敲減microRNA-27a通過Wnt/β-catenin信號通路抑制腎細胞癌增殖和轉移

劉揚帆，蔡 政，魏光敏，王文廉，孫 星，盛 晶，劉 越，屈中玉

(1.鄭州大學附屬南陽市中心醫院腫瘤一科，河南 南陽 473009；2.云南省中醫醫院腫瘤科，云南 昆明 650021)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)占所有人類惡性腫瘤的2%～3%，是最致命的泌尿系統惡性腫瘤之一[1]。臨床上，腎癌切除術雖是腎細胞癌的常用治療方式，但患者預后并不理想。目前，miRNAs已被證明在多種腫瘤細胞的增殖、侵襲以及遷移過程中起調節作用[2]。作為眾多miRNAs的一員，miR-27a位于19號染色體上，是現在抗癌藥物研發的靶點之一。已有研究報道，miR-27a在乳腺癌[3]、肝癌[4]等多種人類腫瘤發生中發揮著啟動子的作用。然而miR-27a在RCC中的研究卻少見報道。據報道[5]，miR-27a可以通過Wnt/β-catenin通路調控結直腸癌的進展。且已有文獻表明[6]，激活Wnt/β-catenin通路能促進RCC細胞增殖、遷移與侵襲。因此，本研究首先檢測miR-27a在RCC組織以及RCC細胞中表達情況，并進一步觀察敲減miR-27a對RCC細胞增殖、轉移以及Wnt/β-catenin通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 胎牛血清(FBS, #SV30087.03)以及DEME培養基(#SH30021.01B)購買自美國Hyclone公司；抗生素(#15140122)購買自美國Gibco公司；細胞轉染試劑Lipofectamine 2000(#11668030)購買自美國Invitrogen公司；miR-27a inhibitor以及miR-NC購買自上海GenePharma公司；Taq PCR Master Mix試劑盒(#201445)購買自德國Qiagen公司；PVDF膜(#ISEQ00010)購自美國Millipore公司；抗β-catenin抗體(#GTX61089)購買自美國Genetex公司；RNAiso試劑(#9108Q)購買自日本TAKARA公司；CCK-8試劑盒(#CK04)購買自日本Dojindo公司；實驗中其它試劑均購自美國Sigma公司。

1.1.2儀器 小型垂直蛋白電泳儀、小型垂直電轉儀、GelDoc XR Biorad型凝膠成像系統和CFX96型熒光定量PCR 體系(Bio-Rad公司，美國)；ELx800型酶標儀(Bio-Tek公司，美國)；CX43型顯微鏡和BX63型熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2細胞培養與處理 正常腎小管上皮細胞(HK2)以及RCC細胞系Caki-1、786-O和ACHN購自ATCC。上述細胞均接種在含有10%FBS、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.3 臨床樣本獲取收集48例RCC患者的癌組織和癌旁組織，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期各12例。經病理檢驗，癌旁組織為正常腎臟組織。所有樣本采集自在我鄭州大學附屬南陽市中心醫院進行腎癌部分切除術或腎癌根治性切除術RCC患者，所有患者在實施手術前進行分期診斷。所有患者均知情同意，本研究通過鄭州大學附屬南陽市中心醫院倫理委員會批準。

1.4 轉染根據制造商說明書，通過Lipofectamine 2000將miR-27a-inhibitor以及miR-NC轉染至786-O和ACHN細胞。轉染48 h后，收集細胞用于后續實驗。

1.5 細胞增殖實驗收集已轉染miR-27a inhibitor和miR-NC的786-O和ACHN細胞分別接種在96孔板上，每孔接種5 000個細胞，37 ℃分別培養1～4天。培養時間達到終點時，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養箱內孵育2 h，隨后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.6 集落形成實驗收集已轉染miR-27a inhibitor和miR-NC的786-O和ACHN細胞分別接種在96孔板上，每孔接種100個細胞，37 ℃下培養10 d。 10 d后PBS洗滌并用甲醇固定，結晶紫染色后，采用顯微鏡下觀察。

1.7 Transwell細胞實驗侵襲實驗：收集已轉染miR-27a inhibitor和miR-NC的786-O和ACHN細胞分別轉移至在無血清培養基中培養12 h。然后分別取100 μL細胞(密度5×104細胞·mL-1)加入1 ∶8稀釋Matrigel 包被的Transwell上室面，將600 μL含有10%FBS的培養基置于下室。37 ℃培養24 h后，擦除上室上表面未穿膜的細胞，然后用4%多聚甲醛固定Transwell上室下表面的細胞，隨后用0.1%結晶紫染色，顯微鏡隨機選擇8個視野計數。遷移實驗：除不選用Matrigel 包被的Transwell板外，其他同侵襲實驗。

