銀杏葉對腦缺血再灌注損傷大鼠神經細胞凋亡、bcl-2和Bax表達的影響

缺血再灌注是大多數缺血性腦血管疾病的主要病理過程，壞死主要以損傷缺血中心區為主，神經細胞凋亡主要以損傷在邊緣區為主，其中邊緣區的神經元死亡直接影響病人腦梗死的體積[1-2]。所以在臨床上要盡量減少邊緣區神經元細胞的凋亡，使腦梗死的范圍減少，使梗死程度降低。目前認為，bcl-2和Bax與神經元細胞的凋亡密切相關[3]。本實驗研究銀杏葉對腦缺血再灌注后損傷神經細胞凋亡、bcl-2和Bax表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 山東綠葉制藥有限公司實驗動物中心提供的合格健康雌性SD大鼠40只，動物合格證號：SCXK(魯)20140009，體質量175～220(210.43±17.02)g，

1.1.2 試劑與儀器 試劑：Dr.Willmar Schwabe GmbH & Co.KG生產的(商品名：金納多，批準文號：H20090296)，銀杏葉提取物片( 金納多)，上海國藥集團化學試劑有限公司生產TTC(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride)，德國默克公司生產的TUNEL 凋亡試劑盒，碧云天生物技術有限公司生產的bcl-2、Bax 抗體、ECL 顯色試劑盒。儀器：日本Sony公司生產的Sony 數碼相機，日本尼康公司生產的50i 熒光顯微鏡， Tanon 4500SF全自動數碼凝膠化學發光圖像分析系統和GIS 1D分析軟件是由上海天能科技有限公司生產的。

1.2 方法

1.2.1 分組與動物建模 將40組大鼠隨機分為假手術組、模型組、低劑量組、高劑量組， 每組10只。取銀杏葉，粉碎，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解，合并提取液并且搖勻，配置為不同濃度，濃度5 g/L為低劑量組，濃度10 g /L為高劑量組，對大鼠的灌胃劑量為1 mL/100 g，1次/日，假手術組和模型組灌胃劑量為0.5%羧甲基纖維素鈉，給藥10 d，30 min后造模。依據Longa等[4]的大鼠大腦中動脈內栓線阻斷法，對大腦進行阻塞，1 h后，再進行灌注，除假手術組的大鼠不進行插線栓塞外，各實驗組其余處理方法一致，造模1 d后，斷頭取腦組織。

1.2.2 檢測方法 ①bcl-2 和Bax 蛋白檢測：每組取3只大鼠，檢測方法采用Western blot方法，用劑量為10 mL/g組織裂解液裂解大鼠的腦組織，進行離心(4 ℃，14 000 r /min)，10 min后， 提取上清液，加入BCA 試劑盒進行蛋白定量，在100 ℃變性10 min，分裝在-80 ℃保存，每孔20 μL，聚丙烯酰胺凝膠電泳(設定參數：恒定電流80 mA)后將聚丙烯酰胺凝膠轉于PVDF膜上，洗滌后，用5% 脫脂奶粉封閉放置于室溫環境1 h，再加入bcl-2和Bax抗體放于4 ℃環境過夜，第2天進行搖洗，再加入bcl-2和Bax抗體，繼續放置于37 ℃環境1 h，再次洗滌后，進行ECL顯影，最后利用圖像分析軟件對光密度條帶值進行測定[5]。②細胞凋亡檢測：4組各取4只大鼠，斷頭處死并解剖取出腦組織，嚴格按照TUNEL 凋亡試劑盒的操作步驟進行操作，用熒光顯微鏡進行觀察，出現明亮綠色信號即為凋亡的細胞，每份標本取5個視野進行計數。③腦梗死體積百分比測定：每組取3只大鼠，在距離額極2 mm處向后取5個腦片，切取時注意等距離，放置于37 ℃避光的環境下進行TTC染色，持續10 min，染色后若是梗死的腦組織呈現白色，樣本放置于10%甲醛固定24 h，照相機攝片后采用Tanon 4500SF全自動數碼凝膠化學發光圖像分析系統和GIS 1D分析軟件計算腦梗死體積百分比[6]。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積百分比、凋亡細胞數比較 假手術組大鼠未發現腦梗死和凋亡細胞，模型組大鼠的腦梗死無論在體積百分比、凋亡細胞數都明顯高于假手術組(P<0.05)；低劑量組、高劑量組梗死體積的百分比和凋亡細胞數明顯少于模型組，且高劑量組大鼠腦梗死體積百分比、凋亡細胞數較低劑量組降低顯著(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注24 h 后腦梗死體積百分比、凋亡細胞數比較(±s)

