湖北恩施地區土家族人群血清硒、CTRP9 rs9553238基因多態性與冠心病的相關性研究

冠心病(CHD)已成為全球主要致死疾病之一[1]， 大多數與CHD有關的死亡事件發生在年齡65歲以上的人群中，但是由于老年人本身患有無癥狀性心臟病，所以CHD患病率可能被低估[2]。此外，多項大規模的前瞻性臨床[3-5]研究表明，CHD與心房顫動、充血性心力衰竭、中風以及其他嚴重疾病有顯著相關性。 因此，開發有效的療法來緩解這種疾病的進展具有非常重要的意義。硒是許多酶的重要組成部分，近年研究發現硒在預防多種慢性疾病中均具有潛在作用[6]。 目前的飲食指導方針認為硒是提供抗氧化和免疫功能的必需礦物質，適當的飲食攝入硒對于維持人體器官的功能和穩態至關重要。硒缺乏可能會對免疫系統產生負面影響，導致細菌和病毒感染的易感性[7]，并增加致命性心肌病的風險[8-9]。自從Salonen等[10]發現硒與CHD風險之間存在負相關，此后許多研究開始探索硒對CHD的影響。既往的動物研究已經證實硒有利于心肌和克山病的預防[11-12]。一項橫斷面研究表明，硒的補充可用于預防心血管疾病(cardiovascular diseases， CVD)，血清硒水平增高可能與代謝綜合征和空腹血糖升高有關[13]。

C1q TNF相關蛋白(The C1q TNF related protein， CTRP)家族是一種新發現的脂聯素的旁系同源物[14]。該家族有15個成員(CTRP)1～15，其結構和功能各異[15]。其中，CTRP9與脂聯素具有最高的氨基酸同源性，并作為脂肪組織的糖蛋白分泌[16]。目前已經報道了CTRP9對心血管系統具有保護作用。其具有比脂聯素更高的血管活性效力，在急性心肌梗死后重塑具有保護作用，降低炎癥并抑制血管平滑肌細胞增殖[17-19]。 多項證據表明，CTRP9 rs9553238水平與動脈粥樣硬化之間存在關聯。但是，對于血清硒水平與CTRP9 rs9553238基因多態性在CHD發生中的交互作用研究較少。故本研究基于湖北恩施地區土家族人群開展了一項病例對照研究，探討湖北恩施地區土家族人群血清硒水平與CTRP9、rs9553238基因多態性在冠心病發生中的交互作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究入選2014年1月—2016年12月在我院心血管內科中心經冠狀動脈造影就診的恩施地區土家CHD病人125例(CHD組)。診斷標準為美國心臟病學會/美國心臟協會(ACC/AHA)2007診斷指南。排除標準：急性冠脈綜合征、心力衰竭、腦卒中、惡性腫瘤、結締組織病、甲狀腺功能亢進、慢性感染性疾病和重度腎功能不全等病人。最終納入125例CHD病人，其中男80例，女45例；年齡(65.21±8.25)歲。另外納入在我院進行健康體檢的125名健康人作為對照組，男65名，女60名；年齡(63.86±12.32)歲。均告知所有研究對象研究目的、方法以及可能出現的風險等，并簽署知情同意書。本研究獲得我院醫學倫理委員會授權。

1.2 血液標本采集 所有研究對象在進行靜脈取血前均空腹8 h以上，每人采集5 mL靜脈血2支，一支用于檢測血清硒的水平，一支用于檢測CTRP9 rs9553238基因多態性。

1.3 檢測方法 將采集好的靜脈血室溫凝固30 min，離心3 000 r/min，持續15 min，留取上清液，用氫化物發生原子熒光光譜法(GHAFS)測定血清硒的水平。另外一直靜脈血于 EDTA 抗凝管中，采用酚-氯仿抽提法提取外周血基因組。隨后采用PCR-RFLP基因分型。

引物設計：上游引物為 5′-TGAGCTGGGAGGTTGAGACT-3′， 下 游 引 物 為 5′-GGTGTTCTTTGAGTCAGGGTCT-3′ 。PCR反應體系為 20 μL，反應程序為： 95 ℃ 預變性 2 min，94 ℃ 變性 30 s，53 ℃ 退火 1 min30 s，65 ℃ 延伸 30 s， 共進行 35 次循環， 最后 65 ℃ 延伸 10 min。

