生物樣本庫建設過程中生物安全和生物危害指導文件——了解生物安全等級，滿足生物樣本庫安全要求

劉妍，張小燕，林愛芬 編譯，胡迅 審校

·新型冠狀病毒專欄·

生物樣本庫建設過程中生物安全和生物危害指導文件——了解生物安全等級，滿足生物樣本庫安全要求

劉妍，張小燕，林愛芬 編譯，胡迅 審校

100039 北京，解放軍總醫院第五醫學中心臨床研究管理中心（劉妍）；201210 上海，生物芯片上海國家工程研究中心（張小燕）；317000 臺州，浙江省臺州醫院生物資源中心（林愛芬）；610041 成都，四川大學華西醫院生物樣本庫（胡迅）

當生物樣本庫處理不同類型的實驗室樣本時，能及時了解潛在的生物危害，以確保操作員和實驗室人員的安全十分重要。生物安全等級（BSL）是一系列用于通知實驗室人員有關實驗室環境中生物危害風險等級的名稱。根據疾病控制和預防中心（CDC）的規定[微生物和生物醫學實驗室的生物安全，第 5 版，HHS 出版號（CDC）21-1112]，按照風險增加的順序，共有四個級別。本文將重點探討這些等級之間的主要區別，包括簡要介紹對生物危害物質進行分類的危害特征，并定義滿足安全要求的要點。

生物安全； 安全要求； 生物危害； 生物安全等級； 個人防護裝備

1 前言

生物安全等級（biological safety levels，BSL）是一系列安全預防措施，可幫助降低實驗室人員接觸潛在傳染性生物危害物的風險。CDC 定義并付諸四個生物安全等級的實施。每個 BSL 都有具體的控制措施，包括微生物操作、安全設備和設施防護措施，以保護實驗室工作人員、公眾和環境免受實驗室使用的傳染性生物危害物的影響。隨著風險等級的提高，這些遏制措施以金字塔狀的方式建立在前一種安全等級上。BSL 決定了在實驗室環境中允許開展的工作類型，并且在設施的設計中發揮著巨大作用。

1.1 生物危害物質風險評估

風險評估在確定實驗室的 BSL 方面起著重要作。CDC 將風險評估定義為一種合理的針對生物危害物的安全操作過程，即采取適當的措施以防止其造成實驗室相關的感染發生。風險評估主要考慮兩大類：生物物質的風險和實驗室操作流程的風險。同樣，BSL 的主要決定因素取決于實驗室程序以及所使用的生物物質。在風險評估過程中，主要考慮以下參數：①感染性：病原體建立感染的能力或病原體的水平傳播能力；②傳播能力；③進行的工作性質。

具體而言，在對實驗室處理的生物危害物進行風險評估時，要仔細檢查這種物質的主要危險特性。包括：①在易感的人或動物宿主中感染并引起疾病的能力；②通過所致疾病的嚴重程度來衡量毒力；③是否具有有效的預防措施和治療方法；④危險物質的其他特征包括實驗室感染的傳播途徑、感染劑量及其在環境中的穩定性、宿主范圍和流行特性。

綜上因素都有助于相應危險物質的風險評估。世界衛生組織（WHO）已為生物醫學環境中使用的有害物質建立了風險組別分類[1]。這些危險物質主要根據自然疾病的傳播途徑分為不同的層級。值得注意的是，這 4 個風險組別分類不等于在實驗室環境中實施的 BSL。

2 生物安全等級區別

CDC 設定了 4 個 BSL，它們構成了在這些實驗設施中進行生物危害交流和培訓工作的重要組成部分。大多數機構都設有生物安全審查委員會，以確保這些準則能很好地遵守，并且通常能解決實驗室特定的問題。涉及人體樣本的臨床工作通常在 BSL2 指南下進行，盡管通常并不知道這些臨床樣本的傳染性。當處理含血液或血液痕跡的樣本時，BSL2 的合規水平與職業安全與健康管理局（OSHA）（執行安全與健康立法的監督機構）標準非常吻合[2]。嚴格遵守 CDC 給出的準則和建議將有助于溝通以產生更安全的工作空間，并促進實驗室的合規性。本文介紹了標準實驗室中的生物安全等級的區別和分類，但沒有涉及針對脊椎動物生物安全等級標準提供的特定指南。CDC 在微生物學和生物醫學實驗室的生物安全[3]中提供了對生物安全等級、安全性實踐以及動物生物安全性等級監管標準的全面而深入的探討。

