環狀RNA 的生物學特性及其對牙源性間充質干細胞成骨分化的影響*

張 碩 劉洪臣

環狀RNA(circular RNAs,circRNAs)是一類特殊的內源性非編碼RNA，廣泛存在于真核生物、原核生物、病毒及古生菌中。CircRNAs 不同于線性RNA，其3’和5’末端相連接，形成共價閉合環狀結構，不易被核酸外切酶降解，從而更加穩定。最初，circRNAs 被認為是異常剪接形成的無價值的副產物，但隨著生物信息分析技術的發展及高通量測序技術的成熟和應用，circRNAs 重要的生物學功能被不斷探索和揭示。CircRNAs 可參與細胞生命活動、胚胎發育、神經發育及人類多種疾病的發生發展，并且是腫瘤、心血管疾病、神經系統疾病和糖尿病等疾病早期診斷的理想生物標志物[1]。

骨缺損在口腔頜面缺損中很常見，可由牙周炎骨吸收、無牙頜剩余牙槽嵴吸收以及由創傷、炎癥、腫瘤等造成，對患者的外形、功能和心理造成嚴重影響。隨著骨組織工程的不斷發展，利用組織工程骨修復頜面部骨缺損，從而恢復患者的美觀和功能已成為當今口腔醫學領域的研究熱點。成骨細胞作為骨組織工程的種子細胞，可由牙源性、骨髓源性和脂肪源性等多種間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化而來。其中，牙源性間充質干細胞(dental mesenchymal stem cells,DMSCs)自我更新能力強、免疫原性低且具有多向分化潛能，尤其是骨向分化能力，使其在骨組織工程中具有廣泛應用前景[2]。

DMSCs 成骨分化能力的正常發揮是修復缺損骨組織效果的保障。目前研究表明，circRNAs 可以通過多種分子和信號通路調控DMSCs 成骨分化，進而影響骨代謝過程[3]。因此，對circRNAs的生物學特性進行表征并綜述其對DMSCs 成骨分化的作用機制研究，有助于從新的角度了解骨再生過程，同時為尋找治療口腔頜面部骨缺損的潛在有效靶點提供新的途徑和理論基礎。

1.circRNAs 概述

1.1 circRNAs 的生物合成 根據circRNAs 在基因組中的來源及構成序列不同，可分為：外顯子環狀RNA(exon circRNA,EcircRNA)、外顯子-內含子環狀RNA(exon-intron circRNA,EIcircRNA)和內含子環狀RNA(circular intronic RNA,ciRNA)。它們都源自于同一親本基因，在順式及反式作用元件的調控下，特異性序列剪接環化而形成，屬于基因內circRNAs[4]。若circRNAs 為不同的親本基因融合后產生，如非小細胞肺癌患者血清中的F-circEA由EML4-ALK 基因融合產生，則稱為融合基因來源的環狀RNA(fusion-circRNA,f-circRNA)[5]。目前認為circRNAs 合成的驅動方式主要有三種：索套驅動環化或外顯子跳躍、內含子配對驅動環化或直接反向剪接、RNA 結合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)驅動環化[6]。

1.2 circRNAs 的特點 circRNAs 具有穩定性高、進化保守、組織特異性強等特點。與線性RNA 不同，circRNAs 不具有5’端帽子和3’端poly(A)尾巴，其閉合環狀結構可以抵抗核酸外切酶的降解作用，因此穩定性更高。此外，研究表明circRNAs 在不同物種間存在較多相似的序列，這種進化的相對保守性使得在豬、小鼠等動物模型中鑒定出的多種circRNAs 生物標志物在人類臨床也具有應用潛力[7]。CircRNAs 在表達上具有組織特異性，例如，源于Rmst 和Klhl2 的circRNAs 在小鼠大腦中大量富集，但在肺和肝組織中無表達[8]；在腫瘤組織和正常組織中circRNAs 表達差異顯著，且不同腫瘤細胞的circRNAs 表達也呈現種類和含量的差異，如hsa_circ_002059 在胃癌組織中低表達[9]，hsa_circ_0001649 在肝癌細胞中顯著低表達[10]。

1.3 circRNAs 的功能

1.3.1 作為miRNA“海綿” circRNAs 上存在miRNA 的結合位點，即miRNA 反應原件(miRNA response elements,MREs)，可以競爭性結合miRNA，抑制其與靶mRNA 結合，調控靶基因表達，起到miRNA“海綿”的作用[11]。研究發現，circRNA_33287 可以通過靶向結合miR-214-3p 分子的3’-UTR，消除miR-214-3p 對RUNX3 的抑制作用，上調RUNX3 的表達[12]；hsa_circ_0068871 可作為miR-181a-5p“海綿”，消除miR-181a-5p 對FGFR3 的抑制，從而激活STAT3 信號[13]。此外，一種circRNA 的多個結合位點可螯合多種miRNA 分子，影響其靶標的表達，如circHIPK3 可以通過18 個潛在的結合位點，結合9 種miRNAs，調控人類細胞增殖[14]。

