活血解毒降糖方對糖尿病大鼠動脈粥樣硬化內質網應激的實驗研究

糖尿病動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是慢性炎癥相關的代謝性疾病，內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是代謝異常與炎癥反應之間的橋梁，2004年Ozcan 等[1]在Science發表文章指出，ERS是多種應激源的共同通路，是糖尿病胰島素抵抗及其并發癥發生發展的重要環節，因此，ERS可望成為治療糖尿病的一個新靶點。盡管糖尿病AS發病機制復雜，但高糖、高脂、氧化應激狀態、炎癥反應等糖尿病的病理狀態均與ERS有關，連接代謝異常和糖尿病發生發展的過程，可引起巨噬細胞和平滑肌細胞凋亡，參與糖尿病AS的發生與發展[2]。糖尿病和冠心病分別屬于中醫學消渴和胸痹范疇，消渴并胸痹在病機上存在氣陰兩虛、燥熱內蘊，遷延日久，煉液成痰，陰損及陽，血凝為瘀，痰瘀內蘊久而成毒，因此氣陰兩虛、瘀毒內蘊是消渴并胸痹的主要病機[3]。本課題的前期臨床研究發現，具有滋陰益氣、活血解毒作用的活血解毒降糖方(Huoxue Jiedu Jiangtang Formulation，HJJF)，能明顯降低促炎因子，調節抗炎/促炎平衡，能有效抑制糖尿病急性冠脈綜合征(冠心病危重形式)非血運重建病人炎癥反應，改善病人臨床療效[4]。本研究以大鼠為實驗研究對象，從內質網應激偶聯炎癥反應機制，進一步探討HJJF干預糖尿病AS發展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 建立模型 體重220～250 g雄性SD大鼠120只，在室溫 22～25 ℃，相對濕度40%～50%的實驗室，進行分籠飼養，每籠4只。大鼠由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK(桂)2014-002。適應性普通飼料(江蘇省協同生物工程有限公司)喂養7 d后，空腹10 h后， 腹腔內單次注射鏈脲佐菌素(北京華越洋生物科技有限公司)50 mg/kg，72 h后尾靜脈采血，采用血糖試紙(武漢博士德生物工程有限公司)檢測空腹血糖(FBG)，以連續2次FBG≥16.7 mmol/L 的大鼠作為糖尿病模型，隨后進行高脂飼料(普通飼料78.2%，豬油10%，膽固醇1.5%，蛋黃粉10%，豬膽鹽0.3%。江蘇省協同生物工程有限公司供給)喂養3個月，每天記錄進食量及飲水量。另設正常組(25只)，予腹腔內注射等量生理鹽水，普通飼料喂養。

1.2 大鼠分組與給藥 大鼠最后造模成功102只，隨機進行分組，模型組25只，格列喹酮+貝那普利組(西藥組)26只，HJJF低劑量組26只，HJJF高劑量組25只，并開始給藥。活血解毒降糖方組方：人參、黃芪、麥冬、山茱萸、地黃、大黃、鱉甲、桃仁、丹皮、黃連、丹參、山藥、五味子。購自右江民族醫學院附屬醫院，制成浸膏，1 g相當于原生藥10 g。低劑量組按1.0 g/(kg·d)、高劑量組按1.5 g/(kg·d)灌服活血解毒降糖方混懸液；西藥組用格列喹酮(北京萬輝雙鶴藥業有限責任公司)7.50 mg/kg和貝那普利(北京諾華制藥有限公司)2.50 mg/kg，配成等體積溶液灌胃，共給藥8周，并繼續高脂飲料喂養；模型組僅給高脂喂養，正常組一直普通飼料喂養。實驗操作均在超凈工作臺內進行。

1.3 取材 動物給藥60 d后，禁食12 h，可飲水，再次對各組大鼠FBG檢測后，用8%戊巴比妥鈉，按2 mL/kg劑量腹腔注射麻醉，腹正中開腹，下腔靜脈采血7～10 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存，用以指標檢測；剝離主動脈，生理鹽水沖洗，取胸主動脈，-80 ℃冷藏，用于RT-PCR 實驗。