2.1 生物安全等級 1

生物安全等級 1（BSL1）是最低的風險等級，主要的工作和程序涉及的是已建立的特征性的微生物菌株，尚未知它們可否持續地在健康成年人中引起疾病。這些微生物通常對環境的威脅也最小。例如：枯草芽孢桿菌、尾刺耐格里原蟲、釀酒酵母和大腸桿菌。在 BSL1 實驗室的研究通常在開放的實驗室工作臺上進行，而無需特殊的防護。CDC 建議遵循以下標準微生物實踐。

2.1.1 BSL1的程序和實踐

1．在工作/處理有潛在危險的材料之后以及離開實驗室之前，必須要洗手。

2．禁止在實驗室區域飲食、吸煙、戴隱形眼鏡、化妝和存放食物。實驗室中使用的冰箱和冰柜必須清楚地標明僅供實驗室使用。

3．禁止用口吸法移液。

4．建議減少尖銳物的使用，例如巴斯德玻璃移液器、針頭和手術刀，包括實施工程控制措施和正確使用尖頭針頭（用過的針頭不要套回針帽，須棄于防刺穿的容器中等）。

5．盡可能減少飛濺物和氣溶膠的產生。

6．接觸微生物/其他 BSL1 指定試劑后要對工作臺表面進行消毒處理。

2.1.2 BSL1 的安全設備

BSL1 實驗室不需要像生物安全柜這種特殊設備。以下是在 BSL1 使用的主要屏障和個人防護設備：

1．建議使用一般的實驗室外套。

2．進行可能會產生氣溶膠和危險物質飛濺的程序時，需要使用防護眼鏡。

3．處理危險或潛在危險的材料時，應戴手套以防止手暴露。如果手套被污染或刺穿，則應及時更換。手套不能重復使用，并且在實驗室人員對乳膠過敏的情況下，應提供乳膠手套的替代品。離開實驗室之前，要求必須洗手。

2.1.3 BSL1 的實驗室設施

1．洗手池。

2．可以將工作區與其余設施分隔開的門，并有門禁控制出入。

3．實驗臺應防水且耐熱、耐有機溶劑和酸堿。

4．實驗室工作用椅應使用無孔防滲且易于消毒及除污的材質。

2.2 生物安全等級 2

生物安全等級 2（BSL2）建立在 BSL1 的安全預防措施和工作程序的基礎上。BSL2 類的生物有害物質會對環境造成中等危害，如果實驗室人員因不慎皮膚接觸、吸入或食入也會導致中等危害。BSL2 有害物質包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和人類細胞系等。BSL2 實驗室與 BSL1 實驗室的區別在于，增加了專門針對處理 BSL2 病原體的特定培訓。這些實驗室對進入工作區有限制，BSL2 有害物質的處理、使用和操作都在工作區里進行。最后，所有可能產生傳染性或可能產生傳染性氣溶膠/飛濺物的操作均要在生物安全柜（BSC）中進行。

2.2.1 BSL2的程序和實踐

1．在使用 BSL2 危險物質時，應有嚴格的實驗室門禁。

2．進入實驗室的每個人都應該看到有關潛在危險的警告標志。

3．應對實驗室人員進行操作 BSL2 危險物質的相關培訓。

4．應為實驗室人員提供所操作感染物相關的免疫接種。

5．必須準備一份易于操作、實施的實驗室專用生物安全手冊。

6．在采集、處理、加工、存儲和轉運的整個過程中，應將傳染性和潛在傳染性材料放入耐用的防漏容器中。

7．有危險物溢出或飛濺后，應定時對實驗室設備進行消毒。

8．當涉及感染性物質的泄漏時，應由經過專業培訓的人員來控制和消毒。

9．任何情況下，暴露于感染源的設備在移出實驗室之前都要進行清潔和消毒。

10．有關 BSL2 感染物處理和操作的程序都應在生物安全柜或其他物理防護裝置中進行。

11．與實驗室工作無關的動植物嚴禁進入實驗室。

2.2.2 BSL2 的安全設備

BSL2 實驗室含有用于 BSL1 實驗室的所有安全設備和預防措施。這包括所有工程控制、安全設備和任何特殊的實驗室設施。以下是 BSL2 實驗室中使用的主要屏障和個人防護設備列表。

