微血管張力測定技術在血管內皮去除中的應用

張文文，唐 娜，孫瑞霞，鐘 華，何 芳

(1.新疆石河子大學第一附屬醫院重癥醫學科，新疆 石河子 832002；2. 新疆石河子大學醫學院病理生理教研室，新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002)

高血壓是全球范圍內影響人類健康最常見的心腦血管病之一，已成為目前重大的公共衛生問題。其患病率居高不下，且呈持續上升的趨勢[1]，目前我國高血壓控制現狀低于發達國家，因此，我國高血壓防治任重而道遠。

已知長期過高的血壓導致血管內皮功能障礙，而血管內皮功能障礙與心腦血管疾病也緊密相關，是其發生發展的病變基礎，因此改善血管內皮功能已成為心腦血管疾病治療的關鍵靶點[2]。

目前，關于微血管測量技術在疾病研究中應用的報道逐年增多，但是由于該技術操作步驟復雜、費時，限制了該技術在國內的應用普及[3]。尤其對于血管內皮功能障礙的研究，國內尚無統一的標準；已有關于血管內皮去除方式的研究，存在大小動脈相互混淆的現象，并不完全適用于所有微動脈的研究。而筆者對微血管壓力肌動血管內皮的去除所作的研究匯報，有助于血管內皮去除的標準化，提高微血管測量技術研究數據的可信度。

1 材料

1.1 實驗動物12周齡 ♂ ，體質量(200～250)g，自發性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)和正常血壓大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)，每組各6只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物合格許可證編號SCXK(京)2007-0001)，符合SPF清潔級標準。飼養條件：溫度(20±2) ℃、濕度(48±2)%。大鼠分籠飼養，飼養期間，大鼠自主飲食，自由飲水。適應性飼養1周后開始實驗，所有實驗均在符合動物實驗倫理要求下進行。

1.2 實驗試劑及配制苯腎上腺素(phenylephrine，PE，批號：LRAA9501)、硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP，批號：LRAA2556)、吲哚美辛(indomethacin，批號：WXBC4210V)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，批號：0915S04)均購自美國Sigma公司；乙酰膽堿(acetylcholine，ACh，批號：BCBR3675V)購自美國APexbio公司；L-NAME(批號：S287702)購自美國Selleck公司；其余試劑均為國產分析純。

溶液配制：生理鹽溶液(physiologic saltsolution, PSS)成分(mmol·L-1)：NaCl 118.9， KCl 4.69，MgSO4·7H2O 1.17，KH2PO41.18，CaCl22.5， NaHCO325，EDTA 0.026，G 5.5。高鉀外液(high potassium physiological salt solution，KPSS，相當于60 mmol·L-1KCl)成分(mmol·L-1)：KCl 123. 70，MgSO4·7H2O 1. 17，KH2PO41. 18，CaCl22. 5，NaHCO325，EDTA 0.026，G 5.5。充分搖勻溶解后，充入混合氣體(95%O2+5%CO2)，氧飽和10～15 min，時間過久易致液體中氣體過多，最后粘附于血管上，pH調節至7.40后使用。所配置的液體均放置在冰箱(4 ℃)中保存，使用前充分搖勻。

1.3 儀器壓力肌動圖系統(DMT，110P型)(丹麥Denmark公司)、倒置相差顯微鏡(美國Olympus公司)、光學顯微鏡(日本Olympus公司)、P-97微電極拉制儀(美國Sutter公司)、微型負壓吸引器(GL-802型)(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、撕囊鑷和角膜剪(蘇州六六視覺科技有限公司)、Dumont鑷子(意大利)等。

2 方法

2.1 大鼠血壓測量使用BP-6鼠尾無創血壓測量儀檢測大鼠清醒安靜狀態下尾動脈血壓，每只不少于3次，結果取平均值。

2.2 標本制備大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 40 mg·kg-1，待動物麻醉后斷頭處死，迅速取出腸管，注意：誤用力牽拉腸管，置于4 ℃、氧飽和的PSS液中。在裝有固定膠的培養皿中固定標本，注意：固定時不宜過度牽拉。在顯微鏡下仔細分離2級腸系膜動脈血管分支，注意區分動靜脈(動脈細、圓，彈性好，色淺；靜脈扁、寬，彈性差，色深)。仔細清除動脈周圍脂肪、結締組織，注意手法一定要輕柔，勿用力牽拉血管，碰觸血管，避免損傷血管內皮，降低血管活性。剪取無分支的血管段(長度2～3 mm)備用。

