miR-221在病毒性心肌炎患兒外周血中的表達及其臨床意義

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一類心肌病毒感染所導致的常見心血管疾病，常見的可導致心肌感染的病毒主要有腺病毒(adenovirus，ADV)和柯薩奇B組病毒(coxsackievims B，CVB)[1-2]。近年來，急性VMC發病率逐年上升，VMC也是兒科的常見疾病，已成為青少年猝死的主要原因之一，此外還可導致擴張型心臟病的發生，導致心臟結構與功能出現異常，嚴重威脅著兒童的生命健康[3]。迄今為止尚無有效的VMC治療方法，其具體的發病機制尚不十分清楚，通常僅進行對癥治療，因此探究闡明VMC的發病機制具有重要的臨床意義[4]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內源性非編碼RNA，可以通過與靶RNA的非編碼區結合而直接抑制蛋白翻譯或降解靶RNA[5]。研究發現，miRNAs在病毒感染性疾病的進程中起著重要作用，miRNAs可以調控宿主與病原體雙方的基因表達調控[6]。此外，miRNAs在小鼠心血管疾病模型以及臨床病人的心臟中均有特異性表達，提示其表達可能與先天性心臟病的發生有關[7]。miR-221在多種腫瘤中高表達而發揮癌基因的作用，是miR-221/222家族的成員，也有研究發現miR-221在心力衰竭病人血清中高表達，且miR-221的循環表達量在心肌梗死組織中異常高，提示它可作為心肌梗死早期診斷的標志物之一[8-10]。因此，本研究對我院收治的67例VMC患兒進行研究，旨在探究miR-221在VMC患兒外周血中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準：患兒符合2000年由中華醫學會兒科學分會心血管學組制定的VMC臨床診斷標準[11]；年齡4～12歲；無精神疾病，可以配合研究進行；研究對象與家屬均了解本研究內容，自愿簽署知情同意書。排除標準：患兒無心肌病、先天性心臟病等其他心臟疾病；近期無感染史；近期無腹瀉史。根據納入標準和排除標準收集2015年7月—2017年12月我院收治的VMC患兒67例，均符合2000年中華醫學會兒科學分會心血管學組制定的VMC臨床診斷標準[11]，根據超聲心動圖左心室射血分數(left ventricular ejection fractions，LVEF)及血清肌鈣蛋白I(cTnI)結果，將心肌炎患兒分為輕型VMC組(37例)與重型VMC組(30例)兩組，其中輕型VMC組LVEF>50%，cTnI<0.1 μg/L或正常；重型VMC組LVEF<50%，cTnI>0.2 μg/L或超出正常值。其中輕型VMC組男21例，女16例；年齡4～12(8.25±3.67)歲。重型VMC組患兒男19例，女11例，年齡4～11(8.61±4.11)歲。收集同期于我院體檢的健康兒童30名作為健康對照組，男17例，女13例，年齡4～12(8.47±3.20)歲。3組間臨床資料(性別、年齡)經比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法 所有患兒均需進行對癥治療、營養心肌、保護重要臟器、抗病毒等綜合治療方案，重型VMC組患兒需同時給予靜脈輸注大劑量丙種球蛋白(IVIG)，總量2 g/kg，分2～5 d進行，以及連用3 d的甲基強松龍(MP)，劑量為15 mg/kg。

1.3 研究方法

1.3.1 血液樣本的采集 分別于患兒急性期和恢復期抽取靜脈血，而健康對照組則進行一次性抽取靜脈血，收集靜脈血3 mL置于EDTA防凝管內，于4 ℃采用離心機離心，3 000 r/min離心10 min，留取上清液(血清)分為3管，用于進一步檢測。

1.3.2 Real-time PCR檢測血清中miRNA-221表達水平 ①總RNA提取：取800 μL 血清樣本，采用RNA抽提試劑盒進行血清總RNA的提取，試劑盒購自美國Ambion公司，完全按照試劑盒說明書操作，最后溶于RNase-Free的水中，采用紫外分光光度計測定每個樣本的總RNA的濃度和吸光度比值，當A260/A280在1.8～2.0為符合實驗要求的RNA。②逆轉錄反應：將提取的2 μg總RNA進行逆轉錄反應，逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，按照說明書操作進行逆轉錄反應合成cDNA，反應體系20 μL：包括Random primer 0.5 μL Random primer 0.5 μL、oligo(dT)0.5 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、5×buffer 4 μL M-MLV 0.5 μL、total RNA 1 μg，剩余用H2O(RNase free)補齊，反應條件：16 ℃ 30 min合成雜合雙鏈，42 ℃ 30 min水解RNA鏈，85 ℃ 5 min合成DNA雙鏈。③Real-time PCR：采用ABI 7500定量PCR儀(購自美國ABI公司)進行Real-time PCR，試劑盒為購自上海吉瑪公司的Hairpin-it miRNAs熒光定量PCR試劑盒，反應體系：cDNA產物 2 μL、miR-221正、反向引物(5 μmoL)各1 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL、dNTP(2.5 mmoL)1 μL、2×Real-time PCR緩沖液10 μL，用H2O(RNase free)補齊至20 μL。miR-221的上下游引物分別為5′-CCG CAG CTA CAT CTG GCT ACT G-3′ 和5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′[12]。反應條件：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 1 min退火，共40個循環。經3次重復試驗后，采用2-△△Ct法計算miR-221的相對表達量。