1．對于可能產生傳染性氣溶膠的操作，包括對裝有傳染性材料的開放容器進行移液、離心、研磨、混合、搖動、超聲處理或常規處理，必須使用特殊的防護設備，如生物安全柜。

2．在使用危險材料時，必須始終穿戴實驗室防護服和工作服，并且在離開實驗室之前必須脫掉防護服。

3．應使用眼睛和面部防護設備（即護目鏡、面罩、口罩）來防止任何可能的飛濺、噴霧和其他可能的危險暴露。

2.2.3 BSL2的實驗室設施

1．實驗室門應可自動關閉并設有門禁，僅授權的工作人員可出入。

2．實驗室的設計應便于清潔和消毒。

3．地面應防滑，不得鋪設地毯等。

4．不建議窗戶向外開啟。但如果存在，則應安裝紗網并密封。

5．應將生物安全柜安裝在適當的位置，以免干擾房間的空氣供應和排氣，并與實驗室的門和人員密集處保持足夠的距離。

6．生物安全柜應該每年進行認證。來自 II 級 BSC 的高效微粒空氣過濾器（HEPA）排出的空氣可以安全地再循環回到實驗室。

7．洗眼站應隨時可用。

8．高壓滅菌設施或其他實驗室廢物凈化的裝置（如焚燒爐）應備好且便于使用。

9．真空管路應上底漆，并用液體消毒劑保護。

2.3 生物安全等級 3

生物安全等級 3（BSL3）建立在 BSL1 和 BSL2 的安全預防措施和程序的基礎上。包括所有工程控制、安全設備和任何特殊的實驗室設施。BSL3 類的生物危害物質是本土的或外來的，可通過呼吸道傳播導致嚴重或致命的疾病。例如結核分枝桿菌、SARS 冠狀病毒、鸚鵡熱衣原體等。BSL3 實驗室與 BSL2 實驗室的區別在于危險物質的傳播性質。BSL3 實驗室還要求增加負壓定向氣流的預防措施，以確保空氣從非實驗室區域流入實驗室區域。

2.3.1 BSL3 程序和實踐

1．實驗室人員必須接受有關 BSL3 危險物質（具有潛在的致命性）處理和操作的專門培訓。

2．所有涉及此類危險物質的處理操作步驟都必須在生物安全柜或其他物理密閉設備中進行。

3．需要送出實驗室外消毒的危險物質，應在防漏、安全和耐用的容器中轉運。

4．必須在實驗室入口的門上清楚地標識通用的生物危害標志。

5．在接觸傳染性物質后必須立即評估，流程必須遵循實驗室生物安全手冊。必須將所有突發事件報告給實驗室主管，并保留實驗室記錄。

2.3.2 BSL3 安全設備

1．在 BSL3 實驗室中進行的所有涉及感染性物質的操作，都必須使用 II/III 級生物安全柜。

2．人員防護設備（PPE）包括防護服，配以有系帶的實驗室工作服或包裹罩衫或連體工作服。BSL3 實驗室中穿戴的 PPE 任何時候都不得在實驗室外穿戴。某些 BSL3 PPE 可以重復使用，但在送洗之前必須進行消毒。