1.4 指標測定

1.4.1 血脂、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測 采用全自動生化儀測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG )、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD含量，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定IL-6、TNF-α、GSH-Px水平，試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。具體實驗步驟按試劑盒說明進行。

1.4.2 Rea1-time PCR法檢測主動脈GRP78、JNKmRNA的轉錄水平 從-80 ℃冰箱取出主動脈，放入研缽中進行研磨，提取總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳后檢測其完整性；按照反轉錄試劑盒說明書操作，先42 ℃ 50min再95℃ 5min逆轉錄為cDNA。將獲得的cDNA作為模板進行PCR擴增目的基因(按照Rea1-time PCR試劑盒說明書操作)，內參基因和目的基因引物由上海吉凱基因公司設計合成，內參GAPDH上游引物為5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物為5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′，擴增長度114 bp；GRP78上游引物為5′-CTTGGTATTGAAACTGTGGG-3′，下游引物為5′-TGTTACGGTGGGCTGATTAT-3′，擴增長度117 bp；JNK上游5′-GGATTTGGAGGAGCGAACTAA-3′，下游5′-ACTGCTGTCTGTATCCGAGGC-3′，擴增產物為163 bp。PCR循環參數為96 ℃4 min，然后94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s三步反應，40個循環。記錄達到所設定的閾值時所經歷的循環數即CT值，利用溶解曲線檢測引物的特異性，表達量的計算方法采用2-△△Ct法，△Ct=Ct目的基因-CtGAPDH，△△Ct= 實驗組(Ct目的基因-CtGAPDH)-對照組(Ct目的基因-CtGAPDH)，2-△△Ct=2-△Ct實驗組/2-△Ct對照組，具體計算時以對照組表達量為1，則比值即為實驗組的相對表達量。

1.5 TUNEL法檢測主動脈細胞凋亡 用TUNEL法檢測主動脈細胞凋亡，試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司，把石蠟包埋的主動脈切成4 μm的薄片，行脫蠟，漂洗，加蛋白酶，室溫15 min，加3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，室溫1 min，加TUNEL液，37 ℃反應1 h，加過氧化物酶，加二氨基聯苯胺(DAB)，室溫10 min，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，最后樹脂封片，光學顯微鏡下觀察，正常細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕黃色，每張陽性切片選取5個陽性細胞最多的視野，計算陽性細胞所占的百分比，即細胞凋亡指數。

2 結 果

2.1 大鼠實驗過程中變化情況 大鼠造模成功后，飲水量多，尿量多，體重有所減輕，毛色枯黃，行動遲緩，反應遲鈍，但灌藥實驗過程中無大鼠死亡。

2.2 活血解毒降糖方對大鼠FBG、SOD、GSH-Px、TNF-α和IL-6活性的影響 與模型組相比，各給藥組FBG明顯降低(P<0.05)，抗氧化酶SOD、GSH-Px升高(P<0.05)，炎癥因子TNF-α、IL-6降低(P<0.05)；HJJF高低量組較西藥組療效好，并隨HJJF劑量增加效果更顯著(P<0.05)，但HJJF高低量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 活血解毒降糖方對大鼠FBG、SOD、GSH-Px、TNF-α和IL-6活性影響的比較(±s)

與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

2.3 活血解毒降糖方對大鼠血脂的影響 與正常組相比，模型組大鼠TC、TG、LDL-C含量均顯著升高(P<0.01)，HDL-C明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，給藥后各組大鼠的TC、TG、LDL-C含量均降低，HDL-C含量均升高(P<0.05)，HJJF組療效隨劑量增加更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；HJJF高、低劑量組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 活血解毒降糖方對大鼠TC、TG、LDL-C和HDL-C的影響(±s) mmol/L

