柴芩承氣湯通過抑制TLR4/NF-κB p65通路減輕小鼠重癥急性胰腺炎并發肝損傷

黨 琳，宋 亮，張曉芹，許小凡，張 紅,

(陜西中醫藥大學 1. 基礎醫學院、2. 醫學科研實驗中心，陜西 咸陽 712046)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)往往伴有多器官損傷[1-2]，其中，肝損傷是SAP病情發展過程中較早出現的胰外損傷之一，其損傷程度直接影響SAP的病情進展和預后，是患者并發多器官功能障礙后死亡的主要原因[2]。柴芩承氣湯(chaiqinchengqi decoction，CQCQD)可視為大柴胡湯與大承氣湯的合方或衍生方，是近年來臨床治療急性胰腺炎的有效方藥之一[3]。課題組前期實驗觀察到CQCQD對于大鼠SAP并發的肝損傷同樣具有明顯的保護作用，這可能與抑制肝組織氧化應激，減少單核巨噬細胞活化，降低白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)和單核細胞趨化蛋白1等炎性因子的表達有關[4]。然而，柴芩承氣湯抑制肝內炎性因子表達的分子通路尚不明確。已有研究表明，SAP發生后，肝臟內Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)能夠特異性識別細胞外抗原識別信號，并將刺激信號轉導入細胞內，活化核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)。作為調控多種細胞因子產生的重要轉錄因子，NF-κB可介導多種炎性因子的合成和釋放，進而參與SAP病程中肝功能障礙的形成[5-6]。

為了明確CQCQD在不同動物種屬中的治療效果，以及CQCQD是否通過抑制TLR4/NF-κB通路活化來發揮其肝內抗炎作用，本實驗通過給予SAP小鼠CQCQD灌胃治療，觀察其對SAP并發肝損傷的保護作用，以及對TLR4/NF-κB p65通路活性的影響，進一步探討CQCQD治療SAP肝損傷的作用機制。

1 材料

1.1 藥物CQCQD(購自陜西中醫藥大學附屬醫院)：柴胡10 g、黃芩10 g、丹參10 g、川芎10 g、梔子10 g、枳實10 g、厚樸10 g、生大黃15 g(后下)、芒硝10 g(烊化)，生藥量共95 g，前7味藥加水400 mL浸泡1 h，煎沸后文火繼續煎煮20 min，再加入生大黃煎5 min，然后加水300 mL煎煮第2次，最后將湯液濃縮至95 mL，加入芒硝烊化，形成CQCQD濃縮液(生藥量濃度為1 kg·L-1)，分裝后置4 ℃保存備用[4]。

1.2 試劑L-精氨酸(L-Arg，Sigma)；血清淀粉酶、脂肪酶、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)檢測試劑盒，均購自南京建成生物；IL-6 ELISA試劑盒(上海橋杜生物)；血清內毒素檢測試劑盒(GenScript)；抗TLR4抗體(博奧森)；抗IL-6抗體(Santa Cruz)；抗p-NF-κB p65抗體(Cell Signaling)；抗GAPDH抗體(博士德)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(TaKaRa)。

1.3 儀器正置數碼顯微鏡(德國Zeiss A1)；酶標儀(美國Bio-Tek ELX808IU)；蛋白質電泳及轉膜系統(美國Bio-Rad)；PCR儀(美國ABI 7500)。

2 方法

2.1 實驗動物分組與造模36只昆明小鼠，6～8周齡，體質量(25～30) g，購自空軍軍醫大學動物實驗中心，許可證書0001249。小鼠在室溫(20～24) ℃環境飼養，造模前12 h禁食，不禁水，隨機分為3組：對照組(Control)、重癥急性胰腺炎模型組(SAP)和CQCQD治療組(SAP+CQCQD)，每組12只。模型組和治療組小鼠給予20% L-Arg(3.3 g·kg-1，2次，間隔1 h)腹腔注射，建立SAP模型[7]。20% L-Arg第2次注射后30 min，治療組小鼠給予柴芩承氣湯濃縮液灌胃(19 g·kg-1·d-1，按成人體質量60 kg計算，等效劑量為成人用量的12.33倍)[8]，每日分2次給藥，連續給藥3 d。模型組小鼠給予同等劑量生理鹽水灌胃。

2.2 取材與檢測指標第1次L-Arg腹腔注射后72 h麻醉小鼠，下腔靜脈取全血，分離血清。取胰腺(稱重)及肝臟組織，部分組織固定于中性甲醛溶液，用于組織病理學檢測。部分組織低溫保存于-80 ℃冰箱，用于Western blot及PCR檢測。

2.2.1胰腺濕重比 胰腺濕重比=胰腺重量(g)/體質量(g)。

2.2.2組織病理學檢測 取胰腺及肝臟組織，常規石蠟切片(2 μm)，HE染色后觀察組織病理學改變。

2.2.3生物化學指標檢測 檢測血清淀粉酶、脂肪酶、ALT、AST活性，以及血清IL-6水平、血清內毒素含量，均按照試劑盒說明書進行操作。

2.2.4免疫組化檢測肝臟組織TLR4、p-NF-κB p65表達變化 取肝臟組織，常規石蠟切片。脫蠟，再水，檸檬酸緩沖液高溫抗原修復15 min，3% H2O2室溫孵育15 min(避光)，5%血清室溫封閉1 h，分別加入抗TLR4抗體(1 ∶500)、抗p-NF-κB p65抗體(1 ∶200)4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h，SABC室溫反應30 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明后封片。