1.3.3 cTnI與肌酸激同工酶(CK-MB)的檢測 ①cTnI的檢測：采用電化學發光法進行檢測，儀器為Roche-2010分析儀，檢測儀器與試劑盒均購自羅氏公司，檢測步驟完全按照說明書進行，正常參考值為：0～0.09 μg/L。②CK-MB的檢測：采用ELISA法進行檢測，儀器為AU5800全自動生化分析儀，檢測儀器購自美國貝克曼庫爾特公司，試劑盒購自美國R&D公司，檢測完全按照說明書進行，正常參考值為：0～24 U/L。

2 結 果

2.1 VMC患兒外周血miR-221、cTnI、CK-MB的表達變化 在VMC患兒急性期與恢復期時外周血中的miR-221水平明顯高于健康對照組(P<0.05)，且重型VMC組患兒急性期與恢復期時外周血中的miR-221水平明顯高于輕型VMC組患兒(P<0.05)。在重型VMC患兒急性期與恢復期時外周血中的cTnI水平明顯高于輕型VMC組患兒和健康對照組(P<0.05)，而輕型VMC組患兒急性期與恢復期時外周血中的cTnI水平與健康對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。在重型VMC患兒急性期與恢復期時外周血中的CK-MB水平明顯高于輕型VMC組患兒和健康對照組(P<0.05)，而輕型VMC組患兒急性期時外周血中的CK-MB水平明顯高于健康對照組(P<0.05)，恢復期時外周血中的CK-MB水平與健康對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 VMC患兒外周血miR-221、cTnI、CK-MB的表達變化(±s)

注：t1值、P1為重型VMC組與輕型VMC組的急性期相比；t1值、P2為重型VMC組與輕型VMC組的恢復期相比。與健康對照組相比，1)P<0.01

2.2 VMC患兒外周血miR-221表達量與cTnI、CK-MB含量的相關性 對VMC患兒外周血miR-221表達量與cTnI、CK-MB含量進行Spearman相關性分析。結果顯示，VMC患兒外周血miR-221表達量與cTnI和CK-MB均具有顯著的負相關性，r2分別為-0.794、-0.871(P<0.05)，而健康對照組則無明顯相關性，r2分別為0.022，0.027。

3 討 論

VMC患兒通常都存在病毒感染病史，臨床表現往往是由于其心肌炎癥的部位及嚴重程度決定，其中絕大多數的輕型患兒無明顯臨床癥狀，而重型VMC則可表現為心力衰竭、擴張型心肌病，甚至猝死等等[3]。小兒VMC是小兒時期常見的心臟感染性疾病，當病毒感染小兒心肌后會對心肌造成直接性損傷，或通過激發自身免疫反應而引起心肌細胞的間質炎細胞纖維滲出和浸潤、心肌細胞壞死和變性等，也可引起心包、心內膜和其他臟器的炎性病變[12]。患兒的臨床表現具有多變性、易變性和多樣性等特點，臨床表現輕重不一[1]。目前，雖然引起VMC的病原體已非常明確，但造成心肌損傷的具體機制仍不明確。

miRNA自1993年被發現以來，已逐漸被證實參與到各種病理生理過程中，成為研究的熱點[5]。近年來，有研究報道顯示miRNA也參與到了VMC的進程中，并存在密切關系[6]。研究發現，在CVB3誘導的VMC小鼠心肌組織中進行miRNA微陣列技術檢測，篩選出miR-126-5p、miR-199a、miR-29a、miR-146a和miR-210等22個miRNAs的表達下調，而miR-320、miR-21、miR-23a等5個miRNAs的表達上調[13]。也有研究報道，miR-148a與miR-155在急性VMC病人的心臟室間隔組織中表達明顯增高，miR499與miR-208b的水平也出現了明顯升高，并且與心肌損傷存在正相關[14-15]。這些結果均提示，miRNA在VMC的進程中發揮著重要的作用。miR-221作為一種癌基因在多種腫瘤組織中呈高表達，如甲狀腺癌、乳腺癌、結直腸癌等，它位于X染色體的p11.3區，與miR-222組成一個集群[8]。研究報道，miRNA-221/222在CVB3感染的VMC病人和C3H小鼠感染后7 d，于心臟組織中出現高表達，而抑制miRNA-221/222可增加循環中的白細胞數量、病毒負荷，使心肌壞死程度加重[16]。而也有研究報道，miR-221在心力衰竭心肌組織中呈高表達，并在心肌梗死組織中出現循環miR-221的高表達，提示循環miR-221是診斷早期心肌梗死的標志物[9-10]。

為進一步探究VMC患兒外周血中miR-221的表達意義，本研究對我院收治的67例VMC患兒進行研究，結果顯示，VMC患兒急性期與恢復期時外周血中的miR-221水平明顯高于健康對照組(P<0.05)，且重型VMC組患兒明顯高于輕型VMC組患兒(P<0.05)；在重型VMC患兒急性期與恢復期時外周血中的cTnI水平明顯高于輕型VMC組患兒和健康對照組(P<0.05)，而輕型VMC組患兒與健康對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；在重型VMC患兒急性期與恢復期時外周血中的CK-MB水平明顯高于輕型VMC組患兒和健康對照組(P<0.05)，而輕型VMC組患兒急性期時明顯高于健康對照組(P<0.05)，恢復期時與健康對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。對VMC患兒外周血miR-221表達量與cTnI、CK-MB含量進行Spearman相關性分析，VMC患兒外周血miR-221表達量與cTnI和CK-MB均具有顯著的負相關，r2分別為-0.794、-0.871(P<0.01)，而健康對照組則無明顯相關性，r2分別為0.022、0.027。

綜上所述，VMC患兒外周血中的miR-221表達水平增高，且與患兒的心肌損傷程度有關，提示其在VMC患兒的疾病進程中發揮著重要作用。