與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

2.4 活血解毒降糖方對大鼠主動脈GRP78、JNK mRNA轉錄水平的影響 與正常組相比，模型組大鼠的GRP78、JNK mRNA表達均顯著升高(P<0.01)；給藥后，與模型組相比，各給藥組的GRP78、JNK mRNA轉錄均降低(P<0.05)；與西藥組比較，HJJF組降低效果更顯著(P<0.05)；HJJF隨劑量增加療效更好，但HJJF高低劑量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3、圖1。

表3 各組大鼠主動脈GRP78、JNK mRNA相對轉錄水平比較(2-△△Ct，±s)

與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

圖1 主動脈GRP78、JNK mRNA的擴增曲線和溶解曲線

2.5 活血解毒降糖方對主動脈細胞凋亡的影響 正常細胞核呈藍色，TUNEL陽性染色定位于細胞核內，呈棕黃色，體積等于或小于正常細胞核。原位主動脈細胞凋亡檢測結果顯示，與正常組相比，模型組可見大量的細胞凋亡(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組細胞凋亡指數明顯降低(P<0.05)；與西藥組相比，HJJF高劑量組凋亡指數降低明顯(P<0.05)；HJJF隨增加劑量效果更明顯，但HJJF高低劑量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 各組主動脈細胞凋亡切片圖(×200)

表4 各組大鼠主動脈細胞凋亡指數的比較(±s)

與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

3 討 論

內質網是蛋白質和類固醇合成的細胞器，當內質網穩態失衡導致蛋白質折疊錯誤及脂質合成紊亂而堆積時，將引發細胞內一系列的應激反應，稱為ERS[5]。糖調節蛋白-78(glucose-regulated protein 78，GRP78)是內質網穩態的感受分子，當內質網處于穩態時分別與暴露于內質網腔中活化轉錄因子-6(ATF6)、蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)和肌醇需求酶1(IRE-l)的結構域結合；在持續而嚴重的內質網應激發生時，由于GRP78與未折疊的蛋白質具有更高的親和力，GRP78將與PERK、ATF6、IRE-1解離，解離后的PERK、ATF6和IRE則激活下游的CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(Caspase12)、c-JUN氨酸末端激酶(JNK)3個凋亡信號通路，導致細胞凋亡[6]。在JNK途徑中，IRE-1被激活后，通過其胞漿內結合域與腫瘤壞死因子受體相關因子 2(tumor necrosis fector receptor associated factor 2，TRAF2)相結合，形成IRE-1-TRAF2復合物，轉而激活下游的凋亡信號調控激酶-1( apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)，并與ASK1共同形成IRE-1-TRAF2-ASK1復合物，使JNK磷酸化而被激活，活化的JNK則抑制Bcl-2的抗凋亡活性，增強BIM的促凋亡功能，還參與Caspase-12的調節，磷酸化修飾CHOP，通過調節CHOP活性，增加彼此的促凋亡效果[6-7]。活化的JNK，還可活化轉錄活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)，增加促炎因子基因的表達，IRE1α-TRAF2復合物還可使IκB磷酸化并降解，釋放核轉錄因子-κB(NF-κB)入核，激活炎癥因子基因的轉錄[8-9]，導致促炎因子(TNF-α、IL-6等)的增加，增進粥樣斑塊的易損性[10]。對經皮腔內斑塊旋切術所取得的樣本中發現了內質網分子伴侶的大量表達，并且發現在不穩定斑塊內ERS凋亡途徑被激活[11]。糖尿病導致體內糖代謝正常途徑受損，多元醇途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑、晚期糖基化終末產物(AGEs)途徑和己糖胺途徑等4條旁路代謝通路過度激活，增強了還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性，在細胞內產生過量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)[12]。ROS的蓄積影響內質網的穩態，使得蛋白質的空間結構折疊受阻致使未折疊蛋白蓄積誘發ERS[8]。另外，由于胰島素抵抗的作用使脂蛋白脂酶的作用受損，極低密度脂蛋白(VLDL)的清除率下降，高胰島素血癥又促進肝臟合成VLDL，呈現TG和LDL-C增高，而HDL-C降低，脂質代謝紊亂。增強的氧化應激，使LDL-C氧化為氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，不能被LDL-C受體識別進行正常的降解，且與巨噬細胞清道夫受體有高度的親和力，這一過程無負反饋機制，導致巨噬細胞中膽固醇酯大量聚積[13]，引發ERS，ERS又可加劇炎癥反應，形成惡性循環。因此，內質網應激偶聯炎癥反應在糖尿病動脈粥樣硬化發生發展中起著重要的作用，研究發現胰島素抵抗可以使巨噬細胞對內質網應激介導的凋亡更加敏感，引起炎癥反應、巨噬細胞和平滑肌細胞凋亡等，促進動脈粥樣硬化的發生與發展[14-15]。抗氧化酶系統是機體抗氧化損傷的重要屏障，該系統主要包括GSH-Px、SOD等。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，它能催化還原型谷胱甘肽(GSH)變為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進H2O2的分解，為生物體中清除過氧化氫和其他有機過氧化物的脫毒酶。SOD是體內超氧陰離子的天然抗氧化酶，在對抗氧化損傷方面具有重要作用，GSH-Px和SOD二者的協同作用，均對抗糖尿病生成過多的ROS。