1.3.2 與RBPs 作用 CircRNAs 上可存在一個或多個RBPs 的結合位點。CircFoxo3 通過結合周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinases 2,CDK2)及周期蛋白依賴性激酶抑制劑1(cyclin dependent kinase inhibitor 1,p21)形成復合體，抑制CDK2 功能，進而阻斷細胞周期[15]。CircPABPN1可以結合HuR 蛋白，阻礙HuR 蛋白與線性轉錄本PABPN1 的結合，從而下調PABPN1 的表達水平[16]。另有研究發現，circRNAs 經過N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修飾后，能夠以HRSP12 依賴的方式結合m6A 識別蛋白YTHDF2，介導RNase P/MRP 復合物降解circRNAs[17]。

1.3.3 參與調控基因的表達 circRNAs 能夠調控RNA 轉錄和選擇性剪接，進而調控宿主基因的表達。CircRNAs 多數位于細胞質，而EIcircRNAs和ciRNAs 位于細胞核[18]。研究發現，一些核內EIcircRNAs 可以在轉錄水平起到調控作用，如circ-EIF3J 和circ-PAIP2 能夠結合U1 小核核糖核蛋白(U1small nuclear ribonucleoprotein,U1snRNP)，形成的復合物進一步募集RNA 聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)，正調控親本基因的表達[18]；另外，ciRNAs 也可以調控基因轉錄，如ci-ankrd52 和ci-sirt7 在細胞核內結合Pol Ⅱ并作用于親本基因的啟動子，調控其轉錄過程[19]。

此外，circRNAs 在剪接水平上也可以調節基因的表達。通過反向剪接模式形成的EcircRNAs，競爭性減少了由線性拼接而產生的線性RNA 的表達[20]。例如，circMbl 的合成依賴剪接因子MBL的第二個外顯子序列環化，而circMbl 中存在MBL的結合位點，影響了MBL 前體mRNA 的剪接，調控線性基因的表達[20]。

1.3.4 編碼蛋白質 circRNAs 一般被認為是一種內源性非編碼RNA，但越來越多研究發現，circRNAs 具有編碼蛋白質的功能。Circ-ZNF609經過內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)驅動后，能夠直接翻譯小鼠成肌細胞的蛋白質，參與成肌分化過程[21]。另外，circRNAs 經過m6A 甲基化修飾后，能夠識別并結合YTHDF3蛋白，進而通過螯合eIF4G2 蛋白及一些翻譯起始因子，驅動自身的翻譯，表達蛋白質[22]。CircRNAs的編碼蛋白質功能具有重要的臨床疾病治療意義，如circ-FBXW7 能夠翻譯FBXW7-185aa 蛋白，與FBXW7 蛋白協同作用，下調c-myc 蛋白的表達，抑制惡性膠質瘤的發生[23]。

1.3.5 其他功能 circRNAs 可廣泛、穩定地存在于細胞外泌體中，使得其可作為癌癥診斷的生物標記物，如在結腸癌患者和健康人的血清外泌體中，可篩查出多種表達量具有明顯差異的circRNAs[24]。CircRNAs 還能夠通過反轉錄的方式衍生出假基因，對細菌、小鼠、人類等生物體的基因組結構產生影響[25]，例如在小鼠基因組中可鑒別到來源于circRFWD2、circDIAP3 和circSATB1 的假基因，其中circRFWD2 可衍生出至少33 個假基因[26]。此外，有研究發現circRNAs 具有調節mRNA 穩定性的功能，如小鼠巨噬細胞中的circ-RasGEF1B能夠增強TLR4/LPS 通路中mRNA ICAM-1 的穩定性[27]。

2.circRNAs 對DMSCs 成骨分化的影響

DMSCs 來源廣泛，包含多種干細胞參與牙的形成，包括牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)、牙濾泡細胞(dental follicle cells,DFCs)、根尖乳頭干細胞(stem cells of apical papilla,SCAPs)、牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)、脫落乳牙干細胞(stem cells of human exfoliated deciduous teeth,SHEDs)、牙胚細胞(tooth germ stem cells,TGSCs)、牙槽骨間充質干細胞(alveolar bone mesenchymal stem cells,ABMSCs)和牙齦間充質干細胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)。DMSCs 可分化為成骨細胞，用于修復受損的骨組織[28]，因此其在骨組織工程的應用受到廣泛關注，對DMSCs 成骨機制的研究也成為熱點。目前有研究發現，circRNAs 可以調控DMSCs骨向分化，在骨代謝進程中發揮重要作用[3]。