3．在裝有感染性動物的房間中，必須使用護目鏡、面罩和呼吸防護裝置。

2.3.3 BSL3 的實驗室設施

1．進出實驗室僅限于經過授權和培訓的人員。

2．BSL3 實驗室必須通過兩個獨立的自動關閉和鎖門系統進入。建議在兩個自動關閉門之間的通道中放置一個緩沖前廳，在該處可以換衣服并適當整理個人防護裝備。

3．實驗室設計時必須考慮最少水平占地，便于清潔和消毒。

4．地板、墻壁、天花板、門、通風口和表面的所有縫隙均應密封。

5．天花板和墻壁的表面應光潔，所有表面均應易于清潔和消毒。

6．地板必須防滑、防水并且耐化學腐蝕。應考慮安裝無縫、密封、具有彈性的地板。

7．若對實驗室空間進行翻新、維護、關閉或任何其他重大改變，必須對整個實驗室進行消毒。

8．除疏水閥中的液體消毒劑外，所有真空管路還必須使用 HEPA 過濾器進行保護。

9．BSL3 實驗室必須具有管道通風系統，該系統通過將空氣從清潔區域抽入實驗室并將其移向可能受到污染的區域，從而提供持續的定向氣流。該空間的設計應確保在出現故障的情況下氣流不會反向。需要記住有關通風系統的一些提示：

（a）實驗室人員應能夠輕松識別氣流方向。

（b）應在實驗室入口處放置一個指示氣流方向的可見監控裝置。最好使用聲音警報來通知氣流中斷。

（c）實驗室排氣不應再循環至建筑物的任何其他區域。

10．HEPA 過濾器外罩應具有氣密性隔離風門，消毒端口和（或）袋裝入/袋裝出功能（具有適當的消毒程序）。應對每個過濾器和外罩進行泄漏測試，且有年度檢測和認證。

11．只有經過每年重新認證和測試并遵從廠商建議而使用的 HEPA 才合格，來自 II 級 BSC 的 HEPA 過濾后的廢氣才能安全地再循環到實驗室環境中。BSC 可以通過硬連接直接排到室外，也可以連接到實驗室的排風系統。

12．III 類 BSC 必須硬連接到機柜的第二個排氣 HEPA 過濾器。

13．必須保持 BSC 的供氣，以保持安全柜的負壓。

14．含有 HEPA 過濾功能的密閉裝置（即 BSC）將用作可能產生傳染性氣溶膠的設備的主要屏障裝置。HEPA 過濾器必須每年進行測試和更換。

15．根據 BSL3 實驗室的風險評估，可能需要實驗室增強功能。包括：用于清潔存儲設備、物資用品和衣著入出、淋浴功能的前廳；用于實驗室隔離的氣密風門；除已在安全外罩設備上安裝的 HEPA 過濾器外，還需對實驗室廢氣進行 HEPA 終端過濾；實驗室廢水消毒；高級訪問控制設備（即生物認證）。

16．設施設計、操作程序和參數必須在 BSL3 實驗室全面運行之前記錄在案。每年須對整個設施進行重新評估和記錄。

2.4 生物安全等級 4

生物安全等級 4（BSL4）是非常罕見的生物安全最高級別實驗室，通常是獨立的設施，與其他設施在物理上是非連接的，且充分隔離。BSL4 是建立在 BSL1、2 和 3 實驗室的安全預防措施和程序的基礎上，包括所有工程控制、安全設備和特殊的實驗室設施。BSL4 類生物危害物質具有危險性和奇特性，在實驗室中通過氣溶膠/呼吸道傳播構成高風險，可能導致威脅生命的疾病，且通常沒有疫苗和治療方法。BSL4 處理的是某些傳播途徑仍不清楚的有害微生物，包括埃博拉病毒、馬爾堡病毒和拉沙病毒以及克里米亞-剛果出血熱等。

BSL4 實驗室與 BSL3 實驗室的不同之處在于，實驗室人員和工作人員在處理極危險的傳染源時需要進行專門的培訓。包括一級和二級安全措施，以及涉及處理、操作和存儲這些極危險物質的所有標準和特殊做法。BSL4 實驗室分為柜式實驗室和防護服實驗室兩種類型，兩者之間的差異以及針對 BSL4 的附加保護措施將在下面詳細討論。