根據中醫學理論，氣陰兩虛、燥熱內蘊是糖尿病AS的基本病機，氣虛致瘀，陰虛加劇內熱，熱瘀內蘊可化毒，痰瘀互結日久可成“積”(動脈粥樣硬化斑塊)[16]。同時，因為炎癥反應是AS發生、發展及造成斑塊不穩定引發急性心血管事件的主要原因，炎性反應引起炎癥細胞浸潤及炎性介質的釋放，與熱毒的本性特點相似，提示清熱解毒藥物可通過抗炎起到潛在的穩定斑塊作用。因此，“益氣養陰，活血解毒，軟堅消積”是糖尿病AS的重要治法。活血解毒降糖方由人參、黃芪、麥冬、山茱萸、地黃、大黃、黃連、丹參、山藥、五味子、鱉甲、桃仁、丹皮所組成，其中人參、麥冬、五味子是金元醫家李杲名著《內外傷辨惑論》的滋陰益氣名方生脈散成分；地黃、山茱萸、山藥是明朝醫家張景岳治療真陰不足的左歸丸成分；大黃、鱉甲、桃仁、丹皮是東漢張仲景《金匱要略》解毒軟堅消積鱉甲煎丸的主要成分。再加丹參活血散瘀，黃連清熱燥濕解毒，黃芪益氣扶正解毒。從益氣、滋陰、活血化瘀、清熱解毒、軟堅散結中藥相配伍的方案尋求治療思路，這是治療糖尿病AS的創新。臨床研究發現，活血解毒降糖方能抑制胰島素抵抗，調節抗炎/促炎平衡，抑制糖尿病AS病人腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)，能有效抑制糖尿病AS血運重建及非血運重建病人炎癥反應，發揮多環節、多途徑、多靶點的整體調節作用，提高臨床療效，改善心功能[4，17]。

本研究表明，糖尿病造模成功后GSH-Px受到一定程度的激活，代償增高，但仍不足以抵抗高糖引發的氧化應激反應。給予藥物干預后，均能明顯降低FBG，升高SOD、GSH-Px；均可糾正脂質代謝紊亂(TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C含量升高)；均可降低促炎因子(TNF-α、IL-6)水平，下調內質網凋亡信號分子GRP78、JNK mRNA的轉錄水平和減少主動脈細胞凋亡。且HJJF組治療效果較西藥組療效好，并隨增加HJJF劑量效果更顯著。

活血解毒降糖方的治療作用在于，糾正機體胰島素抵抗，糾正脂質代謝紊亂，提高抗氧化應激能力，減輕炎癥反應，抑制“氧化應激-內質網應激-炎癥反應-細胞凋亡”的偶聯反應，減輕動脈硬化斑塊炎癥反應，從而減輕糖尿病合并動脈粥樣硬化斑塊的形成，體現了中醫藥整體干預、動態調整、多靶點治療的防治特色。