氧化應(yīng)激在青光眼發(fā)病中的作用及天然藥物治療新進展

向圣錦，張富文，段俊國

青光眼是一組由病理性眼內(nèi)壓升高或者視神經(jīng)血流灌注壓降低等多種因素引起的視神經(jīng)退行性疾病，是導致不可逆性致盲性眼病的第二大病因[1]。目前全球有超過6000 萬的青光眼視神經(jīng)損害患者，其中有840 萬人因此失明。預計到2020 年，全球的青光眼患者會增加至7600 萬人，并導致1120 萬人失明[2]。越來越多的研究[3]表明，氧化應(yīng)激損傷與青光眼密切相關(guān)，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強、活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增多在青光眼的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。ROS 可以通過損傷小梁網(wǎng)、視乳頭及視網(wǎng)膜而導致眼壓升高、引起組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglial cells，RGCs）凋亡[4]。同時，大量實驗研究[5]已經(jīng)證實，抗氧化應(yīng)激天然藥物對于青光眼視神經(jīng)損傷具有較好的保護作用。現(xiàn)就氧化應(yīng)激在青光眼發(fā)病中的作用及抗氧化損傷天然藥物防治青光眼的研究進展綜述如下。

1 氧化應(yīng)激及其標記物

氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導致氧自由基在細胞內(nèi)蓄積引發(fā)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 等大分子被氧化損傷，從而造成細胞、組織損傷的狀態(tài)[3]。ROS 是造成氧化應(yīng)激的主要原因，生理狀態(tài)下，ROS 的濃度很低，是參與細胞信號轉(zhuǎn)導的重要物質(zhì)，可調(diào)節(jié)機體免疫炎癥因子的產(chǎn)生[4,6]；而抗氧化物則發(fā)揮保護作用，維持促氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)處于相互協(xié)調(diào)的平衡狀態(tài)。當促氧化物大量產(chǎn)生或抗氧化物不足時，則會導致氧化應(yīng)激反應(yīng)出現(xiàn)。過量的ROS 一方面可以攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 等生物大分子，造成細胞死亡或組織結(jié)構(gòu)改變；另一方面可攻擊線粒體，造成線粒體功能紊亂而損傷細胞[6]。

過量的ROS 攻擊生物大分子的氧化產(chǎn)物，可間接反映氧化應(yīng)激的發(fā)生及一段時間內(nèi)的損傷程度[7]。ROS 攻擊蛋白質(zhì)，可氧化氨基酸，改變空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)喪失正常的生理功能，產(chǎn)生晚期蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物。ROS 攻擊脂質(zhì)，可氧化細胞膜表面的脂質(zhì)，造成細胞膜結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的改變，形成正構(gòu)醛、丙二醛（malondialdehyde，MDA）等產(chǎn)物。其中，MDA 是主要的脂質(zhì)過氧化物之一，其含量可反映一段時期內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的變化[8]。ROS 攻擊DNA，可修改嘌呤和嘧啶的堿基，干擾DNA、RNA 復制，影響正常的細胞功能，形成8-羥基脫氧鳥苷酸（8-hydroxy-2’deoxyguanosine，8-OHdG）等氧化產(chǎn)物，是反映DNA 氧化損傷的良好標志物[3]。