2.4.1 BSL4 程序和實踐

1．只有出于科學研究或受到其他必要支持為目的的人員才有權進入 BSL4 實驗室。

2．所有進入 BSL4 實驗室的細節都必須正確記錄，包括日期、時間和所有進出實驗室人員的姓名。

3．實驗室人員在進入 BSL4 實驗室之前必須更衣。

4．實驗室人員在離開 BSL4 實驗室之前必須淋浴。

5．除非有緊急情況，否則實驗室的人員出入必須通過專門的更衣室。

6．用過的實驗服必須作為污染材料處理，并且不得通過個人淋浴設備從內部更衣室移走。在送洗之前，應對它們進行徹底消毒。

7．所有從 BSL4 實驗室運出的材料都必須徹底消毒。

8．實驗室主管對實驗室人員的監督至關重要，其中包括要確保實驗室人員做到：

（a）接受有關 BSL4 設施的特定操作和各個 BSL4 設施相關操作步驟的相關培訓。

（b）在 BSL4 密閉空間處理致病微生物時，能熟練掌握標準和特殊操作。

（c）接受必要的年度更新培訓，并在流程或制度有任何變化時要確保接受額外的培訓。

9．從實驗室中取出的生物材料必須在不易破損的密封主容器（一層包裝）中轉移，然后再密封在不易破損的密封二級容器中（二層包裝）。這些材料必須通過消毒罐（三級包裝）、熏蒸室或消毒淋浴器消毒后轉移。從實驗室中取出的包裝材料必須保持活力和完好無損，并且除非經過確認的方法滅活，否則不得在 BSL4 密閉容器之外打開。

10．未通過更衣室帶入 BSL4 實驗室的耗材、設備和材料，必須通過先前已消毒的雙門高壓滅菌器、熏蒸室或氣閘帶入。鎖緊外門確保安全后，實驗室內的人員可以通過打開高壓滅菌器、熏蒸室或氣閘的內門來取回材料。熏蒸室或高壓滅菌器的門必須以防止外門打開的方式鎖定，除非高壓滅菌器或熏蒸室已完成凈化循環。

11．BSL4 實驗室內應僅存放必要的設備和耗材。

12．必須制定緊急程序和規程，包括醫療急救、設施故障、逃走的動物和其他緊急情況。必須向所有實驗室人員提供緊急操作流程培訓。

2.4.2 BSL4 安全設備

柜式實驗室：實驗室中涉及感染材料的所有工作必須在 III 級 BSC 中進行。III 級 BSC 特殊流程包括：

（a）從 III 級 BSC 中排出的污染物質必須要通過雙門高壓滅菌器。高壓滅菌器門必須聯鎖（類似孔明鎖），以便在任何指定時間只能打開一個門，并對其進行自動控制，以便在徹底完成消毒循環后方可打開外部高壓滅菌器門。

（b）III 級 BSC 必須通過消毒罐、熏蒸室或等效的方法進行消毒，以便將不能被高壓滅菌器消毒的材料和設備安全地從柜中移出。污染物質的外包裝物必須全程保持不受損。

（c）必須將 HEPA 過濾器放置在進氣口上，并將兩個 HEPA 過濾器串聯在設備的排氣口上。機柜的供氣和排氣管道上必須有氣密阻尼器，以允許對設備進行氣體或蒸汽凈化。所有 HEPA 過濾器外殼上都必須設有用于注入測試介質的端口。

（d）BSC 內部必須具有光滑表面，以便于清潔和消毒；必須消除所有鋒利的邊緣，以減少割傷和手套撕裂的風險。BSC 中的所有設備也不應帶鋒利的邊緣。

（e）必須在使用前檢查 III 類機柜手套，如有損壞，應及時更換。機柜在每年重新認證后，應同時更換手套。

（f）個人衣物、首飾或其他物品不得通過淋浴區以外的 BSL4 空間，但眼鏡除外。

（g）機柜手套下方須存放一次性手套，以增加保護。手套嚴禁帶出實驗室外。

防護服實驗室：在 BSL4 防護服實驗室中進行的所有工作必須在一件連體式正壓供氣式防護服中進行。

（a）必須在經過 HEPA 過濾的主要屏障系統（即 BSC）內進行所有傳染性微生物的操作和處理。來自 II 級BSC 的 HEPA 濾過的空氣可以安全地再循環回到實驗室空間。

