養心氏片對動脈粥樣硬化模型小鼠的作用機制研究

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴重危害人類健康的一類疾病，冠心病(CAD)是其主要疾病之一，冠心病又稱缺血性心臟病。根據世界衛生組織(2014)報告，缺血性心臟病是全世界死亡的主要原因之一，每年700多萬人死于缺血性心臟病[1]。目前，中醫藥治療冠心病的研究取得了良好的療效。多項臨床實驗證明，養心氏片(YXS)治療冠心病療效較好，但其機制研究較少，本實驗研究養心氏片治療AS模型小鼠的可能作用機制，為其臨床應用提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 雄性載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠40只，雄性C57BL/6J小鼠8只，均為SPF級，動物購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證編號：SCXK(京)2014-0004。基礎飼料：由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。高脂飼料為購于江蘇美迪森生物醫藥有限公司的乳脂實驗動物純化飼料MD12015(21%乳脂，0.15%膽固醇)。

1.2 藥物及制備 養心氏片(由青島國風藥業股份有限公司提供，薄膜衣片，批號081204)，阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，薄膜衣片，批號H20051408)，將養心氏片或阿托伐他汀鈣片研磨后溶解于蒸餾水中，配制成濃度為0.140 g/mL、0.070 g/mL、0.035 g/mL的養心氏片高、中、低劑量組及濃度為0.257 mg/mL的阿托伐他汀鈣片，按動物體重給藥，每10 g動物給藥0.1 mL。

1.3 試劑及儀器 FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒[批號KR116，天根生化科技(北京)有限公司]；動物組織總RNA提取試劑盒[批號DP431，天根生化科技(北京)有限公司]；SuperReal熒光定量預混試劑 [批號FP205，天根生化科技(北京)有限公司]；DNA酶1[批號RT411，天根生化科技(北京)有限公司]；β-巰基乙醇(天津市江天化工技術有限公司)；紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司，型號756MC)；Veriti PCR 熱循環儀(美國ABI公司，型號4375786)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司，型號7500fast)；光學顯微鏡(日本Olympus公司，型號BH-2)；體視鏡(德國，LEICA公司)；LEICA CM1900組織包埋機(德國Leica公司)；低速離心機(北京京立離心機有限公司，型號LDZ5-2)；引物由上海生物工程有限公司設計及合成。

1.4 動物造模及給藥 8周齡雄性C57BL/6J小鼠及ApoE-/-小鼠，均飼養于天津市人民醫院動物房小鼠飼養籠內，每籠2只，飼養室恒溫(22±2)℃。人工光照明暗各12 h。所有小鼠在予普通飼料適應性喂養1周后，C57BL/6J小鼠繼續予普通飼料喂養，ApoE-/-小鼠予高脂飼料喂養12周復制AS模型。ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養12周后，將其隨機分為模型組、養心氏片高劑量組、養心氏片中劑量組、養心氏片低劑量組、陽性對照組，每組8只。C57BL/6J小鼠8只作為正常對照組。給藥方法：養心氏片高、中、低劑量組分別給予1.40 g/(kg·d)、0.70 g/(kg·d)、0.35 g/(kg·d)，相當于70 kg成人臨床劑量的2倍、1倍、0.5倍的養心氏片灌胃，陽性對照組給予2.57 mg/(kg·d)阿托代他汀鈣，相當于成人20 mg/d臨床劑量的阿托伐他汀鈣片灌胃，每日1次；模型組及正常對照組給予等量的高溫滅菌蒸餾水灌胃，每日1次。灌胃時間為12周。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色及升主動脈斑塊校正后斑塊面積測定 灌胃12周后處死小鼠，小鼠處死后迅速打開胸腔，左心室逆行灌注液體至主動脈，鈍性分離主動脈(從升主動脈至髂動脈分叉處)，自頭臂干分叉處向近心端取主動脈0.3 cm(升主動脈)置于4%的多聚甲醛中固定，備做病理標本。常規石蠟包埋切片，切片厚度5 μm，采用HE染色，用Image J 軟件檢測血管面積及斑塊面積。測量管腔面積(LA)、內彈力膜圍繞面積(IELa)，計算斑塊面積(PA)及校正后斑塊面積。斑塊面積=IELa-LA， 校正后斑塊面積=PA/IELa。其余組動脈于-80 ℃冰箱保存。