為防止促氧化物對機體的損傷，體內(nèi)同樣也存在著完善的抗氧化系統(tǒng)來防御氧化損傷。抗氧化系統(tǒng)由酶類和非酶類抗氧化物兩大組分構(gòu)成，酶類抗氧化物即抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxidase，GPX）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione transferase，GST）等。SOD是調(diào)節(jié)氧自由基的重要抗氧化酶，它可以使毒性最強的O2-自由基歧化為氧和水，清除活性ROS[6]。CAT 可以直接催化H2O2，將其分解成H2O 和O2，保護細胞免受H2O2的毒性作用[3]。GPX 則需以谷胱甘肽（glutathione，GSH）為輔因子，才能催化H2O2分解成H2O 和O2[3]。GST 主要存在于細胞質(zhì)中，它以還原型GSH 為輔因子，清除氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物[6]。非酶類抗氧化物包括有GSH、維生素C、維生素E 等。GSH 是體內(nèi)所有細胞均可合成的一種重要抗氧化劑，可直接清除自由基，同時作為GST 的輔因子，調(diào)節(jié)H2O2、脂質(zhì)過氧化物的新陳代謝，保護細胞免受ROS 的損傷。GSH 還可輔助維生素C 和維生素E 維持還原態(tài)，確保細胞的抗氧化能力[4]。

2 氧化應(yīng)激與青光眼

眼部ROS 的來源途徑有陽光照射、線粒體呼吸作用、細胞代謝等，其中線粒體呼吸鏈是產(chǎn)生ROS 的主要來源途徑；而眼部的房水、小梁網(wǎng)、視網(wǎng)膜等部位中，廣泛地存在著SOD、CAT 等抗氧化成分[9]。生理情況下，促氧化與抗氧化系統(tǒng)共同維持眼組織細胞內(nèi)環(huán)境的平衡和小梁網(wǎng)、視網(wǎng)膜細胞的正常功能。一旦這個平衡被打破，過多的ROS 通過損傷小梁網(wǎng)、視乳頭及視網(wǎng)膜而導致眼壓升高、引起組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導致RGCs 凋亡[4]。一些青光眼臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)，在患者及動物模型血清、房水、小梁網(wǎng)、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)等部位存在各類氧化應(yīng)激標記物的異常改變，證實氧化應(yīng)激在青光眼發(fā)病中起重要作用[10]。

2.1 房水成分改變及小梁網(wǎng)損傷

氧化應(yīng)激導致房水中成分的改變是青光眼發(fā)病的原因之一。研究[3,11]發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性開角型青光眼（primary open-angle glaucoma,POAG） 患者房水中存在氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)物，如SOD、CAT、GPx，且房水中整體抗氧化狀態(tài)也明顯下降。同樣，在青光眼患者的小梁網(wǎng)組織、房水和外周血標本中，NO 的濃度升高并伴有MDA 及其他脂質(zhì)過氧化物增加，且8-OHdG的水平明顯高于對照標本[11-12]，提示青光眼患者前房內(nèi)及全身均存在氧化應(yīng)激損傷。

小梁網(wǎng)退行性改變也參與了青光眼的病理損害。POAG患者小梁網(wǎng)中的ROS 水平高于正常人[13]，ROS 水平與人類小梁網(wǎng)變性及隨后的眼壓升高和青光眼有關(guān)[8,13]，且小梁網(wǎng)中的氧化性DNA 損害與眼壓升高及視野缺損程度有顯著的相關(guān)性[3]。有研究[14]提示，大量的ROS 攻擊小梁網(wǎng)上皮細胞，造成小梁網(wǎng)細胞損傷及結(jié)構(gòu)改變而使房水流出受阻，眼壓升高。升高的眼壓也會作用于小梁網(wǎng)，破壞小梁網(wǎng)細胞，進一步影響眼壓，形成惡性循環(huán)。同時，小梁網(wǎng)細胞一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表達和活性均較正常人增加，NOS能導致小梁網(wǎng)組織內(nèi)過氧化亞硝酸鹽水平增加，進一步說明POAG 患者小梁網(wǎng)內(nèi)亦遭受氧化損傷[10]。因此，小梁網(wǎng)局部區(qū)域ROS 為最基本的致病因素，通過減弱局部的抗氧化活動，引起小梁網(wǎng)細胞損傷，導致眼壓升高，并可能最終導致RGCs 死亡。