2.2.5Western blot檢測肝臟組織TLR4、p-NF-κB p65表達變化 提取肝臟組織總蛋白。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，5%牛奶或BSA室溫封閉1 h，分別加入抗TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65抗體(1 ∶1 000)，以及抗GAPDH抗體(1 ∶500)，4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL化學發光法顯影。

2.2.6實時熒光定量PCR檢測肝組織IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、巨噬細胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α, MIP-1α)mRNA表達變化 提取肝臟組織總RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行擴增，檢測mRNA表達量(cyclophilin為內參基因)。引物序列如下：IL-6 正義鏈5′-GAAGTAGGGAAGGCCGTGG-3′，反義鏈5′-CTCTGCAAGAGACTTCCATCCAGT-3′。TNF-α正義鏈5′-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3′，反義鏈5′-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′。MIP-1α正義鏈5′-TGCCCTTGCTGTTCTTCTCT-3′，反義鏈5′-TTCTTGGACCCAGGTCTCTTT-3′。cyclophilin 正義鏈5′-ATGGTCAACCCCACCGTG-3′，反義鏈5′-TTCTGCTGTCTTTGGAACTTTGTC-3′。

3 結果

3.1 胰腺濕重比改變與Control組比較，SAP組小鼠的胰腺濕重比明顯升高，CQCQD治療能夠降低SAP小鼠的胰腺濕重比，變化程度約25%。提示SAP炎癥早期胰腺水腫明顯，CQCQD干預降低了SAP小鼠的胰腺水腫程度。見Fig 1。

Fig 1 Relative pancreatic weight of mice during SAP decreased by CQCQD treatment n=12)

3.2 胰腺、肝臟組織病理學改變如Fig 2所示，Control組小鼠胰腺細胞結構清晰，未見炎性細胞浸潤。SAP組小鼠胰腺組織明顯水腫，細胞結構模糊不清，可見大片凝固性壞死，間質內有大量炎性細胞浸潤及出血。CQCQD治療后，胰腺組織水腫程度減輕，片狀壞死區域減少。腺泡細胞輕度腫脹，仍可見不完整的腺泡結構，中性及巨噬細胞細胞浸潤減少。Control組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞形態大小一致。無胞質空泡形成，無出血、壞死及炎性細胞浸潤。SAP組小鼠出現肝細胞水腫，邊界模糊，胞質空泡形成及炎性細胞浸潤，且部分肝細胞壞死，肝臟毛細血管明顯充血。給予CQCQD之后，肝組織水腫、壞死及炎性細胞浸潤較SAP組小鼠均有不同程度的減輕。

3.3 血清淀粉酶、脂肪酶、ALT、AST含量改變Tab 1結果顯示，與Control組比較，無論是反映胰腺功能的血清淀粉酶和脂肪酶含量，還是反映肝臟功能的血清ALT和AST含量，在SAP組小鼠中均出現明顯升高，提示L-Arg注射誘發小鼠胰腺及肝臟功能受損，而CQCQD干預則能夠不同程度地降低上述血清生化指標在SAP小鼠中的活性。

3.4 血清內毒素含量改變SAP組小鼠血清內毒素含量較Control組小鼠明顯增加，CQCQD干預則能夠減少SAP小鼠血清內毒素含量(Fig 3)。

Fig 2 Pancreatic and liver injury of mice during SAP alleviated by CQCQD treatment (HE×100)

Fig 3 Endotoxin in serum of mice during SAP reduced by CQCQD treatment n=12)

3.5 肝組織TLR4表達改變免疫組化顯示，Control組小鼠肝組織內TLR4無表達，誘發SAP后，肝組織內TLR4的表達明顯增強，其主要分布于受損的肝組織區域，肝細胞和炎癥細胞均可見TLR4表達。CQCQD干預則可降低肝組織內TLR4的表達，鏡下僅可見少數陽性染色的細胞。Western blot結果顯示，類似于免疫組化的TLR4表達變化(Fig 4)。

3.6 肝組織p-NF-κB p65表達改變Fig 5的免疫組化顯示，Control組小鼠肝組織內未見p-NF-κB p65陽性細胞，SAP組小鼠肝組織內p-NF-κB p65表達則明顯增加，陽染細胞數明顯增多，且胞核與胞質內均可見其表達。CQCQD干預能夠明顯減少肝組織內p-NF-κB p65陽性細胞數。Western blot結果顯示類似的p-NF-κB p65表達變化。

3.7 血清IL-6含量和肝組織IL-6、TNF-α、MIP-1α mRNA表達改變與Control組比較，SAP組炎性因子表達明顯增加，表現為血清IL-6含量，肝組織內IL-6、TNF-α、MIP-1α mRNA水平均明顯升高。CQCQD干預則能夠降低血清IL-6，以及肝組織內IL-6、TNF-α、MIP-1α mRNA水平(Fig 6)。