2.3 血管套接及血管內皮去除(Fig 1) 首先，排空微電極兩端的氣體，將血管一端套接在玻璃微電極上(直徑約50 μm)，注意誤碰及玻璃微電極尖端，防止電極斷裂或電極玻璃碎渣進入血管，平衡升壓階段，隨壓力升高，液體流動，劃破血管，致數據不準或實驗失敗。用10-0眼科尼龍線固定血管。用裝有過濾PSS液注射器緩慢沖走血管內的殘留物，注意手法要輕，誤用力過猛，損傷血管內皮。而微血管內皮去除，國內目前尚未見標準的方法。本研究方法其實施步驟如下：對于去除內皮的血管環，用撕囊鑷夾取血管的無需測量部分，將血管圍繞電極尖端輕輕旋轉1圈[4]，破壞血管內皮的完整性，注意：手法要輕，誤刺穿血管。然后血管一端套接完成后，用注射器向血管內推注氣體，再次破壞血管內皮完整性。之后用裝有過濾PSS液的注射器緩慢沖洗血管，以相同的方法套接血管的另一端。給予血管活性藥物之前，先給予吲哚美辛(環氧合酶抑制劑)、L-NAME(NO合酶抑制劑)共同預孵育血管20 min，且其持續存在于整個實驗過程[5]。將血管固定好的灌流槽迅速轉移至倒置顯微鏡臺上，開啟光學顯微鏡，調整放大倍數為10 (物鏡)×10 (目鏡)。將與電極兩端相連的玻璃瓶蓋用力旋緊，使其形成一個密封系統。接著進行管路氣體的排除，用裝有5 ml過濾PSS液的注射器將P1端管路里的氣體排至裝有過濾PSS液(100 mL)的玻璃瓶中，P2端管路里氣體排至廢液瓶中，整體形成一個液封狀態，確保整個循環中無殘留氣體，以防氣體流動至血管腔中，造成血管損傷。操作期間注意手法要輕緩，步驟要清晰，以免損壞壓力換能器。在恒溫(37 ℃)的水浴槽中持續恒速通以(95% O2和5% CO2)混合氣體。

Fig 1 Vascular socket and endothelial removal in water bath of pressure motor system

2.4 壓力平衡及血管活性檢測初始平衡階段保持液體流動，參數設定(首先開啟壓力、溫度，P1端20 mmHg，P2端5 mmHg)，以便沖走血管內的殘留物，平衡持續時間約為3 min；然后調整參數(P2端上調至20 mmHg，時間 5 min，之后以10 mmHg為一個梯度，每個梯度穩定5 min，使管腔內壓力逐漸升至60 mmHg穩定)；之后血管在60 mmHg穩定孵育1 h，平衡孵育期間每20 min更換1次水浴槽內的PSS液體。平衡穩定1 h后進行標準化檢測。先用血管收縮劑KCl(60 mol·L-1)收縮血管，激發最大血管活性，收縮平穩后，用內皮依賴性血管舒張劑ACh (10-5mol·L-1)舒張血管——舒張幅度大于70%～80%可認為內皮完整，小于10%則認為血管內皮去除。之后用PSS液連續沖洗3次，再次平衡穩定20 min后開始實驗。

2.5 記錄藥物對血管舒縮活動的影響檢測血管符合實驗標準后，正式開始實驗時，打開負壓吸引器(給藥期間負壓吸引器處于持續開啟狀態)，水浴槽內的PSS液控制在5 mL，采取累積給藥法依次加入不同濃度PE、ACh和/或SNP (10-9mol·L-1，10-8mol·L-1，10-7mol·L-1，10-6mol·L-1，10-5mol·L-1和10-4mol·L-1)，在血管反應達穩定狀態后，依次逐漸加入高一級別濃度的藥物，分別觀察并記錄該藥物對血管直徑的作用。用Myoview軟件控制血管內壓力并記錄實驗數據。