2.2 視網(wǎng)膜、視神經(jīng)損傷

青光眼視網(wǎng)膜和視神經(jīng)損傷過程中氧化應(yīng)激也起了一定作用。Chrysostomou 等[15]證實，在青光眼患者的視神經(jīng)、房水和視網(wǎng)膜組織中，都存在ROS 含量明顯升高的現(xiàn)象。過量的ROS 可損傷視網(wǎng)膜及視神經(jīng)導致RGCs 凋亡。有學者[16]在急性高眼壓小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，高眼壓后數(shù)小時內(nèi)RGCs 即發(fā)生氧化損傷，說明氧化損傷在青光眼視神經(jīng)病變早期即產(chǎn)生了影響。在燒灼上鞏膜靜脈誘導的高眼壓大鼠模型中，視網(wǎng)膜表現(xiàn)出活性氧產(chǎn)生增多和脂質(zhì)過氧化物增加[17]。在實驗[18]誘導猴高眼壓模型中發(fā)現(xiàn)，其視網(wǎng)膜存在氧化損傷，包括抗氧化酶活性下降，光感受器外節(jié)蛋白、白蛋白以及具有抗氧化作用的鐵蛋白含量均明顯增加。這些改變可直接導致RGCs 的損傷甚至死亡，繼之引起一系列青光眼神經(jīng)受損改變。

在青光眼的發(fā)展過程中，最重要的病理改變是RGCs 的損傷，氧化應(yīng)激與此有關(guān)。在SOD1 基因敲除小鼠RGCs 中，ROS 表達增加，且RGCs 變性先于視網(wǎng)膜其他層的變性，說明RGCs 比其他神經(jīng)元更易受氧化應(yīng)激的影響[19]。過量的ROS在視網(wǎng)膜處對視神經(jīng)細胞造成氧化損傷，一方面可以通過Caspase 級聯(lián)的外源性凋亡而引起；另一方面可通過破壞線粒體功能致使RGCs 發(fā)生內(nèi)源性凋亡[15]。線粒體失調(diào)還可以反過來導致ROS 的產(chǎn)生增多，加重RGCs 及組織氧化損傷。因此，一旦線粒體功能紊亂，則會進一步生成ROS，形成惡性循環(huán)，導致ROS 倍增[15]。同時，眼壓升高還可以通過降低抗氧化酶 （包括SOD、GPX 和CAT） 的活性而引起RGCs 氧化應(yīng)激，并與RGCs 死亡有關(guān)[16]。此外，在青光眼視網(wǎng)膜中存在著硫氧還蛋白-1（thioredoxin-1，Trx-1）和硫氧還蛋白-2（thioredoxin-21，Trx-21）水平的下降，它們在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中起著關(guān)鍵作用，這些蛋白的過度表達有利于RGCs 生存[20]。

高眼壓會壓迫視網(wǎng)膜造成缺血、缺氧，使細胞代謝出現(xiàn)障礙，ROS 生成過多，引起氧化損傷，累及RGCs 并造成其凋亡[21]。除了缺血缺氧直接造成RGCs 損傷以外，缺血再灌注損傷也會加重氧化應(yīng)激誘導的RGCs 凋亡[22]。缺血、缺氧以及缺血再灌注損傷過程中，自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多并促進RGCs 凋亡。大量的自由基還可以激活N-甲基-D-天冬氨酸受體，使線粒體產(chǎn)生大量過氧化物，這些過氧化物與NO 結(jié)合，導致細胞凋亡。

組織低氧應(yīng)激也與氧化損傷所致RGCs 變性有關(guān)。低氧誘導因子-1α（hypoxic inducible facter 1α，HIF-1α）是一種O2調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活因子，可誘導多種轉(zhuǎn)錄因子的表達，包括促紅細胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、誘導型NOS 等，它們的蛋白質(zhì)產(chǎn)物增加可促進代謝以適應(yīng)缺氧。在H2O2誘導的氧化應(yīng)激損傷中，RGC-5細胞中HIF-1α 表達上調(diào)[23]。在RGCs 變性過程中，HIF-1α 在人青光眼中的表達更為明顯；HIF-1α 免疫應(yīng)答不僅存在于視神經(jīng)中，而且存在于青光眼的視網(wǎng)膜中，支持青光眼組織缺氧的發(fā)生。長期低氧暴露條件下，可誘導視網(wǎng)膜促凋亡信號分子p53 和Caspase 等的激活。這些表明，青光眼的低氧應(yīng)激參與氧化損傷導致RGCs 凋亡。