1.8 細胞劃痕實驗收集已轉染miR-27a inhibitor和miR-NC的786-O和ACHN細胞分別接種6孔板上，當細胞達到單細胞分子層融合時，使用無菌吸管尖端在細胞單層上制造人工劃痕。分別在劃痕后0 h和24 h后，用顯微鏡觀察，通過Image J計算愈合面積百分比。

1.9 LiCl處理取已轉染miR-27a inhibitor的ACHN細胞，分別加入10 mmol·L-1LiCl(Wnt/β-catenin信號激動劑)或等體積的溶媒DMSO，分別培養至指定時間后，采用CCK-8法檢測細胞增殖(方法同1.5)和Transwell檢測細胞侵襲與遷移(方法同1.7)。

1.10 RT-qPCR用RNAiso試劑從組織和細胞中提取總RNA。RNA通過逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。然后根據Taq PCR Master Mix試劑盒說明書步驟，將cDNA與引物一起在iQTMSYBR Green Supermix PCR體系中進行RT-qPCR。RT-qPCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性40 s， 60 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min，進行40個循環。引物序列為：miR-27a F: 5′-TTCACAGTGGCTAAG-3′，miR-27a R: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 F: 5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 R: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6作為內部參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-27相對表達水平。

1.11 免疫熒光取HK2細胞、ACHN細胞或者已轉染miR-27a inhibitor 的ACHN細胞，用4%多聚甲醛固定15 min并用0.3%Triton X-100室溫處理20 min。隨后加入一抗(β-catenin，1 ∶300)4 ℃下孵育過夜，d2用PBST洗滌三次后，加入熒光二抗孵育50 min，并用DAPI后避光孵育5 min復染。熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取10個視野，用Image J軟件分析熒光值。

1.12 蛋白質免疫印跡RIPA裂解液裂解細胞或組織后取全蛋白。利用BCA試劑盒將蛋白樣品統一定量，取相同體積蛋白樣品通過SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白。電泳結束后，將蛋白質轉移至甲醇預活化的PVDF膜。轉模結束后加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并以1 ∶1 000的稀釋比例孵育一抗(β-catenin)并 4 ℃過夜。d 2，TBST洗滌后室溫孵育HRP標記的二抗1 h，以TBST洗滌后化學發光顯影，Quantity One 軟件分析條帶的灰度值。

2 結果

2.1 miR-27a在各期RCC患者癌組織以及RCC細胞中的表達情況首先通過RT-qPCR檢測RCC癌組織以及癌旁正常腎組織中miR-27a的表達情況。結果(Fig 1A)顯示：與癌旁正常組織相比，RCC癌組織中miR-27a表達明顯升高(P<0.01)。進一步對RCC患者進行分期，檢測Ⅰ-Ⅳ期RCC患者癌組織中miR-27a的表達情況，結果(Fig 1B)顯示，miR-27a表達量隨RCC分期進展依次升高。采用RCC細胞系進一步驗證miR-27a的表達情況，結果(Fig 1C)顯示，相對于HK2細胞，Caki-1、786-O和ACHN細胞中miR-27a表達明顯升高(P<0.01)。提示，miR-27a在RCC癌組織和RCC細胞中高表達。

2.2 敲減miR-27a對RCC細胞集落形成能力以及增殖的影響將miR-27a inhibitor轉染至786-O和ACHN細胞中，觀察細胞集落形成能力和增殖。集落形成實驗結果(Fig 2A,2B)顯示，相比于miR-NC組，轉染miR-27a-inhibitor可降低786-O和ACHN集落數(P<0.01)。CCK-8法結果(Fig 2C,2D)顯示，相比于miR-NC組，轉染miR-27a-inhibitor可降低786-O以及ACHN細胞在450 nm處OD值(P<0.001)。提示，敲減miR-27a可抑制RCC細胞集落形成與增殖能力。

Fig 1 Expression of miR-27a in cancer tissues of RCC patients with different clinical stages and RCC cells

Fig 2 Knockdown of miR-27a on colony formation and proliferation in 786-O and ACHN n=3)

2.3 敲減miR-27a對RCC細胞遷移的影響將miR-27a inhibitor轉染至786-O以及ACHN細胞中，通過細胞劃痕實驗檢測細胞愈合遷移能力。結果顯示，相比于miR-NC組，轉染miR-27a inhibitor可明顯降低786-O細胞(Fig 3A)和ACHN細胞(Fig 3B)的劃痕愈合百分比(P<0.01)。