3 結果

3.1 大鼠血壓值比較如Fig 2所示，與WKY大鼠相比，SHR的血壓值(SBP、DBP、MAP)明顯增高(P<0.01)。

Fig 2 Comparison of blood pressure values between

3.2 血管內皮對大鼠腸系膜動脈血管收縮反應的影響給予不同濃度的PE收縮血管，觀察其對大鼠腸系膜動脈血管直徑的影響(Fig 3)，WKY和SHR腸系膜動脈對PE的收縮反應呈現明顯的濃度依賴性，隨PE濃度增加，血管收縮逐漸增大；無論內皮完整還是去除時，各濃度PE誘發的SHR血管收縮反應均明顯大于WKY大鼠(P<0.05)。內皮完整時，當PE濃度為10-7mol·L-1～10-4mol·L-1時，WKY和SHR腸系膜動脈收縮率分別為(3.21±0.32)%vs(8.96±1.00)% (P<0.01)、(7.56±0.90)%vs(15.93±0.92)% (P<0.01)、(30.59±1.00)%vs(40.78±0.63)% (P<0.01)、(34.52±0.40)%vs(44.56±0.68)% (P<0.01)。內皮去除時，當PE濃度為10-8～10-4mol·L-1時，WKY和SHR腸系膜動脈收縮率分別為(1.45±0.23)%vs(5.87±0.20)% (P<0.01)、(2.84±0.27)%vs(12.65±0.36)% (P<0.01)、(23.72±0.53)%vs(30.46±0.47)% (P<0.01)、(37.71±0.51)%vs(46.15±0.46)% (P<0.01)、(39.17±0.43)%vs(48.16±0.41)% (P<0.05)。而WKY和SHR內皮去除組分別與其內皮完整組相比，收縮反應增強，當PE濃度為10-6mol·L-1～10-5mol·L-1時，WKY腸系膜動脈收縮率分別為(7.59±0.90)%vs(23.72±0.53)% (P<0.01)、(30.59±1.00)%vs(37.71±1.25)% (P<0.01)。當PE濃度為10-8mol·L-1～10-5mol·L-1時，SHR腸系膜動脈收縮率分別為(5.16±0.92)%vs(5.87±0.20)% (P<0.05)、(8.96±1.00)%vs(12.65±0.36)% (P<0.01)、(15.93±0.92)%vs(30.46±0.47)% (P<0.01)、(40.78±0.63)%vs(46.15±0.46)% (P<0.01)。

Fig 3 Comparison of contractions and diastolic amplitudes of mesenteric artery inWKY and n=6)

3.3 血管內皮對大鼠腸系膜動脈血管舒張反應的影響給予不同濃度的ACh、SNP舒張血管后，觀察其對大鼠腸系膜動脈血管直徑的影響(Fig 4)，WKY和SHR腸系膜動脈對ACh、SNP的舒張反應呈現明顯的濃度依賴性，隨ACh、SNP濃度的增加，血管舒張逐漸增大。內皮完整時，各濃度ACh誘發的SHR血管舒張反應均明顯小于WKY大鼠(P<0.01)；內皮去除時，各濃度SNP誘發的SHR血管舒張反應均明顯大于WKY大鼠(P<0.01)，當ACh濃度為10-7mol·L-1～10-6mol·L-1時，WKY和SHR腸系膜動脈舒張率分別為(48.00±3.68)%vs(17.50±2.87)% (P<0.01)、(61.40±2.32)%vs(26.50±1.89)% (P<0.01)。當SNP濃度為10-7mol·L-1～10-5mol·L-1時，WKY和SHR腸系膜動脈舒張率分別為(2.86±0.50)%vs(21.59±0.30)% (P<0.01)、(7.37±0.68)%vs(40.10±0.40)% (P<0.01)、(13.78 ±1.22)%vs(46.41±0.12)% (P<0.05)。

Fig 4 Comparison ofcontractions and diastolic amplitudes of mesenteric artery inWKY and SHR n=6)

4 討論

機體微血管對組織器官的血流供應以及正常血壓的維持發揮著重要作用[7]，微血管結構功能障礙也是高血壓、冠心病、中風等疾病的危險因素。研究表明，高血壓為心腦血管疾病的主要誘因，發病的關鍵部位在血管，直接發病環節為外周血管阻力增高[8]，嚴重影響著人們的身心健康；同時微動脈與大動脈血管功能損傷也是高血壓發病的主要原因。完整的血管內皮在調節血管張力、正常血壓的維持、抑制血小板粘附和聚集以及白細胞的粘附、平滑肌細胞增殖等生理過程中具有重要作用[9]。在高血壓的發生發展過程中，血管內皮在受到高血糖、高血脂、氧化應激及體內高濃度的同型半胱氨酸等一系列有害因素作用時，內皮細胞釋放的舒血管因子減少，縮血管因子增多，打破了血管平衡穩態，從而導致血管收縮功能異常等一系列心腦血管事件的發生[10-11]。本研究結果也表明：SHR腸系膜動脈呈現明顯的血管收縮和舒張功能障礙。