1.4 統計學處理 采用統計學軟件SPSS 16.0進行統計學分析。計量資料指標進行正態性檢驗，兩組間比較采用t檢驗或者方差分析進行組間分析。 CTRP9 基因多態性基因型和等位基因頻率采用頻率計數法計算，分析兩組基因型頻率分布是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律。基因型和等位基因分布頻率差異采用 Logistic 回歸模型， 校正混雜因素后計算風險比(OR值) 及其 95%置信區間(CI)。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CHD組與對照組基線資料比較 CHD組與對照組相比，年齡、性別構成差異無統計學意義，對血壓、糖尿病、血脂等分析詳見表1。

表1 CHD組與對照組基線資料比較

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.2 CTRP9 rs9553238 基因多態性與CHD易感性的關系 在對關聯性進行分析之前，首先分析CHD組和對照組基因型頻率分布是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律。經計算無統計學意義P=0.16，故本研究納入對象的基因型頻率分布符合人群分布。 本研究分析了5種基因模型(TT、CT、CC、T allele和C allele)。通過比較對照組和CHD組，發現 CTRP9 rs9553238 SNP基因型在兩者間分布差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 CTRP9 rs9553238 基因多態性與CHD易感性的聯系 例

2.3 血清硒水平與CHD關系分析

2.3.1 兩組血清硒水平比較 CHD組硒水平為(0.081±0.017)mg/L，與對照組的(0.112±0.024)mg/L比較，CHD組血清硒明顯低于對照組，差異有統計學意義(t=-1.95，P=0.02)。

2.3.2 血清硒水平與CHD的關系 將血清硒按正常含量參考值(0.079±0.030)mg/L的上限 0.109 mg/L 為界值，將血清硒含量轉化為計數資料，分析血清硒水平與CHD的關系。血清硒降低組(<0.109 mg/L)患CHD的危險性顯著高于血清硒升高組(≥0.109 mg/L)，差異有統計學意義[OR=3.17，95%CI(2.13，5.24)，P=0.01]。

2.3.3 血清硒水平與CTRP9 rs9553238基因多態在CHD發生中的交互作用 以血清硒 <0.109 mg /L 和攜帶CTRP9 rs9553238基因型CC視為暴露 ，與血清硒≥0.109 mg/L且擁有CTRP9 rs9553238 CT基因型相比，僅暴露于攜帶CTRP9 rs9553238 CC基因型者CHD發生的危險性增加 1.71倍，僅暴露于血清硒<0.109 mg/L 者CHD發生的危險性增加 4.37倍， 同時暴露于血清硒<0.109 mg/L和攜帶 CTRP9 rs9553238 CC基因型者CHD發生的危險性增加7.36倍， 差異有統計學意義。詳見表3。

若合并CTRP9 rs9553238基因型CT和TT， 以血清硒≥0.109 mg /L 且擁有 CT或TT的OR為1.08(95%CI0.51～4.73) ，僅暴露于攜帶 CTRP9 rs9553238 CC基因型者OR為2.14[95 %CI(0.71，8.04)] ， 僅暴露于血清硒<0.109 mg/L者 OR為5.42(95%CI1.41，7.44)，同時暴露于血清硒<0.109 mg/L和攜帶CTRP9 rs9553238 CC基因型者， OR為10.07[95%CI(1.93，12.52)]，有統計學意義(P<0.05)。根據相加模型均提示血清硒與 CTRP9 rs9553238 基因多態間存在相加模型正交互作用。

表3 血清硒水平與 CTRP9 rs9553238 基因多態在CHD易感性關系 例

3 討 論

CTRP家族成員與心臟代謝異常之間的關聯已被先前的研究所記載[20-21]。但是本研究基于CTRP9 rs9553238 基因多態性3種基因型分布(TT、CT以及CC)與CHD易感性之間沒有顯著相關性，這與梁麗麗等[22]的研究結果一致。本研究中主體的地域民族具有鮮明特色，故這是本研究的創新點之一。

一項納入了16項研究的薈萃分析[23]補硒對CHD的影響進行分析，結果發現補充硒降低了血清C反應蛋白(CRP)和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)水平。CRP是一種主要的炎癥生物標志物，一直被認為是CHD的重要危險因素[24]，因為CRP水平直接與冠狀動脈、大腦和外周動脈硬化的存在和嚴重程度相關[25]。既往許多流行病學研究描述了CRP水平升高與CHD風險增加的關聯[26]。

本研究將血清硒的水平與CTRP9 rs9553238 基因多態性進行分析后發現，血清硒與 CTRP9 rs9553238 基因多態間存在相加模型正交互作用。提示血清硒水平低與攜帶基因型 CTRP9 rs9553238 CC 在CHD的發生中可能存在協同作用，但具體機制有待進一步研究。