1.5.2 實時熒光定量(qPCR)法檢測主動脈組織各因子 檢測核轉錄因子-κB(NF-κB)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、血管內皮細胞黏附分子-1(VCAM-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA的表達。采用動物組織總RNA提取試劑盒提取小鼠主動脈組織總RNA，微量分光光度計檢測RNA樣品純度。然后按照反應體系進行逆轉錄，RT-PCR反應體系及條件按試劑盒說明書進行。以GAPDH作為內參照基因，GAPDH上游：5′-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3′，GAPDH下游：5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′；MCP-1上游： 5′-CCACTCACCTGCTGCTACTCATTC-3′，MCP-1下游：5′-CTGCTGCTGGTGATCCTCTTGTAG-3′；VCAM-1上游：5′-ATCTCAGGTGGCTGCACAAGTTG-3′，VCAM-1下游：5′-AGCGCACAGGTAAGAGTGTTCATC-3′；IL-6上游：5′-ACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3′，IL-6：下游 5′-TTAAGCCTCCGACTTGTGAAGTGG-3′；TNF-α上游：5′-GCGACG TGGAACTGGCAGAAG-3′，TNF-α下游： 5′-GCCACAAGCAGGAATGAGAAGAGG-3′；NF-κB上游：5′-GACACGACAGAATCCTCAGCATCC-3′，NF-κB下游：5′-CCACCAGCA GCAGCAGACATG-3′；PCR反應條件：95 ℃，10 min； 95 ℃，15 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；循環40次。然后進行20 min的產物溶解程序，作溶解的曲線分析，將不同濃度的定量模板對數和相應的CT值作圖。結果判定：△CT= CT- CTGAPDH。用各實驗組樣本的△CT減去正常對照組樣本的△CT，得到△△CT，以2-△△CT表示mRNA的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組小鼠升主動脈HE染色結果 正常對照組小鼠動脈管腔未見明顯改變，管壁外、中、內膜3層結構明顯，內膜光滑無增厚，內皮細胞完整連續，內膜下無沉積的脂質及斑塊形成，彈力板完整，中膜血管平滑肌細胞長呈梭形，整齊排列；模型組小鼠主動脈壁有明顯的斑塊形成，管腔狹窄，內皮細胞缺失或不完整，內膜表面不光滑，斑塊內可見大量泡沫細胞浸潤，脂質豐富，膽固醇結晶形成，有時可見斑塊破裂、出血、血栓形成。各藥物治療組主動脈亦可見內膜增厚、斑塊形成，但與模型組相比較，斑塊病變減輕，斑塊面積減小，泡沫細胞和脂質減少，膽固醇結晶減少。詳見圖1。

圖1 各組小鼠升主動脈HE染色結果

2.2 各組小鼠升主動脈斑塊校正后斑塊面積比較 各給藥組與模型組相比，升主動脈斑塊校正后斑塊面積比較差異有統計學意義(P<0.05)，與養心氏片高劑量組相比，養心氏片低劑量組與養心氏片中劑量組升主動脈斑塊校正后斑塊面積差異有統計學意義(P<0.05)，且升主動脈斑塊校正后斑塊面積隨養心氏片劑量水平的上升而逐漸下降，呈量效關系，而養心氏片高劑量組與陽性對照組升主動脈斑塊校正后斑塊面積相比差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

2.3 各組小鼠主動脈NF-κB信號通路相關因子表達水平比較 與正常對照組小鼠相比，模型組及各給藥組小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達水平明顯上調(P<0.05)。各給藥組小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達水平低于模型組小鼠，差異有統計學意義(P<0.05)。養心氏片高劑量組小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達水平低于養心氏片低劑量組及養心氏片中劑量組，差異具有統計學意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性，即小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達水平隨養心氏片給藥劑量的增加而下降。養心氏片高劑量組小鼠主動脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達水平與陽性對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表1 各組小鼠升主動脈斑塊校正后斑塊面積水平(±s) mm2

與模型組比較，1)P<0.05；與養心氏片高劑量組比較，2)P<0.05

表2 各組小鼠主動脈NF-κB信號通路相關因子表達水平比較(±s)

1)與正常對照組比較，P<0.05；2)與模型組比較，P<0.05；3)與養心氏片高劑量組相比，P<0.05

3 討 論

AS的治療一直是研究的熱點，AS是一種由多種因素導致的慢性血管性炎癥性疾病，目前臨床上治療AS主要采用介入治療或降脂治療，介入治療風險較大，而降脂藥長期服用易損傷肝功能，停藥后血脂水平極易反彈，甚至比未用降脂藥之前血脂水平更高，導致很多病人不能長期耐受。中醫診治具有辨證論治及整體治療的雙重特點，中藥毒副作用小，長期服用無明顯不適，耐受性強，其作用多靶點、多途徑，可根據病人的情況調整用藥，較西藥用藥更加靈活，可作為治療AS的一種長期有效的療法。