Tab 1 Enzymes in serum of mice during SAP decreased by CQCQD treatment n=12)

Fig 4 Expression of TLR4 in liver of mice with SAP inhibited by CQCQD treatment n=3)

4 討論

中醫將急性胰腺炎納入“胰癉”“脾心痛”“腹痛”“結胸”等范疇，認為該病乃氣機郁滯、中焦宣泄不利、腑氣不通所致。根據“六腑以通為用”的中醫理論，采用通里攻下治療急性胰腺炎已取得共識。柴芩承氣湯是通里攻下法代表方藥之一[3]，方中柴胡疏肝解郁退熱、黃芩清熱燥濕解毒、枳實破氣消積散痞、厚樸燥濕下氣除滿、大黃瀉下攻積、涼血解毒，芒硝潤燥軟堅、瀉下通便。諸藥同用具有清熱解毒、活血化瘀、通里攻下的功效。臨床實驗表明[9]，早期應用CQCQD能夠減輕急性胰腺炎病人的臨床癥狀，降低器官損傷程度，縮短入院治療時間。動物實驗也發現，CQCQD不僅能夠減輕SAP發生時胰腺的損傷，而且對并發的肺臟[10]及肝臟[4]損傷也具有不同程度的保護作用。

Fig 5 Expression of p-NF-κB p65 in liver of mice with SAP inhibited by CQCQD treatment n=3)

課題組前期采用逆行膽管注射去氧膽酸鈉復制大鼠SAP模型，發現CQCQD干預可以緩解SAP并發的肝損傷，其機制與抑制肝組織內氧化應激，降低肝組織炎性因子的水平有關[4]。為了排除造模方法和動物種屬的依賴效應，本實驗選用L-Arg腹腔注射誘發小鼠的SAP模型，該方法操作簡單，L-Arg的用量與SAP的胰腺損傷呈正相關，易于控制SAP的病變程度，模型穩定[11]。此外，去氧膽酸鈉造模法所致模型動物12 h死亡率較高，多選擇在造模后4 h或者8 h處死動物，由于造模時間短、僅能給予1～2次CQCQD治療。相比之下，L-Arg造模法在72 h處死動物，允許持續進行CQCQD的干預，更有利于觀察中藥湯劑的治療效果。

Fig 6 Cytokines and chemokines of mice during SAP reduced

本研究結果顯示：模型組小鼠血清淀粉酶、脂肪酶、ALT和AST水平明顯升高，胰腺與肝臟均出現不同程度的損傷。進一步檢測炎性因子水平，發現小鼠血清內IL-6明顯升高，肝組織內IL-6、TNF-α、MIP-1α mRNA的水平也明顯高于對照組。柴芩承氣湯干預后，小鼠胰腺和肝組織損傷明顯緩解，表現為肝組織淤血水腫及肝細胞壞死程度的減輕，血清ALT、AST水平的降低，以及肝臟內炎性因子表達的減少。

我們的研究還發現，模型組小鼠血清內毒素含量明顯升高。已有研究認為[5]，SAP時易并發腸道功能紊亂、導致腸腔細菌增殖、腸黏膜屏障功能障礙、腸道細菌和內毒素易位、經腸腔吸收入血。作為腸道回流的首個臟器，肝臟遭受大量內毒素侵襲，將直接刺激肝組織中TLR4的表達。作為一種模式識別受體，TLR4廣泛分布于包括肝細胞在內的多種細胞，是革蘭陰性菌脂多糖胞內信號轉導的主要受體，二者結合后，可活化細胞內NF-κB信號通路，進而誘導包括TNF-α、IL-6等炎性因子的合成和釋放，引起組織的炎癥反應[12]。已有研究發現[13]，SAP發生時，肝組織內TLR4蛋白表達明顯上調，NF-κB活性增加，且與肝損傷程度呈正相關；抑制TLR4的表達則能夠減輕SAP動物的胰腺和肝組織損傷，提高生存率。因此，TLR4/NF-κB通路的活化已經被認為是調控SAP并發肝功能障礙的一個重要環節[14]。本研究發現，SAP組小鼠肝組織內TLR4蛋白表達明顯上調，其主要分布于受損的肝組織區域，而且肝細胞和炎癥細胞均可見TLR4表達。此外，p-NF-κB p65在SAP組小鼠肝組織中的表達明顯升高，而非磷酸化NF-κB p65的表達無明顯改變，說明NF-κB通路被激活。CQCQD干預后可見血清內毒素含量降低，肝臟內TLR4表達明顯下降，NF-κB的活化程度受到抑制，肝臟內炎性因子IL-6、TNF-α、MIP-1α水平也明顯下調。已有的臨床實驗顯示，CQCQD可促進腸蠕動以改善腸道運動功能，因此認為CQCQD可能通過排除胃腸積滯，減輕腸道內毒素易位[15]，抑制TLR4/NF-κB通路活化及其下游炎癥因子的釋放，進而發揮防治SAP并發肝損傷的作用。