3 天然抗氧化藥物與青光眼視神經(jīng)保護

氧化應(yīng)激在青光眼的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，因此通過抗氧化劑抑制ROS 的生成、清除自由基、增強抗氧化防御系統(tǒng)的功能，可能對青光眼視神經(jīng)損害具有一定的保護作用。一些天然藥物及其提取物在實驗中證實具有較好的神經(jīng)保護效果，且能通過抑制氧化應(yīng)激有效抑制RGCs 凋亡；另一些具有抗氧化活性的藥物也有視神經(jīng)保護效果，理論上也可能是通過抗氧化損傷作用達到保護RGCs 的效果。

3.1 已發(fā)現(xiàn)通過抗氧化作用保護視神經(jīng)損傷的天然藥物

這類藥物不僅具有青光眼視神經(jīng)保護作用，而且已有實驗證實主要或部分通過抗氧化損傷作用抑制RGCs 凋亡的。目前發(fā)現(xiàn)的這類天然藥物主要有枸杞子、燈盞細辛、銀杏葉、川芎、丹參、剌蒺藜等中藥及其提取物。銀杏葉主要成分含有黃酮類和二萜內(nèi)酯化合物。大量研究[24]表明，銀杏葉及其提取物具有消除自由基，減輕氧化損傷的作用。在急、慢性高眼壓動物模型中，銀杏葉提取物能顯著提高RGCs 存活率，促進軸突再生，對抗高眼壓狀態(tài)下視網(wǎng)膜組織中產(chǎn)生的自由基的損害而抑制RGCs 凋亡，其作用機制可能與減少Ca2+內(nèi)流，提高基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達及抑制NOS，從而減少NO 合成等有關(guān)[25]。臨床研究[26]也提示，長期服用銀杏葉提取物可延緩正常眼壓性青光眼 （normal tension glaucoma，NTG）患者視野丟失。枸杞子主要成分枸杞多糖、類黃酮等均具有良好的抗氧化功能，可以提高抗氧化酶的活性，清除自由基，降低脂類、蛋白質(zhì)和DNA 過氧化物的產(chǎn)生，保護多種原因?qū)е碌腞GCs 損傷，提高RGCs 存活率[27]。同時，在H2O2誘導的RGCs 氧化應(yīng)激損傷模型中，枸杞多糖能降低細胞內(nèi)ROS 的水平，阻斷NOS 的合成，減少NO 的釋放，抑制RGCs 凋亡，對氧化應(yīng)激誘導的RGCs 損傷發(fā)揮保護作用[28]。

一些天然藥物活性成分也被證實可以保護氧化應(yīng)激誘導的青光眼視神經(jīng)損傷，如沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是從我國綠茶中提取的一種多酚成分，具有很強的抗氧化功效，是最強的自由基清除劑之一[29]。實驗[29]發(fā)現(xiàn)，EGCG 可以抑制慢性高眼壓模型大鼠RGCs 凋亡，對RGCs 具有神經(jīng)保護作用。在外源性ROS 造成RGCs損傷模型中，EGCG 可以明顯減少細胞內(nèi)ROS 的生成，緩解氧化應(yīng)激誘導的細胞凋亡[29]。同時，EGCG 還可以影響RGCs 軸突的發(fā)育，增加軸突絲狀足的數(shù)量，穩(wěn)定神經(jīng)元之間的鏈接和軸突生長方向[30]。花青素是一種廣泛存在于自然界植物中的多酚化合物，具有極強的抗氧化活性和自由基清除能力。原花青素可以提高急性高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性，降低MDA、NO，減輕視網(wǎng)膜組織水腫，減少RGCs 凋亡[31]。在H2O2誘導RGCs 氧化損傷過程中，花青素代謝產(chǎn)物原兒茶酸可以抑制RGCs 凋亡[32]。阿魏酸是當歸和川芎等中藥的水溶性單體成分，具有抗炎、抗氧化等作用。實驗[33]發(fā)現(xiàn)，阿魏酸能有效提高RGCs 活性，在線粒體水平對RGCs 代謝起雙相調(diào)節(jié)作用。在急、慢性高眼壓動物模型中，阿魏酸鈉能通過降低視網(wǎng)膜組織MDA 含量，提高SOD 活性，對高眼壓導致的視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷起一定的保護作用[34]。