2.4 敲減miR-27a對RCC細胞侵襲和遷移能力的影響將miR-27a inhibitor轉染至786-O和ACHN細胞，通過Transwell法檢測細胞侵襲及遷移能力。結果顯示，與miR-NC組相比，轉染miR-27a inhibitor可明顯降低786-O細胞(Fig 4A)和ACHN細胞(Fig 4B)的細胞侵襲與遷移能力(P<0.01)。

2.5 Wnt/β-catenin信號通路參與miR-27a inhibitor抑制的RCC細胞增殖、侵襲和遷移Western blot結果(Fig 5A)顯示，相比于HK2細胞，ACHN細胞中β-catenin表達量明顯升高(P<0.01)。將miR-27a inhibitor轉染至ACHN細胞中，免疫熒光結果(Fig 5B)顯示，相比于miR-NC組，轉染miR-27a inhibitor的ACHN細胞β-catenin相對熒光密度明顯降低(P<0.01)，說明β-catenin表達量明顯降低。為證明敲減miR-27a通過Wnt/β-catenin信號通路調節RCC細胞增殖、侵襲及遷移，本研究進一步采用LiCl處理已轉染miR-27a inhibitor的ACHN細胞，實驗結果顯示，LiCl組細胞增殖(Fig 5C)、遷移(Fig 5D)、侵襲(Fig 5E)及能力明顯高于未經LiCl處理的細胞(P<0.01)。

3 討論

近年來，腎癌的發病率呈逐年增加趨勢[7]。但目前對腎癌的治療，特別是轉移后的RCC的特異性治療方面仍然有限。因此，對RCC轉移的機制的研究仍然是當今醫學科研工作者的重大的科研任務。

Fig 3 Knockdown of miR-27a on migration in 786-O and ACHN cells detected by cell wound healing n=3)

Fig 4 Knockdown of miR-27a on invasion and migration in 786-O and ACHN cells detected by Transwell n=3)

Fig 5 Wnt/β-catenin signaling pathway involved in proliferation, invasion and migration of ACHN cells inhibited by miR-27a inhibitor n=3)

鑒于許多miRNAs在腫瘤中作為腫瘤抑制因子或癌基因發揮作用的聲譽越來越高，因此，在RCC患者中檢測miRNAs可能為腎癌的診斷與治療提供一個有價值生物標識物。如：miR-378a-5p[8]、miR-1294[9]和miR-31-5p[10]等可以作為RCC的抑制因子，而miR-19[11]、miR-23a-3p[12]和miR-223-3p[13]等在RCC中發揮癌基因作用。作為miRNAs的一員，已有報道[3-4]，miR-27a在乳腺癌、肝癌等腫瘤的發促癌基因作用。然而，miR-27a在RCC中的研究尚少。 因此，我們采用RT-qPCR方法檢測了48名RCC患者癌組織及癌旁組織中miR-27a的表達，發現癌組織中miR-27a表達明顯高于癌旁正常組織，且，miR-27a表達量隨分期進展而增加。本研究在RCC細胞系(Caki-1、786-O和ACHN)進一步確認了miR-27a的高表達。這些結果提示miR-27a可能在腎癌的進展中起到促進作用。隨后，本研究將miR-27a inhibitor轉染至RCC細胞系786-O和ACHN中，發現敲減miR-27a可以抑制細胞增殖、集落形成、遷移與侵襲。為尋找敲減miR-27a抑制RCC細胞增殖與轉移的機制，本研究選擇了與RCC發生與進展相關的Wnt/β-catenin 信號通路。Wnt/β-catenin 通路激活后使 β-catenin 蛋白在胞質內累積，可導致腫瘤發生[14]。且已有文獻[6]表明，激活Wnt/β-catenin通路能促進RCC細胞增殖、遷移與侵襲。本研究結果表明，敲減miR-27a可降低ACHN細胞中β-catenin的表達，而通過LiCl激活Wnt/ β-catenin 信號通路能促進已轉染miR-27a inhibitor的ACHN細胞的增殖、遷移與侵襲。這一結果表明，敲減miR-27a通過Wnt/β-catenin 信號通路抑制RCC細胞增殖和轉移。然而miR-27a通過何種途徑作用于β-catenin還需要進一步研究。

綜上，本研究證明了miR-27a在RCC癌組織及RCC細胞中高表達，而敲減miR-27a可以通過Wnt/ β-catenin 信號通路抑制RCC細胞增殖和轉移。本研究為RCC的治療提高了新的研究靶點。