1)與假手術組比較，P<0.05；2)與模型組比較，P<

0.05；3)與低劑量組比較，P<0.05

2.2 各組大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、Bax及bcl-2/Bax比較 模型組大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、Bax表達遠高于假手術組(P<0.05)，低劑量組的大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、bcl-2/Bax顯著高于模型組的大鼠，而Bax低于模型組的大鼠，高劑量組的大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、bcl-2/Bax表達高于模型組的大鼠，而Bax低于模型組，且高劑量組的大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2/Bax高于低劑量組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦缺血再灌注24 h后bcl-2、Bax及bcl-2/Bax比較(±s)

1)與假手術組比較，P<0.05；2)與模型組比較，P<0.05；3)與低劑量組比較，P<0.05

3 討 論

神經元死亡的主要表現為細胞凋亡，而細胞凋亡是由于腦缺血再灌注后所產生氧自由基、炎癥因子誘發而引起的[7]。實驗研究表明：腦缺血再灌注造模的大鼠神經細胞凋亡數較假手術處理的大鼠顯著增多，且出現明顯的梗死灶，差異具有統計學意義(P<0.05)。目前臨床上關于腦缺血再灌注神經凋亡的發病機制尚未明確，但是在哺乳動物實驗研究中發現，神經凋亡與bcl-2和Bax兩個蛋白的表達相關，前者抑制神經細胞的凋亡，后者促進神經細胞的凋亡[8]。有研究顯示：bcl-2蛋白在惡性腫瘤病人中表達顯著，對臨床上抗腫瘤治療的效果產生影響，而Bax蛋白表達后膜相關蛋白能促進細胞的死亡，作用效果強烈，Bax蛋白表達后使得線粒體的通透性增加，進而釋放Cytc 進入細胞質，Caspase-3被激活后造成細胞的凋亡，并且在細胞內bcl-2和Bax表達的兩種蛋白相互作用形成的二聚體對線粒體的結構和功能具有調節作用，表現為抑制或者促進細胞的凋亡[9-10]。本實驗結果顯示：高劑量組大鼠的bcl-2/Bax值較模型組顯著升高，提示銀杏葉對于bcl-2、Bax表達具有顯著的影響，可抑制神經細胞的凋亡，降低腦損傷，可能是由于銀杏葉含有能夠有效清除自由基，抑制脂質的氧化成分黃酮、銀杏內酯類物質[11]。本實驗顯示：灌喂銀杏葉提取物的大鼠腦梗死體積百分比、神經細胞凋亡數均顯著下降，尤其是高劑量灌喂的大鼠梗死體積百分比、神經細胞凋亡數下降差異具有統計學意義(P<0.05)。在bcl-2、Bax表達方面，銀杏葉灌喂的大鼠bcl-2表達增加，而Bax表達減少，但與劑量無關，高劑量灌喂的大鼠bcl-2/Bax值高于低劑量大鼠，高劑量灌喂銀杏葉對于抑制神經細胞的凋亡作用更為顯著，這與張鴻等[12]、牟芳芳等[13]學者的研究一致。

綜上所述，銀杏葉治療缺血再灌注損傷大鼠能有效抑制神經細胞的凋亡、減少腦梗死體積百分比，高劑量用藥更顯著，可增加腦缺血再灌注24 h后bcl-2的表達，降低Bax表達，對腦缺血再灌注損傷起到保護作用，但是對于bcl-2和Bax表達與劑量無關。