2.1 調控PDLSCs 成骨分化 PDLSCs 來源于牙周膜，具有形成牙骨質和骨組織的能力，可應用于骨缺損的修復。PDLSCs 經體外誘導可形成礦化結節，可檢測到堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨唾液蛋白(bonesialoprotein,BSP)表達[29]；在小型豬的牙周炎模型中，應用自體PDLSCs 與復合生物支架結合后植入牙槽骨缺損處，可觀察到有大量新骨生成[30]；PDLSCs 分別與骨及粘骨膜組織工程支架材料復合后體內移植,可顯著增高犬的牙槽嵴高度，實現牙槽嵴的增高重建[31]。

Zheng 等[32]誘導PDLSCs 成骨分化3、7、14天，檢測不同階段差異表達的circRNAs，結果顯示共有52 個circRNAs 持續發生改變。進而分析了miRNA 轉錄組并構建circRNA-miRNA-mRNA相互作用網絡，發現其中一些miRNAs 已被證明可以調節成骨過程，比如miR-204 靶向作用于Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor-2,RUNX2)抑制成骨并促進MSCs 的脂肪生成，miR-2816 通過過表達RUNX2 促進成骨細胞分化。因此，調控這些miRNAs 的circRNAs，如circNOTCH3和circCD59，可能在PDLSCs 成骨分化過程中發揮重要作用。

Gu 等[33]對PDLSCs 成骨誘導7 天，鑒定差異表達的circRNAs 并構建circRNA-miRNA-mRNA網絡，預測這些mRNAs 可能顯著參與成骨細胞分化、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、Wnt 通路和調控干細胞多能性的信號通路。其中，circRNA BANP 和circRNA ITCH 可能與成骨相關的miR-34a 和miR-146a 相互作用，并分別通過MAPK 通路中的關鍵基因DUSP1、FAS、RAC1 和PDGFRA、TGFBR2、MYC 調控PDLSCs 成骨分化。然而，它們的確切調節機制仍有待研究。

Li 等[34]研究了circRNA CDR1as 和miR-7 在PDLSCs 成骨分化中的潛在作用，發現CDR1as 在成骨分化過程中顯著上調，而miR-7 則顯著下調。敲低CDR1as 和過表達miR-7 會抑制ALP 活性、茜素紅S 染色和成骨基因的表達。此外，發現成骨相關基因GDF5 的3’-UTR 具有miR-7 的結合位點，敲低GDF5 可以部分逆轉miR-7 抑制劑對成骨細胞分化的影響。并且CDR1as 或GDF5 的下調會抑制Smad1/5/8 和p38 MAPK 的磷酸化，miR-7 的上調會降低磷酸化Smad1/5/8 和p38 MAPK 的水平。進一步體內實驗顯示CDR1as 敲低會導致骨形成減少。因此，認為CDR1as 通過下調miR-7 的表達，抑制miR-7 對GDF5 的負調控作用，進一步激活pSmad1/5/8 和p38 MAPK 通路，促進PDLSCs 骨向分化。

Wang 等[35]對PDLSCs 進行機械力誘導，在其成骨分化過程中檢測到2678 個差異表達的circRNAs。其中circRNA436 顯著下調，且circRNA-miRNA 共表達網絡顯示circRNA436 與miR-107 和miR-335 存在相互作用關系。有研究表明miR-107 可能下調Dkk-1 抑制骨肉瘤的發生和發展，miR-335 可通過Wnt/β-catenin 通路影響MSCs 成骨分化過程[36]。因此，circRNA436可能通過Wnt/β-catenin 通路調控PDLSCs 成骨分化。此外有研究發現MAPK 通路可在機械應力作用下的成骨細胞增殖中起重要作用[37]，而顯著上調的circRNA4214 可能通過MAPK 信號通路促進機械力誘導的PDLSCs 成骨分化。另外，circRNA126、circRNA3140、circRNA4045、circRNA4251 可能分別與miR-101、miR-21、miR-335、miR-107相互作用，調控機械力誘導的PDLSCs 成骨分化。