3.2 可能通過抗氧化作用保護視神經(jīng)損傷的天然藥物

這類天然藥物及其活性成分具有顯著的抗氧化損傷作用，且能保護各類因素導致的RGCs 凋亡，理論上，這類藥物可能是通過抗氧化損傷作用保護高眼壓誘導的RGCs 凋亡。實驗[35]發(fā)現(xiàn)，這類天然藥物主要有姜黃素、紅景天苷、刺五加、金絲桃素、三七總苷、人參皂苷Rg1、苦參堿等。姜黃素是姜黃、莪術(shù)等姜黃屬植物的主要活性成分之一，現(xiàn)代研究[36]表明，姜黃素具有抗炎、抗氧化以及神經(jīng)保護等作用。在體內(nèi)外實驗中發(fā)現(xiàn)，姜黃素對星形孢菌素誘導的RGCs 凋亡具有抑制作用，機制可能與其抑制視網(wǎng)膜內(nèi)蛋白水解酶有關(guān)[36]。紅景天苷是紅景天的主要成分，具有神經(jīng)保護、抗氧化等多種作用。實驗[37]發(fā)現(xiàn)，在多種神經(jīng)退行性疾病中，紅景天苷可以較好的保護氧化應(yīng)激導致的神經(jīng)元損傷。在N-甲基-D-天（門）冬氨酸（n-methyl-d-aspartate，NMDA）誘導的谷氨酸興奮性毒性RGCs 損傷模型，紅景天苷可以呈劑量依懶性的抑制RGCs凋亡，具有視神經(jīng)保護作用[38]。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，在青光眼患者及實驗動物小梁網(wǎng)組織、房水、視網(wǎng)膜、視神經(jīng)以及外周血標本中，均發(fā)現(xiàn)大量氧化應(yīng)激及氧化損傷標志物，有力證明了氧化應(yīng)激在青光眼的發(fā)病及疾病進展過程中起著重要作用。急、慢性高眼壓、谷氨酸興奮性毒性、膠質(zhì)細胞活化等青光眼危險因素導致過量的ROS 在視網(wǎng)膜、小梁網(wǎng)等眼部組織聚集，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，并最終導致RGCs 凋亡。然而，氧化應(yīng)激在青光眼性視神經(jīng)病變中的分子機制還不是十分清楚，氧化應(yīng)激對青光眼發(fā)生發(fā)展的實際影響也還需要進一步闡明。

正是因為氧化應(yīng)激在青光眼發(fā)病機制中起著重要的作用，抗氧化治療顯然對青光眼視神經(jīng)保護具有潛在的重要意義。許多天然藥物、天然藥物提取物及其有效成分具有良好的抗氧化作用，通過研究其對RGCs 的保護作用，有助于闡明其作用機制，發(fā)揮中醫(yī)學在視神經(jīng)保護的優(yōu)勢。但目前多數(shù)抗氧化治療對青光眼視神經(jīng)損害的保護價值還停留在試驗階段，抗氧化治療的實際臨床價值還有待進一步驗證。