（b）實驗室人員在進入室內穿戴正壓服之前，必須穿著實驗室防護服，如磨砂服。

（c）必須戴一次性手套，以防防護服手套破損。請勿在更衣區域外佩戴一次性手套。

（d）在實驗室操作期間，要對防護服手套進行消毒處理。

2.4.3 BSL4的實驗室設施

柜式實驗室設施要求：

（a）BSL4 柜式實驗室通常位于單獨的建筑物中或在建筑物的一個隔離限制區。

（b）實驗室必須有專用的供氣和排氣，以及真空管路和指定的消毒系統。

（c）設施中的房間必須順序布置，離開 BSL4 設施之前的實驗員有序地從污染的更衣區到個人淋浴間，最后進入潔凈的更衣室。

（d）設施應具有自動啟動的應急電源，以在緊急情況下調控生命支持系統、警報、實驗室排氣系統、照明、進出控制、BSCs 和其他門密封墊圈。

（e）BSL4 設施要求在密閉罩上裝有雙門高壓滅菌器、熏蒸室、儲罐或通風氣閘，以便于傳遞物品或設備。

（f）機柜室、內部更衣室和外部更衣室的門旁必須有醫用感應式洗手池。裝有 III 級 BSC 的房間中的所有水槽必須連接到廢水凈化系統。

（g）實驗室地板的排水管必須直接連接到廢液消毒系統。

（h）穿透實驗室墻壁、地板或天花板的管道安裝或任何其他施工，必須做到密封以確保實驗室沒有回流。環境通風系統必須有兩個串聯的 HEPA 過濾器，并密封到第二個過濾器。

（i）窗戶必須是防裂碎和密封的。

（j）不建議使用中央抽真空系統，但如果已使用了這樣的系統，則除用于機柜的房間外，不得將其用于其他任何區域。

（k）該設施應具有專用的非循環通風系統，并且此類HVAC 系統只能在 BSL4 相同級別實驗室之間共享。實驗室內必須保持相對周圍環境呈負壓。

（l）必須有多個排氣風扇。建議安裝多個供氣風扇，且供氣風扇和排氣風扇必須聯鎖，以防止實驗室正壓。

（m）應使用具有警報功能的設備監視設施的通風系統，以防系統故障。

（n）所有供給機柜的氣體和由 BSL4 外排的氣體必須經過兩個 HEPA 過濾器。

（o）必須提供熏蒸室、儲罐或等效的消毒方法，以便將不能在高壓滅菌器中消毒的材料和設備安全地從機柜室中移出。

（p）來自機柜室內地漏、水槽和機柜內高壓滅菌室的液體廢物必須經過消毒處理，最好進行加熱處理，然后再排入下水道。淋浴和廁所產生的液體廢物無需處理。

（q）在實驗室外打開的高壓滅菌器必須用耐用、氣密且能夠伸縮的生物材料密封。從高壓滅菌器室排出的氣體也必須進行消毒處理。

（r）必須對機柜 BSL4 設施進行年檢，對運行參數進行測試和驗證。

防護服實驗室設施要求：與柜式實驗室具有相同的要求，還包括以下附加規定：

（a）BSL4 防護服實驗室通常位于單獨的建筑物中或建筑物中的一個隔離區域中。

（b）必須布置排列好設施內的房間，以確保氣流定向通過化學淋浴間、內部更衣室、個人淋浴間以及最后的外部潔凈更衣區域。

（c）必須通過裝有氣密門的氣閘才能進入 BSL4。

（d）在實驗員離開實驗室之前，需要使用化學噴淋對正壓防護服的表面進行消毒。一旦需要緊急出口，或者如果化學淋浴系統發生故障，則需要無壓供給化學消毒劑進行消毒。

[1] World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 3rd ed. Malta: 2004. [2016-01-02]. http://www.who.int/csr/resources/ publications/biosafety/Biosafety7.pdf?ua=1.

[2] United Stated Department of Labor. Bloodborne pathogens. Occupational safety and health standards. (2012-04-03) [2016-01-02]. https://www.osha.gov/pls/oshaweb/owadisp.show_document?p_table=STANDARDS&p_id=10051.

[3] Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 5th ed. (2018-10-24) [2016-01-02]. https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html?CDC_AA_refVal =https%3A%2F%2Fwww.cdc.gov%2Fbiosafety%2Fpublications%2Fbmbl5%2Findex.htm.

胡迅，Email：hxxhu99@163.com

2020-03-11

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.009