血管內皮細胞是襯于心、血管和淋巴管內表面的單層扁平或多角形細胞，可通過分泌一系列血管活性物質發揮調節血管緊張性、抗血栓形成、抑制平滑肌細胞增殖及血管壁炎癥反應等功能[12]。內皮功能障礙是多種心血管疾病的標志(血管收縮、血栓形成和炎癥反應)，通過合成和釋放內皮源性收縮因子(超氧陰離子、血栓素A2、內皮素、血管緊張素II等)、舒張因子(NO、前列環素I2、ACh、內皮源性超極化因子等)，在血管張力、血壓調節、凝血、炎癥等過程中發揮關鍵作用。因此，對于維持血管內環境穩定，血管內皮起著至關重要的作用。所以，微血管、血管內皮已成為心腦血管疾病研究的重要方向。

已有的血管張力、壓力肌動技術報道，對大動脈和小動脈的血管功能研究報道也是相互混淆。目前已有的血管內皮去除的研究報道多為機械(棉簽、鋼絲、頭發絲摩擦等)和藥物(注射Triton X-100溶液)去除兩種方式[13-14]。筆者認為已有研究報道的血管內皮去除方式多適用于大動脈、血管張力的研究，由于微血管壓力肌動研究屬于等張收縮研究，且血管直徑過小，操作困難，對血管活性的要求高于普通血管張力系統的研究，已有報道的血管內皮去除方式并不完全適用于微動脈的研究。本研究采取壓力肌動技術檢測微血管功能，該技術的優點在于對血管本身及血管活性損傷較小，更好的模擬動物體內環境。本技術不同于普通血管張力研究，鋼絲需穿過血管的方式，容易損傷血管內皮，使實驗結果缺乏準確性[15]。本研究采取血管套接在玻璃微電極(直徑約50μm)，鑷子只需捏住套接電極的部分，而需要檢測的血管段保留其血管結構和功能的完整性，降低實驗數據的誤差。對于血管內皮的去除，本研究摒棄以往棉簽、鋼絲摩擦的方式，采取機械和藥物相結合的方式，將血管圍繞玻璃微電極尖端輕輕旋轉1圈[4]，血管一端套接完成后，向血管內推注氣體，破壞血管內皮。上述方式保證血管的良好活性，但不能保證血管內皮完全去除，所以給藥階段繼續給予吲哚美辛(環氧合酶抑制劑)、L-NAME(NO合酶抑制劑)共同預孵育血管20 min，抑制內皮源性舒張因子(NO、前列環素I2)的釋放，且吲哚美辛和L-NAME持續存在于整個實驗過程[5]。本研究方法不同于已有研究報道的單純將血管圍繞玻璃微電極尖端旋轉1圈[4]或者向血管內推注氣體，容易損傷血管，降低血管活性，不能更好的模擬動脈生理狀態，且不能保證血管內皮去除的程度。本研究在綜合既往研究報道的基礎上，經過反復實踐，證明本血管內皮去除的方法，可以大大降低對血管活性的損傷，更好的保證了血管的活性，結構、功能的完整性，提高實驗數據的準確性。在本研究中，每個內皮去除的血管環，均給予KCl收縮血管，待穩定后，給予ACh舒張血管，幅度小于10%，可以認為血管內皮的去除。本研究結果顯示：血管內皮去除后，WKY和SHR的血管收縮增強，以10-5mol·L-1最明顯(P<0.01)。對血管舒張的檢測，內皮完整時，與WKY大鼠相比，SHR的舒張功能明顯減弱；內皮去除后，給予內皮非依賴性血管舒張劑SNP，WKY大鼠的舒張反應明顯減弱，本研究結果與已有的研究相似，高血壓大鼠血管收縮反應增強，舒張反應減弱。筆者認為此血管內皮去除的技術方法可以用于之后的微血管內皮功能障礙研究中，以提高微血管測量實驗數據的準確性和可靠性。

(致謝: 本實驗在新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室完成，感謝課題組成員的幫助與支持。)