難進行平行比較。根據(jù)Marais標準TBM分為確診(definite)、很可能(probable)和可能(possible)TBM三類[81]，而實際研究中有的僅納入確診TBM，有的納入確診和很可能TBM，有的則將所有可疑TBM全部納入，還有的研究采用其他分類標準，因此已發(fā)表的為數(shù)不多的研究結(jié)果也很難用來直接比較。第三，不同研究采用的對照往往不一致，得到的結(jié)果可能差異較大，因此在比較和評價結(jié)果時需要慎重。除了非腦膜炎對照，其他類型的腦膜炎對照(如細菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎、真菌性腦膜炎等)也有必要納入。盡管對照設(shè)置越多研究難度越大，但研究的發(fā)現(xiàn)和結(jié)論會更加可靠。

總之，盡管TBM實驗室診斷研究進展相對緩慢，也面臨著各種困難和挑戰(zhàn)，但新的研究和發(fā)現(xiàn)將帶給我們希望。相信隨著新標志物的發(fā)現(xiàn)、新方法的成熟，以及診斷價值的進一步明確，可以為TBM的早期診斷提供更強有力的工具。