多項臨床試驗證明，養心氏片對冠心病具有良好療效，養心氏片源于著名老中醫周次清的臨床經驗方，由人參、黃芪 、丹參、醋延胡索等13味藥物組成，具有益氣活血、化瘀止痛的功效。以“養心理論”為指導思想所創造的養心氏片，圍繞著“心主血、心主脈、心藏神”的生理功能，體現著養心氏片以補為養、以通為養、以安為養的學術思想，主治冠心病氣虛血瘀證。統計顯示：冠心病的13種中醫證型中氣虛血瘀證占13.85%，排名第三，而在腦梗死13種中醫證型中，氣虛血瘀證占19.42%，排名第二[2]。流行病學調查顯示：長春地區肥胖合并頸動脈粥樣硬化的四大主要證型之一是氣虛血瘀證[3]。由此可見AS常見證型是氣虛血瘀證。

近年來有大量的研究關于NF-κB活性抑制藥延緩AS病程的報道，故NF-κB信號通路在AS進程中起關鍵作用[4]。研究發現，從早期的脂質氧化、內皮細胞受損，到AS斑塊的形成，始終伴隨著炎癥反應，而在AS形成中，參與炎癥反應的很多重要炎癥因子都是 NF-κB 的靶基因，NF-κB信號通路調控了這些炎癥因子的轉錄[5]。典型的NF-κB是由多肽鏈p50和p65亞基組成，當細胞處于靜息狀態時，NF-κB與抑制蛋白(IκB)結合形成三聚體，其在細胞質中以無活性的形式存在[6]，當細胞受到外界信號刺激時，IκB發生磷酸化并降解，此時NF-κB逃離IκB的控制而被激活，NF-κB進入細胞核內并與靶基因相應部位結合，開啟相關基因的轉錄[7-8]。在 AS中，NF-κB 是黏附分子、趨化因子、細胞因子、炎癥因子以及生長因子的重要調控因子，可促進斑塊的形成與發展，最終導致斑塊破裂引起冠心病以及腦卒中等危重心血管疾病的發生[9-10]。NF-κB是一類具有調控基因轉錄作用的因子，促進炎癥反應的發生是通過激活多種細胞因子表達來實現，目前已知細胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達受到轉錄因子的調控[11]。TNF-α通過正負反饋激活NF-κB，引起炎癥持續發生導致AS。TNF-α以通過激活 NF-κB 信號途徑，促使大量的炎癥因子與黏附分子在內皮細胞合成，這些因子可以激活或者募集各類炎癥細胞，導致內皮細胞凋亡，加速血管氧化、炎癥反應及血栓形成[12]。VCAM-1是免疫球蛋白超家族的成員，在機體受到致炎因子如TNF-α、IL-6的刺激下，VCAM-1的表達會增加，參與淋巴細胞的活化與遷移，并在炎癥過程中起重要作用[13]。NF-κB可調控TNF-α、IL-6、VCAM-1、MCP-1的表達，一方面，TNF-α、IL-6可促進內皮細胞表達VCAM-1，可誘導單核細胞黏附至血管內皮，衍變成為泡沫細胞，另一方面，TNF-α、IL-6促進巨噬細胞表達MCP-1，可趨化單核細胞遷移入動脈內皮下層，然后巨噬細胞通過攝取氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)形成泡沫細胞，加速動脈粥樣斑塊的形成，更重要的是，TNF-α、IL-6可進一步活化NF-κB，促進TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1的表達，形成一個惡性循環，加劇AS的發展[4]。

本實驗結果證明，養心氏片可降低主動脈NF-κB信號通路下游相關因子TNF-α、IL-6、VCAM-1、MCP-1的表達。表明養心氏片可通過調節NF-κB信號通路降低炎癥反應，減少趨化單核細胞在受損血管內皮處轉化為巨噬細胞，減緩泡沫細胞的形成，發揮AS的作用，而養心氏片高劑量組對NF-κB信號通路相關因子的調節效果與阿托伐他汀無明顯差異。提示養心氏可有效改善AS，其機制可能與降低AS小鼠升主動脈斑塊校正后斑塊面積及下調主動脈NF-κB信號通路相關因子 mRNA的表達有關。