2.2 調控DFCs 成骨分化 DFCs 是牙囊基質內未分化的細胞，在體外可誘導生成類似牙骨質和骨的結構，提示其具有分化為成牙骨質細胞和成骨細胞的潛能[38]；體內實驗發現，大鼠DFCs 經過骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)2 及地塞米松刺激后，結合β-TCP 支架，移植到免疫缺陷小鼠的背部，可以觀察到有新骨形成[39]。此外，從人類牙濾泡中分離出的DFCs 可分化成骨用于修復鼠顱骨缺損[40]。

Du 等[41]誘導大鼠DFCs 成骨分化28 天，篩選出266 個差異表達的circRNAs。生物信息學分析顯示這些差異circRNAs 可參與MARK 和TGF-β等信號通路。并在Fgfr2 基因中發現了顯著上調的circFgfr2，可能調控其下游靶標miR-133 并對BMP6 起作用。進一步實驗發現，使circFgfr2 在rDFCs 中過表達會導致miR-133 表達下調及BMP6表達上調。因此認為circFgfr2 可能作為miR-133“海綿”，上調BMP6 的表達，從而在rDFCs 成骨分化過程中起到陽性調控因子的作用，但具體調控機制仍需進一步研究。

2.3 調控SCAPs 成骨分化 SCAPs 可從尚未發育完全的根尖組織中獲得。研究發現，牙乳頭細胞經體外培養后植入免疫缺陷大鼠體內，能夠形成牙骨質-編織骨樣組織，并在該結構周圍觀察到牙骨質-骨細胞樣細胞[42]，表明其具有成牙骨質和成骨分化的潛力。另外，有體外研究發現胰島素生長因子(insulin growth factor,IGF)-1 和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)能夠促進SCAPs 骨向分化[43,44]。

Li 等[45]通過構建成骨誘導7 天的SCAPs 模型，篩選出650 個組間表達差異顯著的circRNAs。GO分析顯示這些差異表達的circRNAs 宿主基因主要參與生物調控以及細胞代謝過程。KEGG 分析發現這些宿主基因與MAPK 信號通路、肌動蛋白細胞骨架調節和細胞內胞吞作用等有密切的關系。并且選擇10 個circRNAs、21 個miRNAs 及19 個mRNAs 構建circRNA-miRNA-mRNA 網絡，提示circRNAs 可能作為競爭性內源RNA 在SCAPs成骨分化過程中發揮作用。

2.4 調控DPSCs 成骨分化 DPSCs 為牙髓來源，可在體外形成新鮮自體骨，植入免疫缺陷大鼠皮下4 周后能夠改建為板層骨[46]。DPSCs 還可以復合多種支架材料，在體內外成骨，這顯示了其在骨組織工程中應用的巨大潛力[47]。此外，有研究表明，DPSCs 表面存在的雌激素受體利于DPSCs 骨向分化形成骨組織[48]；在成骨誘導培養基中添加維生素K2，可以在體外促進DPSCs 成骨[49]。

Ji 等[50]發現在DPSCs 成骨誘導過程中，circRNA124534 的表達顯著上調，而miR-496 下調，且二者存在結合位點。研究表明circRNA124534可以促進DPSCs 在體內外成骨分化，而過表達miR-496 逆轉了circRNA124534 的成骨分化作用，敲低miR-496 則能夠上調β-catenin 水平進而促進DPSCs 的成骨分化。因此證實了circRNA124534可以通過miR-496/β-catenin 通路調控DPCSs成骨分化過程。

Ji 等[51]研究顯示hsa_circ_0026827 的表達在DPSCs 源性成骨細胞分化過程中顯著增加，而下調其表達會抑制該過程。進一步研究發現，hsa_circ_0026827 可以作為miRNA“海綿”，結合miR-188-3p，上調miR-188-3p 的下游靶標Beclin1 和RUNX1 的表達，進而通過Beclin1 介導的自噬和RUNX1 促進DPSCs 成骨分化，即從機制上闡明了hsa_circ_0026827 的表達對體內異位骨形成所具有的重要促進作用。

3.結語

隨著生物測序技術日臻成熟，越來越多circRNAs被發現，同時circRNAs 的特性、功能及與疾病的關系也在逐步被揭示。DMSCs 的成骨分化潛能在骨組織工程中具有廣泛的應用前景，探討circRNAs對DMSCs 成骨分化的調控機制有助于從多角度理解骨代謝過程，并為治療口腔頜面部骨缺損提供潛在的靶點。目前研究表明circRNAs 可通過circRNA-miRNA-mRNA 相互作用調節DMSCs成骨分化進程。于是，可對circRNAs 進行調控，在多種分子和信號通路的參與下促進DMSCs 骨向分化，發揮其種子細胞功能，修復牙槽骨和顱面骨缺損，最終實現患者頜面部的美觀與功能重建。